尤垂淮，唐莉娜，陳冬梅，陳順輝 ，黃錦文，周陽(yáng)，張重義，林文雄

1福建農(nóng)林大學(xué)農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所, 福州 350002;

2 福建農(nóng)林大學(xué)煙草研究所, 福州 350002；

3 福建省煙草專(zhuān)賣(mài)局煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所, 福州 350003

生物的生長(zhǎng)發(fā)育是基因的表達(dá)過(guò)程，蛋白質(zhì)是基因的表達(dá)產(chǎn)物，在蛋白質(zhì)組學(xué)水平上揭示生命現(xiàn)象的本質(zhì)和活動(dòng)規(guī)律，是現(xiàn)代分子生物學(xué)研究的熱點(diǎn)[1]。蛋白質(zhì)組是蛋白質(zhì)組學(xué)的研究對(duì)象，從整體蛋白質(zhì)水平上，從貼近生命本質(zhì)的層次上去發(fā)現(xiàn)和探索生命活動(dòng)的規(guī)律和重要的生理、病理現(xiàn)象等。煙草在生長(zhǎng)過(guò)程中，面臨很多病害的危害，如煙草根黑腐、根結(jié)線蟲(chóng)病、煙草黑脛病、煙草青枯病、黃瓜花葉病等侵染性病害，這些病害均與煙草的根系緊密相關(guān)，影響了煙草對(duì)土壤養(yǎng)分的吸收，使煙草產(chǎn)量變低，品質(zhì)下降，造成大量的經(jīng)濟(jì)損失，阻礙了煙草產(chǎn)業(yè)的進(jìn)一步發(fā)展。植物蛋白質(zhì)組水平因外界環(huán)境條件改變而產(chǎn)生變化，通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)，探討植物逆境下生理代謝變化，獲得蛋白質(zhì)與抗性之間的關(guān)系，有助于植物抗逆性的研究，并已在植物研究中取得了一定的成果[2]，本文的研究材料主要從根系差異蛋白著手，探討合理的以煙為主的的耕作制度，為攻克以上煙草各種根系病害提供理論基礎(chǔ)與技術(shù)支撐。

迄今，有關(guān)煙草根系在蛋白質(zhì)組學(xué)水平上的研究，在國(guó)內(nèi)外還很少報(bào)道，特別是南方耕作制度下，探討煙草根系差異蛋白質(zhì)組學(xué)甚少。本研究主要采用不同的養(yǎng)地方式，通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)手段，旨在蛋白質(zhì)組學(xué)水平上揭示不同養(yǎng)地方式下烤煙根系生長(zhǎng)情況，為尋求更加適合福建清香型煙葉生長(zhǎng)的耕作措施提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2007～2010年在南平浦城縣仙陽(yáng)烤煙試驗(yàn)站基地進(jìn)行，供試烤煙品種為K326。試驗(yàn)田地勢(shì)平坦，土壤質(zhì)地為砂壤土。試驗(yàn)田種植情況為：從2007年起，上半年（2007年3月～7月）種煙草，下半年（2007年7月～11月）種水稻。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)設(shè)三種養(yǎng)地方式，前處理均一致，即從2007年起，上半年（2007年3月-7月）種煙草，下半年（7月-11月）種水稻。而后采用不同養(yǎng)地方式（2007年11月-2008年3月）：WF為對(duì)照，冬閑；RS：稻草回田；AS：冬種紫云英，紫云英回田。試驗(yàn)采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)，共計(jì)9個(gè)小區(qū)。每個(gè)處理小區(qū)種5畦，每畦植煙44株，共220株，行株距1.2m×0.5m。田間管理都按規(guī)范化栽培措施進(jìn)行。2008年3月、2009年3月采用以上相同的養(yǎng)地方式連續(xù)兩次實(shí)行田間定位試驗(yàn)，在田間定位第4年即2010年，取樣進(jìn)行室內(nèi)實(shí)驗(yàn)。

1.3 取樣方法

本試驗(yàn)采取田間定位試驗(yàn)，即在2010年，烤煙旺長(zhǎng)后期時(shí)，挖取根系，用水洗凈后，甩干，用剪刀剪相同部位根系，用錫箔紙包住，迅速置于液氮中，之后一并保存到-80℃冰箱，備用。

