于會(huì)泳 ，申國(guó)明， 高欣欣,2

1中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所/農(nóng)業(yè)部煙草生物學(xué)與加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青島，266101；2中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院，北京100081

煙草不宜連作已成共識(shí)，連作不但對(duì)煙葉的產(chǎn)量和品質(zhì)產(chǎn)生重要的不良影響[1]，也對(duì)土壤質(zhì)量產(chǎn)生重要的不良影響[2-4]?；形镔|(zhì)被認(rèn)為是造成連作障礙的重要因素，可通過影響植物生長(zhǎng)發(fā)育的生理生化過程達(dá)到促進(jìn)或損害作用。根系分泌物是化感物質(zhì)的重要來源。有關(guān)根系分泌物中化感物質(zhì)的鑒定已在其他作物有較多研究，如大蒜[5]、黃瓜[6]、辣椒[7]等，在煙草上的研究較少。王科等研究表明根系分泌物對(duì)煙草種子的發(fā)芽勢(shì)與對(duì)照相比呈極顯著差異（P＜0.01），但對(duì)萵苣和煙草種子發(fā)芽率的影響不顯著，但從外觀來看，處理的葉片比對(duì)照小[8]；郭亞利研究了烤煙品種K326根系分泌物中的堿溶性、酸溶性和中溶性三種組分對(duì)種子發(fā)芽率的影響，結(jié)果表明三種組分均對(duì)種子發(fā)芽率有抑制作用，其中酸溶性組分抑制作用最強(qiáng)，其次為中溶性組分，最后為堿溶性組分[9]，但中溶性組分對(duì)幼苗根系活力抑制作用最強(qiáng)[10]；我們研究了中煙100根系分泌物的三種組分對(duì)種子發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率的影響，結(jié)果表明三種組分也均具有抑制性作用，且呈顯著性差異，對(duì)發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率的影響大小依次為：中溶性組分＞酸溶性組分＞堿溶性組分。以上研究表明煙草根系分泌物組分因品種不同會(huì)有一定的差異，并能確定煙草根系分泌物中存在化感(自毒)物質(zhì)，但具體種類至今未有相關(guān)的研究報(bào)道。因?yàn)闊煵葸B作障礙具有普遍性，所以具有化感作用的根系分泌物種類應(yīng)同時(shí)存在于所有品種中，基于這一思路本研究分析了NC89和K326兩個(gè)品種中共有的根系分泌物種類，初步確定了對(duì)煙草具有化感作用的根系分泌物。

1 材料與方法

1.1 供試品種

選用山東煙區(qū)兩個(gè)主栽烤煙品種NC89和K326。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 幼苗砂培

實(shí)驗(yàn)于2010年12月-2011年5月在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院青島煙草資源與環(huán)境野外科學(xué)觀測(cè)試驗(yàn)站進(jìn)行。10%的鹽酸浸泡石英砂后，用水沖洗至無氯離子且pH穩(wěn)定為止，采用托盤育苗法進(jìn)行常規(guī)育苗，幼苗大十字期時(shí)選擇生長(zhǎng)一致的幼苗進(jìn)行移栽。每天澆營(yíng)養(yǎng)液200 mL；參試營(yíng)養(yǎng)液組成如下(單位均為g/L)：Ca(NO3)2，1.90；NH4H2PO4，0.24；Mg(SO4)﹒H2O，0.98；K2SO4，1.029；CaCl2，0.894；KNO3，1.22；H3BO3，1.90；MnCl2·4H2O，1.8；ZnSO4·H2O，0.22；CuSO4·5H2O，0.08；H2MoO4·4H2O，0.09；EDTA-Fe。

1.2.2 烤煙根系分泌物的收集提取

移栽后培養(yǎng)40天，每個(gè)品種完整取出生長(zhǎng)一致的2個(gè)植株，分別放入500 mL去離子水中培養(yǎng)（每24h更換收集一次去離子水），連續(xù)收集2d，兩天收集液混合，共2L。收集液過濾后用乙酸乙酯萃取。方法為：取定量過濾后的收集液用乙酸乙酯萃取，得到乙酸乙酯相為中性組分；將剩余水相用1 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH至2.0后，再用乙酸乙酯萃取，得到乙酸乙酯相為酸性組分；將剩余水相再用1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH為8.0，用乙酸乙酯萃取，得到乙酸乙酯相為堿性組分，將酸性、堿性和中性乙酸乙酯萃取液分別減壓濃縮至1 mL(45℃)，過0.45μm濾膜[11]。

