李巧梅，王清，于倩，吳惠豐，由麗萍，趙建民

（1.中國科學(xué)院煙臺(tái)海岸帶研究所 海岸帶環(huán)境過程與生態(tài)修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 煙臺(tái)264003；2. 中國科學(xué)院大學(xué) 北京 100049）

砷（As） 在自然界中普遍存在，它既有金屬性又有非金屬性，是一種毒性較高的污染物。近年來，砷礦的開采和熔煉、含砷農(nóng)藥的使用以及用砷化物作原料的工礦企業(yè)“三廢”的排放，使得環(huán)境中砷污染日趨嚴(yán)重。目前，我國近岸海域環(huán)境中砷污染狀況也較為嚴(yán)峻。據(jù)《中國海洋環(huán)境質(zhì)量公報(bào)》，2007年至2010年期間，我國主要河流的砷入海排污量分別達(dá)到6 000 t、6 183 t、3 918 t 和3 137 t；雖然總體趨勢有所降低，但局部海域的砷污染現(xiàn)象仍非常嚴(yán)重（張麗旭等，2005；任景玲等，2009）。海水中的砷通常以可溶的無機(jī)態(tài)形式存在，另有極微量的來源于海洋生物的有機(jī)砷；因此，海水中的砷毒性通常較強(qiáng)（Neff，1997）。目前，國內(nèi)外的研究主要關(guān)注砷的富集作用及水產(chǎn)品中砷殘留對(duì)人類健康的潛在危害，而海灣或河口地區(qū)較高濃度的砷污染對(duì)海洋生物的毒害作用卻少有報(bào)道。

紫貽貝作為典型的海洋環(huán)境指示生物，具有移動(dòng)性差和濾食性等特點(diǎn)，易遭受環(huán)境污染的暴露。例如，大連灣紫貽貝的無機(jī)砷平均殘留量達(dá)到1.11 mg/kg（劉廣遠(yuǎn)等，1996），閩南沿海紫貽貝總砷含量介于3.7～14.0 mg/kg，無機(jī)砷在0.64～1.16 mg/kg 之間（鐘碩良等，2005）。此外，國內(nèi)外多項(xiàng)研究表明，紫貽貝可高度富集海水中的砷，且其富集程度顯著高于多數(shù)海洋生物（張少娜等，2004；Slejkovee，1996；Szefer，2004）。因此，開展砷對(duì)紫貽貝的生態(tài)毒理效應(yīng)研究具有較為重要的意義。

本研究通過亞砷酸鈉亞慢性暴露紫貽貝，分別測定鰓和肝胰腺組織抗氧化指標(biāo)的變化，探討As（Ⅲ） 暴露對(duì)紫貽貝抗氧化能力的影響。研究結(jié)果可為深入了解砷在海洋貝類體內(nèi)的毒性作用機(jī)制提供參考，并可為我國近海砷污染的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和治理決策提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑

紫貽貝購自當(dāng)?shù)厮a(chǎn)市場，馴養(yǎng)一周后開始正式實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)期間保持連續(xù)充氣，海水溫度控制在20±1 ℃，定時(shí)定量投喂扁藻和三角褐指藻。每天換水一次，換水后重新添加相應(yīng)濃度的As（Ⅲ）。

亞砷酸鈉（NaAsO2） 購自國藥集團(tuán)，為分析純制品。配制成5 mg/L 母液后，按實(shí)驗(yàn)暴露濃度進(jìn)行相應(yīng)稀釋。SOD、GST、CAT 活性及GSH、MDA 含量的測定采用南京建成生物研究所試劑盒進(jìn)行。

1.2 暴露實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)設(shè)置包括1 個(gè)對(duì)照組和3 個(gè)處理組，處理組分別采用1、10、100 μg/L （NaAsO2） 進(jìn)行暴露，對(duì)照組未進(jìn)行任何處理。每個(gè)處理組設(shè)置3 個(gè)重復(fù)。暴露30 天后取樣，每個(gè)處理組隨機(jī)選取6個(gè)紫貽貝分別采集肝胰腺和鰓組織，置于液氮凍存，用于后續(xù)SOD、CAT、GST 活性及GSH、MDA 含量的測定。