1.4 試劑與儀器

丙烯酰胺（acrylamide, Acr）、N, N-甲叉丙烯酰胺（N,N-methylenebisacrylamide, Bis-Acr）、三羥甲基氨基甲烷(Tris aminomethane, Tris-base)、尿素(Urea)、十二烷基磺酸鈉(Sodium Dodecyl sulfate,SDS)、N,N,N',N'-四甲基二乙胺 (N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine, TEMED)、甘氨酸(Glycine)均為Sigma公司產(chǎn)品；載體兩性電解質(zhì)Ampholine(pH 3-10, pH 5-8)為GE Healthcare公司產(chǎn)品；硫脲(Thiourea)、3-[(3-膽酰胺丙基)-二乙胺]-丙磺酸(CHAPS)、壬基酚聚氧乙烯醚(NP- 40)、二硫蘇糖醇(dithiothreitol, DTT)、過(guò)硫酸銨(Ammonium persulfate, AP)、Tris平衡酚pH 8.0均為Solarbio公司產(chǎn)品；聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、三氯乙酸(TCA)、甘油(Glycerol)、磷酸、氫氧化鈉、無(wú)水乙醇、甲醇、無(wú)水乙酸鈉、無(wú)水碳酸鈉、硫代硫酸鈉、硝酸銀、冰乙酸、甲醛溶液等藥品及有機(jī)溶劑均為國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司產(chǎn)品。以上所有藥品、試劑都為分析純，所有溶液均用Milli-Q超純水配制。

主要儀器：高速冷凍離心機(jī)為德國(guó)Eppendorf公司產(chǎn)品；真空干燥機(jī)出自上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)為美國(guó)VARIAN公司產(chǎn)品；Protean IEF等電聚焦系統(tǒng)、SDS-PAGE垂直電泳均產(chǎn)自美國(guó)Bio-Rad公司；凝膠成像系統(tǒng)imagescan為瑞典GE Healthcare公司產(chǎn)品。

1.5 根系蛋白質(zhì)樣品的制備

稱(chēng)取5g根系，加入少許的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，在液氮冷凍條件下研磨至粉末，采用Mg-NP40法：參照Lee等[3]的方法并有所改進(jìn)，加入10 mL提取緩沖液（0.5mol/l Tris緩沖液pH8.3,2%V/V NP-40，20 mmol/L MgCl2，2%V/V B-巰基乙醇，1 mmol/L苯甲基磺酰氟（PMSF）），置冰上搖床振蕩5～10 min，置冰上超聲30 min。4℃，10000 rpm，離心30 min，取上清。加入3倍體積10% TCA（10%TCA，0.07% B-巰基乙醇，丙酮），置于-20℃冰箱過(guò)夜。多洗幾次，期間用80%丙酮（含0.07% B-巰基乙醇）洗1次，直至上清液澄清。最后4℃，11000 rpm，離心25 min，棄上清，低溫真空干燥，制成蛋白質(zhì)干粉，置于-80℃冰箱。

1.6 蛋白質(zhì)的裂解與濃度測(cè)定

1.6.1 蛋白質(zhì)的裂解

Mg-NP40法提取的根系蛋白質(zhì)與裂解液的比例為1mg:10μL。裂解液的配方：42%尿素，2 mol/L Thiourea，65 mmol/L DTT，4% CHAPS，0.2%兩性電解質(zhì)（3.5-10）。

1.6.2 蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定

根據(jù)Bradford[4]方法，用牛血清白蛋白制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，蛋白濃度為0-90 μg/μL，在λ=595 nm時(shí)，應(yīng)用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。

1.7 雙向電泳

第一向等電聚焦電泳（IEF）和SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳參照Lee[3]、王經(jīng)源[5]、吳林坤[6]等的方法，略有改進(jìn)下進(jìn)行的。

