王霄龍 ，楊永霞，張松濤，馮琦，王晶，武東玲，崔紅

河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院 ，煙草行業(yè)栽培重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，鄭州市文化路 95 號(hào) 450002

煙草葉面腺毛豐富且具有較強(qiáng)的分泌能力[1]，腺毛分泌物不僅對(duì)煙株抗性具有積極作用，與煙葉香氣品質(zhì)和風(fēng)味形成也密切相關(guān)[2]。因而，關(guān)于煙草腺毛生長(zhǎng)發(fā)育、分泌及其與煙葉品質(zhì)關(guān)系的研究頗受關(guān)注。Severson等[3]報(bào)道，氮供給、水分脅迫、機(jī)械傷害、光強(qiáng)和光質(zhì)以及栽培措施都會(huì)對(duì)葉面分泌物的含量和組分產(chǎn)生影響。Heemann等[4]曾報(bào)道，分別種植在美國(guó)北卡羅來納州Oxford和Tifton兩地區(qū)的煙草品種NC2326，其腺毛分泌物中西柏三烯二醇含量相差3～4倍，而非腺毛產(chǎn)生的烴類含量差異很小。高致明等報(bào)道我國(guó)云南香料煙腺毛密度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于新疆香料煙，煙葉的質(zhì)量風(fēng)格也有很大不同[5]。由此推測(cè)，在特定生態(tài)區(qū),由于環(huán)境因子的綜合作用，葉面腺毛發(fā)育及物質(zhì)分泌具有其特定特點(diǎn)，進(jìn)而影響煙葉質(zhì)量及風(fēng)格。

我國(guó)地域遼闊，生態(tài)環(huán)境復(fù)雜，形成了以濃香型、清香型和中間香型為代表的不同烤煙類型[6]。貴州遵義為中間香型烤煙的典型產(chǎn)區(qū)，所產(chǎn)烤煙煙氣細(xì)膩較柔和、較濕潤(rùn)，雜氣輕、刺激輕微，余味干凈較舒適，是中式卷煙的重要原料[7-8]。關(guān)于中間香型煙葉香氣風(fēng)格的形成機(jī)理研究多集中在葉片發(fā)育規(guī)律、物質(zhì)代謝規(guī)律等方面，而腺毛作為葉面化學(xué)物質(zhì)的主要來源部位，研究相對(duì)較少。本文以貴州遵義煙區(qū)烤煙品種K326為材料，采用顯微觀察、GC/MS技術(shù)及RT-PCR技術(shù)，對(duì)葉片發(fā)育過程中葉面腺毛形態(tài)結(jié)構(gòu)、分泌物含量及分泌物合成相關(guān)基因表達(dá)進(jìn)行了系統(tǒng)研究，旨在探索貴州煙葉葉片腺毛發(fā)育和物質(zhì)分泌的特點(diǎn)，為中間香型烤煙風(fēng)格形成機(jī)理研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

烤煙品種K326種植在貴州省遵義縣鴨溪鎮(zhèn)試驗(yàn)基地。2011年5月5日移栽，試驗(yàn)地土壤肥力中等，行距100 cm，株距50 cm，按當(dāng)?shù)乜緹熒a(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行正常栽培管理。于煙株返苗后，挑選生長(zhǎng)發(fā)育較為均勻一致的煙株300棵，分別掛牌標(biāo)記，并按照葉齡順序取樣（第十片葉長(zhǎng)度達(dá)到5 cm時(shí)定為第1天）。

1.2 方法

1.2.1 腺毛形態(tài)觀察

從葉尖向葉基數(shù)第6至8條支脈間，主脈至右側(cè)葉緣之間的中央位置[9]，每樣取5份作為重復(fù)取樣，4 % 戊二醛（磷酸緩沖液pH=7.2）固定 ，經(jīng)脫水、置換、干燥、粘樣、噴鍍等過程后，使用Ouanta 200掃描電鏡（美國(guó)FEI公司制造）觀察并拍照記錄，采用氣體二次電子成像；工作電壓15～20 kV，工作距離14.5～20 mm。腺毛密度統(tǒng)計(jì)時(shí)選取5個(gè)視野作為重復(fù)，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.2 葉面化學(xué)分析

葉面分泌物采用圓片法[10]。分別在葉基部和葉中部于主脈兩側(cè)對(duì)稱位置及葉尖沿主脈位置切取直徑為10 cm的圓片共15片，將圓片在1000 mL萃取溶劑中依次浸提2 s，重復(fù)3次后加入含正十七烷醇和蔗糖八乙酸酯的內(nèi)標(biāo)1 mL，得到的浸提液分別經(jīng)過過濾、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮、氮吹儀吹干、硅烷化處理后采用氣質(zhì)聯(lián)用分析儀并通過檢索譜庫(kù)（NIST08）確定成分。