1.3 抗氧化指標(biāo)的測定

取凍存樣品，加入9 倍體積的Tris-HCl 緩沖液（0.01 M Tris-HCl，0.1 M EDTA-2Na，0.01 M 蔗糖，8 g/L NaCl，pH 7.4），采用IKA 勻漿機(jī)完全均質(zhì)化（12 000 r/m 勻漿兩次，10 s/次）；組織勻漿液經(jīng)4 ℃，1 000×g 離心10 min 收集上清液。勻漿液的蛋白濃度采用考馬斯亮蘭法測定（Bradford et al，1976），以牛血清蛋白制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

SOD、CAT、GST 活性及MDA、GSH 含量的測定采用南京建成生物研究所試劑盒，參照試劑盒說明書操作。其中，SOD、CAT 和GST 活性單位為U/mg 蛋白，MDA 含量單位為nM/mg 蛋白，GSH 含量單位為mg/g 蛋白。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（Mean±S.D.）。使用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)軟件在P=0.05 的置信水平對(duì)上述抗氧化指標(biāo)進(jìn)行單因素方差分析，并采用Origin 8.0 軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 As（Ⅲ） 暴露對(duì)紫貽貝肝胰腺抗氧化指標(biāo)的影響

采用As（Ⅲ） 進(jìn)行亞慢性暴露時(shí)，低（1 μg/L）、中（10 μg/L） 劑量暴露組紫貽貝肝胰腺中的CAT（圖1A）、SOD（圖1B）、GST（圖1D） 活性以及GSH 含量（圖1C） 均較對(duì)照組水平有所增加，但并無顯著差異（P ＞0.05）；高劑量暴露組（100 μg/L）肝胰腺M(fèi)DA 的含量（圖1E） 較對(duì)照組顯著升高（P ＜0.05），而中、低劑量組（1 μg/L 和10 μg/L）較對(duì)照組水平無顯著變化。

2.2 As（Ⅲ） 暴露對(duì)紫貽貝鰓組織抗氧化指標(biāo)的影響

As（Ⅲ） 對(duì)紫貽貝鰓組織CAT 活性（圖2A）和GSH 含量（圖2C） 的影響表明：較對(duì)照組水平，低劑量（1 μg/L） As（Ⅲ） 暴露可導(dǎo)致鰓組織CAT 活性顯著升高（P ＜0.05，1.9 倍），GSH 含量略微增加；中劑量暴露組（10 μg/L） CAT 活性和GSH 含量均極顯著升高（P ＜0.01），分別達(dá)到對(duì)照組水平的2.8 倍和2.1 倍；而高劑量暴露組（100 μg/L） CAT 活性和GSH 含量較對(duì)照組水平有所升高但不顯著。

圖1 不同濃度As（Ⅲ） 暴露下紫貽貝肝胰腺CAT、GST、SOD活性以及GSH 和MDA 含量的變化

As（Ⅲ） 對(duì)紫貽貝鰓組織SOD（圖2B） 和GST 活性（圖2D） 的影響結(jié)果顯示：3 種劑量暴露組均可誘導(dǎo)鰓組織SOD 活性的上升，但較對(duì)照組水平無顯著差異（P ＞0.05），此趨勢與As（Ⅲ）對(duì)肝胰腺SOD 活性的影響基本一致。對(duì)GST 活性而言，低劑量組活性較對(duì)照組略微升高，而中、高劑量組水平較對(duì)照組則有所降低。

As（Ⅲ） 對(duì)紫貽貝鰓組織MDA 含量的影響如圖2E 所示。結(jié)果表明，不同劑量As（Ⅲ） 暴露均能導(dǎo)致鰓組織MDA 含量的增加；其中，低、中劑量組MDA 含量較對(duì)照組有所升高，但無顯著差異（P ＞0.05），而高劑量暴露組的MDA 含量則極顯著升高（P ＜0.01），達(dá)到對(duì)照組水平的1.98 倍。