1.8 膠體染色與圖像的掃描分析

電泳結(jié)束后，采用硝酸銀染色方法染色[7]。膠片使用imagescan(GE Healthcare, Uppsala, Sweden)掃描，并用軟件ImageMasterTM 2D Platinum 5.0(GE Healthcare, Uppsala, Sweden)進(jìn)行圖像分析。

1.9 蛋白質(zhì)點(diǎn)膠內(nèi)酶解及肽段提取

1.9.1 脫銀

向取下的蛋白點(diǎn)加60 μL DD.H2O洗2-3次，10 min/次；加60 uL 100%乙腈，用漩渦振蕩器振蕩5 min，重復(fù)3次，脫水至膠粒完全變白，超凈臺(tái)吹干20～ 30 min。

1.9.2 膠內(nèi)消化

加入新鮮配制的10 mmol/L DTT（在990 μL 25 mmol/L NH4HCO3加入10 μL 1 mol/L DTT 配制）20 μL溶液，57℃孵育1 h；冷卻至室溫，用槍頭吸去殘留液。加入20 μL 55 mmol/L碘乙酰胺（55 μL 1 mol/L IAM，945 μL 25 mmol/L NH4HCO3現(xiàn)配）20 μL溶液，置于暗室 60 min。吸棄上清，用100 μL的移液器加入60 μL 100 mmol/L NH4HCO3溶液，用漩渦震蕩器震蕩混勻，室溫靜置5 min，如此重復(fù)1-3次；用移液器吸棄上清，加入60 μL乙腈，漩渦震蕩器震蕩混勻，室溫靜置5 min，重復(fù)1次；吸棄上清，加入60 μL 100 mmol/L NH4HCO3溶液，漩渦震蕩器震蕩混勻，室溫靜置5 min；接著棄上清，加入60 μL乙腈，漩渦震蕩器震蕩混勻，室溫靜置5 min，重復(fù)1次，超凈臺(tái)吹干，30 min。加入15μL消化液（12.5 ng/μL胰酶（50 mmol/L NH4HCO3配制）溶液），混勻，4℃或冰上放置30 min；用移液槍吸出多余的液體，接著加入10 μL 50mmol/L碳酸氫銨溶液，轉(zhuǎn)速6000 rpm離心30 s，37℃消化12 h。

2 質(zhì)譜分析

2.1 上樣

將其冷卻至室溫，轉(zhuǎn)速6000 rpm離心5 min，用移液槍收集消化液于一新1.5 mL離心管中；用20 mmol/L碳酸氫銨溶液補(bǔ)至溶液終體積為15-20 μL；將其轉(zhuǎn)移至上樣管；用于質(zhì)譜分析。

2.2 LC MS/MS分析

LC MS/MS分析是在福建農(nóng)林大學(xué)農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所進(jìn)行的。LC條件：高效液相色譜儀：Thermo Scientif i c Surveyor System；色譜柱：BioBasic C18 Column (100 x 0.18 mm，particle size: 5 um)；樣品量：10 μL；流動(dòng)相：A: 0.1%Formic acid in water；B: 0.1% Formic acid in acetonitrile；梯度：5% -35% B in 20 minutes, 35%-95% B in 2 minutes；流速：2.5 μL/min；MS條件：質(zhì)譜儀：LTQ-XL (Thermo Scientif i c)；噴霧電壓：3.5 kV；毛細(xì)管溫度：275 ℃；鞘氣流速：15 arb；母離子掃描范圍：400-2000 m/z；Isolation width：2 Da。二級(jí)質(zhì)譜條件：AGC Target 1e4, 1 microscans；碰撞能量：35% CID。

2.3 數(shù)據(jù)庫(kù)查詢(xún)及蛋白質(zhì)鑒定

質(zhì)譜分析所獲得的原始數(shù)據(jù)用Proteome Discoverer1.2軟件進(jìn)行相對(duì)定量分析及數(shù)據(jù)庫(kù)的檢索。搜索使用的數(shù)據(jù)庫(kù)為從NCBI下載的物種名稱(chēng)的物種名稱(chēng)（英文）.fasta蛋白庫(kù)。