GC條件：色譜柱為DB-5MSUI石英毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；進(jìn)樣口溫度為250 ℃；程序升溫：40 ℃保持2 min，然后以6 ℃/min升溫至180 ℃保持2 min，以2 ℃/min升溫至280 ℃保持20 min；載氣為高純氦氣，載氣流速為恒流0.8 mL/min；進(jìn)樣量為1.0 μL，分流比為15:1。

MS條件：傳輸線溫度為250℃；EI離子源溫度為280℃；電離能量為70 eV；質(zhì)量數(shù)范圍在50～650 amu之間。

通過保留時(shí)間定性物質(zhì)，后積分各物質(zhì)對(duì)應(yīng)峰曲線與基線的面積，得出具體數(shù)值，各種物質(zhì)數(shù)據(jù)經(jīng)過單位換算之后與參試葉片面積之比，即為單位面積葉片表面分泌物之值。

葉面積采用肖強(qiáng)等[11]的方法用數(shù)碼相機(jī)采集圖像后分析得出結(jié)果。由于葉齡10 d及20 d的葉片面積較小，故采用總面積相近的整葉替代圓片（面積差異小于5 %）。

1.2.3 RT-PCR分析

選取生長(zhǎng)發(fā)育良好的中部葉，按葉齡取樣，液氮凍保。每次取樣將來源于不同煙株的三片葉混合以減少試驗(yàn)誤差。按照Invitrogen Trizol Reagent說明書提供方法提取煙草總RNA，樣品通過隨機(jī)引物法反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。采用Premier Prime 5.0軟件，根據(jù)Genbank發(fā)布的CYC-1、CYP71D16和L25序列設(shè)計(jì)各基因擴(kuò)增引物(表1)，進(jìn)行RT-PCR。其中L25是煙草核糖體蛋白[12]，本研究中作為內(nèi)參基因。

表1 擴(kuò)增引物序列

PCR反應(yīng)體系為20 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min；94℃ 30 s變性，50℃ 30 s退火，72 ℃1 min延伸，共33個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 腺毛形態(tài)結(jié)構(gòu)及發(fā)育過程觀察

利用顯微技術(shù)對(duì)葉片發(fā)育過程中葉面腺毛進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)腺毛密度、形態(tài)結(jié)構(gòu)隨著葉片發(fā)育過程呈現(xiàn)規(guī)律性變化。圖1顯示葉齡10 d時(shí)腺毛密度達(dá)到最高，隨后急劇下降。這可能是由于葉片進(jìn)入快速生長(zhǎng)期，葉面積迅速擴(kuò)展而引起；從20 d到40 d腺毛密度呈平緩下降的趨勢(shì)，而在葉齡50 d時(shí)又有明顯的下降。

圖1 不同時(shí)期腺毛密度變化趨勢(shì)

對(duì)葉齡10 d和50 d的葉片進(jìn)行掃描電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)K326葉面腺毛主要由長(zhǎng)柄多腺頭腺毛組成。在葉齡10 d時(shí)，腺毛密度濃密，腺頭細(xì)胞主要由1～2個(gè)細(xì)胞組成；而且大量新生腺毛不斷發(fā)生（圖2-A1,A3）。說明該時(shí)期是腺毛分化、形成的重要時(shí)期。在葉齡50 d 時(shí)，腺毛密度明顯降低，而且不再有新生腺毛的發(fā)生；腺頭由多個(gè)細(xì)胞組成，并開始皺縮、脫落，推測(cè)腺毛進(jìn)入成熟、衰老階段（圖2-A2,A4）。

圖2 腺毛形態(tài)結(jié)構(gòu)及發(fā)育過程觀察

2.2 葉面化學(xué)分析

采用葉圓片法提取葉面分泌物，利用GC/MS共檢測(cè)出物質(zhì)成分47種，包括未知成分12種；已知成分35種。其中，西柏烷類化合物是腺毛特異分泌的主要成分，另外也檢測(cè)到烷烴，蔗糖酯等物質(zhì)，見圖3。