3 討論

目前，有關(guān)無機(jī)砷對(duì)雙殼貝類毒性作用機(jī)制的研究相對(duì)較少，僅在斑馬貽貝（Dreissena polymorpha） 和淡水貽貝（Lamellidens marginalis） 中有相關(guān)報(bào)道。此外，其它部分水生生物中也有相關(guān)報(bào)道，包括櫛水蚤（Asellus aquaticus）、沙蠶（Laeonereis acuta） 和翠鱧（Channa punctatus） 等。

在本實(shí)驗(yàn)條件下，紫貽貝經(jīng)高濃度As（Ⅲ）（100 μg/L） 暴露30 天時(shí)，表征脂質(zhì)過氧化水平的MDA 含量顯著增加。類似的現(xiàn)象在其它水生動(dòng)物中也有報(bào)道。例如，翠鱧經(jīng)1 mg/L As（Ⅲ） 暴露7 天可導(dǎo)致機(jī)體脂質(zhì)過氧化水平的顯著升高（Allen et al，2004；Pisanelli et al，2009），沙蠶經(jīng)50 μg/L砷暴露7 天后，脂質(zhì)過氧化物（LPO） 含量有所增加（Ventura et al，2011）。但斑馬貽貝在80 μg/L As（Ⅲ） 暴露7 天后，體內(nèi)脂質(zhì)過氧化水平基本無變化（Bouskill et al，2006），這可能是由于斑馬貽貝對(duì)砷的耐受性較強(qiáng)所致。多數(shù)研究表明，亞砷酸鈉可導(dǎo)致生物體多器官的脂質(zhì)過氧化水平增強(qiáng)，并伴隨組織抗氧化能力的降低（Mosleh et al，2007；Pisanelli et al，2009），表明脂質(zhì)過氧化很可能是砷毒性作用機(jī)制之一（Fernández et al，2012）。

圖2 不同濃度As（Ⅲ） 暴露下紫貽貝鰓組織CAT、GST、SOD活性以及GSH 和MDA 含量的變化

本實(shí)驗(yàn)對(duì)紫貽貝肝胰腺和鰓組織抗氧化指標(biāo)的研究發(fā)現(xiàn)，肝胰腺和鰓組織CAT、SOD、GST 活性以及GSH 含量隨As（Ⅲ） 濃度的增加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。這可能是由于紫貽貝機(jī)體的抗氧化防御體系由低濃度的誘導(dǎo)逐步轉(zhuǎn)變?yōu)楦邼舛鹊囊种扑?。此外，研究發(fā)現(xiàn)，紫貽貝鰓組織抗氧化指標(biāo)的變化較肝胰腺更為敏感，不同劑量As（Ⅲ） 暴露可導(dǎo)致紫貽貝鰓組織CAT 活性和GSH 含量顯著升高（P＜0.05），而肝胰腺上述指標(biāo)均無顯著變化。上述現(xiàn)象的產(chǎn)生可能與貽貝鰓組織對(duì)砷的富集程度較高有關(guān)（Francesconi et al，1999）。類似的現(xiàn)象在淡水貽貝L.marginalis 中也有報(bào)道，經(jīng)1 mg/L As（Ⅲ） 暴露30 d 后，鰓組織GST 和CAT 活性受到抑制，并導(dǎo)致組織發(fā)生病理學(xué)變化，影響到鰓組織正常的氣體交換、濾食行為以及病原防御等免疫反應(yīng)（Chakraborty et al，2010；Vidal-L~ián et al，2010）?？梢?，雙殼貝類鰓組織抗氧化活性的變化有可能成為評(píng)估環(huán)境砷污染狀況的潛在生物標(biāo)志物（Box et al，2009；Moraga et al，2005）。

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