3 結(jié)果

3.1 不同養(yǎng)地方式處理烤煙根系差異蛋白質(zhì)圖譜構(gòu)建

蛋白質(zhì)雙向凝膠電泳圖譜，如圖1，在等電點(diǎn)從3.5到10和分子量為14 KD到116 KD的范圍中，通過(guò)軟件ImageMaster5.0的分析，去除假點(diǎn)，每塊膠大概有430個(gè)點(diǎn)左右。圖譜清晰，蛋白質(zhì)點(diǎn)圓，蛋白質(zhì)點(diǎn)之間分離很好。

3.2 差異蛋白質(zhì)點(diǎn)的LC MS/MS分析與鑒定

當(dāng)對(duì)應(yīng)兩個(gè)蛋白點(diǎn)之間差異達(dá)到1.5倍以上，認(rèn)為表達(dá)量有顯著差異，在根系樣品中檢測(cè)到39差異點(diǎn)，對(duì)這39個(gè)差異蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行LC MS/MS分析和生物信息學(xué)查詢(xún)后得到24個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)的質(zhì)譜結(jié)果，22已知蛋白，2個(gè)未知蛋白，鑒定到的蛋白見(jiàn)表1。

通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)查找，根據(jù)蛋白的功能可以將鑒定到的22個(gè)蛋白分成六大類(lèi)：

3.2.1 與植物光合和營(yíng)養(yǎng)代謝相關(guān)蛋白

與植物光合作用相關(guān)蛋白1個(gè)，轉(zhuǎn)酮醇酶（spot2:transketolase）；與營(yíng)養(yǎng)相關(guān)蛋白1個(gè)，GDP-甘露糖-3',5'-表異構(gòu)酶（spot13:GDP-mannose 3',5'-epimerase, GME）。

3.2.2 與能量代謝相關(guān)蛋白

與能量相關(guān)蛋白有6個(gè)，NADP-依賴(lài)性的蘋(píng)果酸脫氫酶（spot4:NADP dependent malic enzyme) ,AAA型腺苷三磷酸酶屬蛋白（spot24:AAA-type ATPase family protein），液泡ATP合成酶催化亞基A（spot37:vacuolar ATP synthase catalytic subunit A），乙酰輔酶A合成酶（spot23:Acetyl-CoA synthetase，ACS），ATP酶（spot33:ATPase splayed），β-糖苷酶（spot5: beta-glycosidase-like）。

3.2.3 與物質(zhì)運(yùn)輸以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的蛋白

與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)蛋白有4個(gè)，激酶結(jié)合性蛋白磷 酸 酶（spot12:kinase-associated protein phosphatase，KAPP），假定的轉(zhuǎn)座子蛋白（spot36:transposon protein,putative），富亮氨酸重復(fù)蛋白激酶（spot39:leucine-rich repeat protein kinase-like protein,LRR-RLK），促分裂原活化蛋白激酶（spot26:Mitogen-activated protein kinase kinase，MAPK）。與物質(zhì)運(yùn)輸相關(guān)的蛋白有2個(gè)，Rab3 GTP激活蛋白催化亞基（spot10:Rab3 GTPaseactivating protein catalytic subunit），細(xì)胞內(nèi)囊泡運(yùn)輸?shù)鞍譙ly1（spot35:Vesicle traff i cking protein Sly1）。

3.2.4 與核酸代謝相關(guān)蛋白

與核酸代謝相關(guān)蛋白有3個(gè)，核糖體小亞基蛋白4（spot20：ribosomal protein small subunit 4），RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄延伸因子（spot30:RNA polymerase II transcription elongation factor SPT5），類(lèi)成熟酶蛋白（spot31:maturase-like protein）。

3.2.5 與蛋白質(zhì)代謝相關(guān)蛋白

天冬氨酸蛋白酶家族蛋白（spot14:Aspartyl protease family protein），E3泛素蛋白連接酶BAH1（spot18:E3 ubiquitin-protein ligase BAH1），水解酶包含域蛋白（spot7:alpha/beta- hydrolase domain-containing protein）。

3.2.6 與植物抗逆相關(guān)的蛋白

防御蛋白R(shí)GA2（spot21:resistance protein RGA2），線粒體內(nèi)膜移位酶亞基Tim13（spot25：Tim13/mitochondrial import inner membrane translocase subunit Tim13）。