圖3 不同葉齡色譜分析圖

圖4 腺毛分泌物西柏三烯二醇和西柏三烯一醇含量

圖4顯示葉片發(fā)育過程中西柏烷類化合物含量的變化趨勢(shì)。可以看出：西柏三烯二醇含量較高，西柏三烯一醇含量較低。二者都呈現(xiàn)出先上升，后下降，再上升的趨勢(shì)。而且，在葉齡20 d時(shí)都出現(xiàn)一個(gè)峰值，隨后逐漸降低，40 d后開始緩慢上升，并在70 d時(shí)達(dá)到最大值。

2.3 西柏烷化合物合成關(guān)鍵基因的表達(dá)分析

由于西柏烷類化合物只在腺毛中合成[13]，故以葉片總RNA為模板進(jìn)行RT-PCR分析，亦能反映出腺毛中該基因的表達(dá)規(guī)律。

西柏三烯一醇合成酶（cembratriene-ol synthase，CYC-1）是將牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸轉(zhuǎn)化為西柏三烯一醇的關(guān)鍵酶[14]；西柏三烯一醇羥化酶（cembratriene-ol hydroxylase，CYP71D16），則催化西柏三烯一醇向西柏三烯二醇轉(zhuǎn)化[15]。二者都是西柏烷類化合物合成的關(guān)鍵酶，與腺毛的物質(zhì)代謝和分泌密切相關(guān)。以L25基因?yàn)閮?nèi)參，對(duì)葉片發(fā)育過程中這兩個(gè)基因進(jìn)行表達(dá)分析，結(jié)果如圖5所示?？梢钥闯觯瑑苫虻谋磉_(dá)趨勢(shì)有一定協(xié)同性，都在葉齡20 d、40 d和70 d時(shí)表達(dá)較強(qiáng)，這與腺毛分泌物中西柏烷類化合物的含量變化趨勢(shì)一致，說明CYC-1和CYP71D16是調(diào)控西柏烷類化合物合成的關(guān)鍵基因，其表達(dá)強(qiáng)度強(qiáng)烈影響西柏烷類化合物的含量。

圖5 不同葉齡腺毛類萜代謝關(guān)鍵基因半定量表達(dá)分析

3 討論

從腺毛形態(tài)學(xué)來看，貴州遵義地區(qū)烤煙品種K326葉面腺毛以長(zhǎng)柄腺毛為主，這與河南種植的K326相同(見后續(xù)報(bào)道)，表明生態(tài)環(huán)境對(duì)腺毛的類型影響不大。腺毛密度在20 d前變化明顯，之后緩慢減少，這可能是由于煙株進(jìn)入成熟階段，腺毛不再發(fā)生，成熟腺毛開始脫落而造成，這與時(shí)向東等[9]的報(bào)道一致?；瘜W(xué)分析結(jié)果表明，遵義地區(qū) K326葉面化學(xué)成分中西柏烷類化合物占據(jù)絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，這與史宏志等[16]的研究結(jié)果一致，表明不同生態(tài)環(huán)境中葉面分泌物保持一定的穩(wěn)定性。但檢測(cè)結(jié)果中發(fā)現(xiàn)了許多未知物質(zhì)，不排除中間香型煙葉葉面分泌物中具有其獨(dú)特成分，而這需要不同香型煙葉葉面化學(xué)的比較研究結(jié)果支持。

在葉片發(fā)育過程中，西柏三烯一醇和西柏三烯二醇含量變化及其基因表達(dá)規(guī)律呈現(xiàn)高度一致，并在葉齡20 d時(shí)出現(xiàn)一個(gè)積累高峰。這可能是由于20 d后腺毛密度的急劇下降所造成。隨著葉片形態(tài)發(fā)育的完成，腺毛密度逐漸穩(wěn)定，葉面分泌物逐漸積累并在成熟采收前達(dá)到最高值，這與楊鐵釗等[17]的研究結(jié)果基本相同。從CYC-1和CYP71D16的表達(dá)規(guī)律來看，二者之間有緊密的協(xié)同性，變化趨勢(shì)與腺毛分泌物中西柏烷類化合物的含量變化趨勢(shì)一致。這說明其表達(dá)水平與代謝物質(zhì)含量密切相關(guān)。

即使是在只有1～2個(gè)腺頭細(xì)胞的不成熟腺毛中，西柏烷類化合物的合成和分泌也在活躍進(jìn)行，葉面化學(xué)成分檢測(cè)和基因表達(dá)強(qiáng)度均在20 d、40 d和70 d出現(xiàn)顯著增強(qiáng)，推測(cè)認(rèn)為CYC-1和CYP71D16的表達(dá)水平與代謝物質(zhì)含量密切相關(guān)。

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