圖1 不同養(yǎng)地方式烤煙根系蛋白圖譜

表1 不同養(yǎng)地方式下烤煙根系差異蛋白LC MS/MS質(zhì)譜分析結(jié)果

（續(xù)表1）

4 討論

差異蛋白質(zhì)組學(xué)應(yīng)用于植物或作物科學(xué)相關(guān)的分子機(jī)制研究日益增多，且從分子水平較好地解釋了植物自身遺傳表達(dá)或?qū)Νh(huán)境響應(yīng)的分子機(jī)理[8]。本研究運(yùn)用差異蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在蛋白質(zhì)水平上初步探討不同養(yǎng)地方式下煙草根系的蛋白表達(dá)譜的變化。

4.1 香氣形成

通過(guò)在冬季進(jìn)行不同的處理，分別是冬閑，稻草回田，紫云英回田三種養(yǎng)地方式，根系差異蛋白質(zhì)結(jié)果鑒定到了兩個(gè)與香氣有關(guān)的蛋白，轉(zhuǎn)酮醇酶（spot2:transketolase）和GDP-甘露糖-3',5'-表異構(gòu)酶（spot13:GDP-mannose 3',5'-epimerase, GME）。轉(zhuǎn)酮醇酶是在戊糖磷酸循環(huán)以及光合成的還原型戊糖磷酸循環(huán)中起著重要作用的酶，在植物光合作用的卡爾文循環(huán)中起著核心作用，它的活性是植物最大光合速率的限制因子，其活性的微小下降即可導(dǎo)致植物生長(zhǎng)速度下降、芳香族氨基酸和苯丙氨酸代謝產(chǎn)物的抑制[9]。芳香族氨基酸是煙草香氣的主要物質(zhì)，苯丙氨酸代謝途徑是影響煙草香味的主要次生代謝途徑。GDP-甘露糖-3',5'-表異構(gòu)酶可以催化GDP-甘露糖轉(zhuǎn)化為左旋GDP-半乳糖，該反應(yīng)對(duì)于高等植物體內(nèi)抗壞血酸的合成是非常重要的[10]。多酚是煙草中的一類(lèi)重要物質(zhì)，在煙草的顏色、香氣、吸味和煙氣安全性方面都有重要影響，而抗壞血酸能夠增強(qiáng)多酚類(lèi)化合物穩(wěn)定性，抑制其氧化的作用。這兩個(gè)酶在稻草回田的養(yǎng)地方式中均上調(diào)表達(dá)，而在紫云英回田處理上卻下調(diào)表達(dá)，在一定程度上說(shuō)明稻草回田的烤煙品質(zhì)較好，冬閑的次之，紫云英回田的最差，主要原因可能是在施肥處于相同水平下，紫云英回田處理下田間氮肥較多，不利于煙葉成熟，最后可能影響品質(zhì)。

4.2 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)

這三種養(yǎng)地方式下，鑒定到4個(gè)與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的蛋白，激酶結(jié)合性蛋白磷酸酶（spot12:kinaseassociated protein phosphatase,KAPP），假定的轉(zhuǎn)座子蛋白（spot36:transposon protein, putative, Mutator subclass），富亮氨酸重復(fù)蛋白激酶（spot39:leucine-rich repeat protein kinase-like protein,LRR-RLK）， 促 分裂原活化蛋白激酶（spot26:Mitogen-activated protein kinase kinase,MAPK）。激酶結(jié)合性蛋白磷酸酶屬于信號(hào)蛋白，擬南芥的KAPP可以通過(guò)其自身的FHA域?qū)︻?lèi)受體蛋白激酶信號(hào)路徑進(jìn)行負(fù)調(diào)控，這在植物的發(fā)育中尤為重要[11]。富亮氨酸重復(fù)蛋白激酶，參與植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[12]。促分裂原活化蛋白激酶(MAPK) 是生物體內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑MAPK 級(jí)聯(lián)反應(yīng)的重要組分，通過(guò)傳遞胞內(nèi)外信號(hào)，介導(dǎo)生物及非生物脅迫反應(yīng)、激素反應(yīng)、調(diào)控細(xì)胞分化育過(guò)程[13]，在ABA 的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中MAPK發(fā)揮了重要作用。這些酶的上調(diào)，促進(jìn)煙草的生長(zhǎng)發(fā)育，前面三個(gè)酶在稻草回田下是上調(diào)表達(dá)，而促分裂原活化蛋白激酶在紫云英上是上調(diào)表，在冬閑上，這四個(gè)酶均下調(diào)表達(dá)。

4.3 物質(zhì)運(yùn)輸

與物質(zhì)運(yùn)輸相關(guān)的蛋白有2個(gè)，Rab3 GTP激活蛋白催化亞基（spot10:Rab3 GTPase-activating protein catalytic subunit），細(xì)胞內(nèi)囊泡運(yùn)輸?shù)鞍譙ly1（spot35:Vesicle trafficking protein Sly1 (Sec1 family)(ISS)），這兩個(gè)蛋白均在細(xì)胞囊泡起作用，前者是細(xì)胞囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)途徑的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，同時(shí)參與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，后者在細(xì)胞內(nèi)囊泡參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體之間的運(yùn)輸，兩者在紫云英上均上調(diào)表達(dá)，細(xì)胞內(nèi)囊泡運(yùn)輸?shù)鞍譙ly1在稻草回田處理也是上調(diào)表達(dá)，促進(jìn)代謝順利進(jìn)行，促進(jìn)煙草的生長(zhǎng)。

4.4 代謝相關(guān)蛋白

與蛋白質(zhì)代謝相關(guān)蛋白3個(gè)，天冬氨酸蛋白酶家族蛋白（spot14:Aspartyl protease family protein），E3泛素蛋白連接酶BAH1（spot18:E3 ubiquitin-protein ligase BAH1），水解酶包含域蛋白（spot7:alpha/betahydrolase domain-containing protein）。植物天冬氨酸蛋白酶主要參與植物蛋白的加工、降解過(guò)程，在植物衰老、脅迫應(yīng)激反應(yīng)、程序性細(xì)胞死亡和細(xì)胞繁殖等方面起作用[14]。蛋白質(zhì)的泛素化作為真核生物蛋白質(zhì)降解的重要機(jī)制對(duì)許多重要的生物進(jìn)程如細(xì)胞周期、基因轉(zhuǎn)錄和細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等是至關(guān)重要的，E3泛素連接酶負(fù)責(zé)確定蛋白質(zhì)泛素化的特異性，識(shí)別靶蛋白底物，并在引發(fā)26S的蛋白酶體降解蛋白質(zhì)的過(guò)程中起極其重要的作用[15-16]。天冬氨酸蛋白酶家族蛋白和E3泛素蛋白連接酶BAH1在稻草回田上調(diào)表達(dá)，E3泛素蛋白連接酶BAH1和水解酶包含域蛋白在紫云英上是上調(diào)表達(dá)，在一定程度上均維持了煙葉的正常生長(zhǎng)，而在冬閑上這三個(gè)酶均下調(diào)表達(dá)，冬閑下生長(zhǎng)較弱。

5 結(jié)論

稻草回田處理下，鑒定到烤煙根系轉(zhuǎn)酮醇酶、GDP-甘露糖-3',5'-表異構(gòu)酶、乙酰輔酶A合成酶、β-糖苷酶、激酶結(jié)合性蛋白磷酸酶（KAPP），假定的轉(zhuǎn)座子蛋白，富亮氨酸重復(fù)蛋白激酶、細(xì)胞內(nèi)囊泡運(yùn)輸?shù)鞍譙ly1、天冬氨酸蛋白酶家族蛋白，E3泛素蛋白連接酶BAH1、線粒體內(nèi)膜移位酶亞基Tim13等蛋白，涉及煙草香氣的形成、能量轉(zhuǎn)化、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、物質(zhì)運(yùn)輸、代謝等多種途徑，在稻草回田下均上調(diào)表達(dá)，有此可以看出稻草回田處理為煙草的生長(zhǎng)提供了相對(duì)穩(wěn)定的環(huán)境，促進(jìn)根系生長(zhǎng)，進(jìn)而促進(jìn)煙草生長(zhǎng)，有助于提高煙草的產(chǎn)量和品質(zhì)，提高經(jīng)濟(jì)效益，為福建清香型煙葉的發(fā)展提供了較佳的耕作措施。在施肥處于相同水平下，紫云英回田處理下田間氮肥較多，與生長(zhǎng)相關(guān)的蛋白大部分上調(diào)表達(dá)，煙草生長(zhǎng)旺盛，鑒定到涉及煙草香氣形成相關(guān)的轉(zhuǎn)酮醇酶、GDP-甘露糖-3',5'-表異構(gòu)酶下調(diào)表達(dá)，而此時(shí)煙草正處于旺長(zhǎng)后期即成熟初期，結(jié)合大田長(zhǎng)勢(shì)，健壯濃綠，不利于煙葉后期落黃成熟，進(jìn)而影響烤煙品質(zhì)。對(duì)于紫云英處理，在控制相同氮肥水平即減少紫云英回田的量或者減少氮肥的施用，有待后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討。

[1] Huang L J,Wang J H. The new progress in the technology of proteome research [J].Bulletin of Biology,2005,40(8):4-6.

[2] Fang H Y, Cui N, Shao M N, et al. Advances on Proteomics of Plants Under Stresses [J]. Biotechnology Bulletin, 2009,10:15-19,25.

[3] Lee D G, Ahsan N, Lee S H, et al. An approach to identify cold-induced low-abundant proteins in rice leaf[J].C R Biol, 2007,330(3):215-225.

[4] Bradford M M. A rapid and sensitive method for the quantization of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding[J].Anal Biochem,1976,72:248-254.

[5] 王經(jīng)源,陳舒奕,梁義元,等.ISO-DALT雙向電泳方法的化與改進(jìn)[J].福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào), 2006,35(2):187-190.

[6] 吳林坤,王海斌,尤垂淮,等. 地黃塊根總蛋白質(zhì)提取及雙向電泳條件優(yōu)化[J].中國(guó)中藥雜志,2011,36(8):984-987.

[7] Blum H, Beiers H, Gross H J. Improved silver staining of plant proteins, RNA and DNA in polyacrylamide gels[J].Electrophoresis,1987, 8(2):93-99.

[8] 林茂茲,張志興,林爭(zhēng)春,等.太子參連作障礙蛋白差異表達(dá)分析[J].草業(yè)學(xué)報(bào),2010,19(6): 197-207.

[9] 王霞,楊鐵釗,殷全玉,等.影響煙草香味的主要次生代謝途徑及其研究進(jìn)展[J].中國(guó)煙草科學(xué),2008,29(1):47-50.

[10] DU Ying, YAO Yuan, LIU Jin-Yuan. Molecular Characterization of Two Rice cDNAs Encoding G D P-M a n n o s e-3',5'-E p i m e r a s e a n d T h e i r Expression Patterns[J].Progress in Biochemistry and Biophysics,2006,33(4):368-376.

[11] 吳韋銣,朱利泉,李成瓊,等.甘藍(lán)KAPP編碼基因的克隆與序列分析[J].作物學(xué)報(bào), 2010,36(7):1067-1074.

[12] 查笑君,馬伯軍,潘建偉,等.植物富亮氨酸重復(fù)類(lèi)受體蛋白激酶的研究進(jìn)展[J].浙江師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2010,33(1):7-12.

[13] 畢佳佳,梁衛(wèi)紅.水稻促分裂原活化蛋白激酶家族的研究進(jìn)展[J].熱帶亞熱帶植物學(xué)報(bào), 2009,17(5):514-518.

[14] Simes I, Faro C. Structure and function of plant aspartic proteinases[J].European Journal of Biochemist ry,2004,271:2067-2075.

[15] Hershko A. Ubiquitin: roles in protein modif i cation and breakdown.Cell,1983,34 (1):11-12.

[16] Ciechanover A, Orian A, Schwartz A L. The ubiquitinmediated proteolytic pathway: mode of action and clinical implications [J]. J Cell Biochem, 2000,77(S34):40-51.