1.2.3 根系分泌物的硅烷化處理

將乙酸乙酯萃取后的上述濃縮樣品中分別加入0.25 mL硅烷化試劑(BSTFA:TMC=5:1)，加蓋密封后于80℃水浴中衍生2 h，待測(cè)。

1.2.4 GC-MS分析條件

硅烷化后的各組分根系分泌物采用Agilent7890A-5975C測(cè)定。采用電子轟擊源，轟擊電壓70eV，掃描范圍M/Z 30-600 amu，掃描速度0.2 s掃全程，離子源溫度230℃。毛細(xì)管柱：HP-5MS柱 (30 m × 0.25 mm,0.25 μm)，進(jìn)樣口溫度250℃，柱溫50℃(2 min)，以6℃/min程序升溫至250℃(保持15 min)。載氣為He，流量1 mL/min，進(jìn)樣量為1 μL。應(yīng)用NIST98質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)，分析質(zhì)譜圖，確定各組分物質(zhì)名稱。

表1 K326與NC89中性提取條件下根系分泌物主要成分比較分析

續(xù)表1

2 結(jié)果

2.1 K326與NC89中性提取條件下根系分泌物主要成分比較分析

表1為K326和NC89在中性提取條件下得到根系分泌物的種類。K326和NC89共有的組分包括4-羥基丁酸、苯甲酸、丁二酸、棕櫚酸、環(huán)戊烷、二十二烷、東莨菪素、十六酰胺和硬脂酸酰胺。

K326共含有22種主要成分，其中8種有機(jī)酸，包括2-甲基乙二酸、硼酸、2-甲氧基乙二酸、4-羥基-丁酸、苯甲酸、丁二酸、肉桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸，種類數(shù)最多；酯類物質(zhì)含有5種，分別為乙酸-2苯基乙酯、鄰苯二甲酸二丁酯、東莨菪內(nèi)酯、己二酸二辛酯、鄰苯二甲酸二辛酯；酰胺類物質(zhì)3種，分別為十六碳酰胺、9-十八烯酰胺、硬脂酸酰胺；烷烴類物質(zhì)3種，分別為十九烷、環(huán)戊烷和環(huán)十四碳烷；根系分泌物中還包含了油酸腈和4-羥基-3-甲氧基苯乙酮。

酯類物質(zhì)所占的百分含量最高，為69.09%，其中鄰苯二甲酸二丁酯占到了48.14%，其次為乙二酸二辛酯，百分含量為19.12%；酰胺類物質(zhì)所占百分含量為8.98%；酸類物質(zhì)所占比例為7.44%，其中丁二酸含量最高，為3%，其次為棕櫚酸，為1.4%；4-羥基-3-甲氧基苯乙酮和油酸腈所占比例分別為0.52%和0.89%。

NC89移栽后40天根系分泌物中的主要成份中有機(jī)酸種類數(shù)最多，共16種，相對(duì)百分含量占8.47%；酯類物質(zhì)包含3種，分別為鄰苯二甲酸二乙酯、乙二酸二辛酯和東莨菪素，所占百分含量分別為31.17、13.07和3.02%；酰胺類物質(zhì)包括2種，分別為十六酰胺和硬脂酸酰胺；烷烴類物質(zhì)包括二十二烷和環(huán)戊烷；還包括甘油、煙堿、3－甲基－4－羥基苯甲醛、4－羥基－3甲氧基苯乙酮和油酸腈五種物質(zhì)。

表2 K326與NC89酸性提取條件下根系分泌物主要成分比較分析

續(xù)表2

續(xù)表2

2.2 K326與NC89酸性提取條件下根系分泌物主要成分比較分析

表2為K326和NC89在酸性提取條件下得到根系分泌物的種類。兩個(gè)品種共有的根系分泌物組分包括2－羥基丙酸、3－甲基－2－羥基丁酸、油酸、硬脂酸、苯甲酸、丁二酸、苯丙酸、肉桂酸、月桂酸、3－甲氧基－4－羥基苯乙酸、3，4－二羥基苯甲酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、4－羥基丁酸、鄰苯二甲酸二丁酯、己二酸二辛酯、東莨菪素、環(huán)戊烷、環(huán)十四烷、油酸腈和煙堿。

K326烤煙根系分泌物共包括43種主要物質(zhì)，所占比例總和為84.27%，主要成分為酸類物質(zhì)，共28種，所占比例為27.28%，其中棕櫚酸含量最高，為12.84%；酯類物質(zhì)5種，所占比例為47.75%，其中鄰苯二甲酸二丁酯所占比例最高，達(dá)到了33.04%；酰胺類物質(zhì)3種，所占比例為6.76%；烷烴類物質(zhì)4種，所占比例為1.23%；煙堿、4-羥基-3-甲氧基苯乙酮和油酸腈所占比例分別為0.36、0.08和0.81%。

NC89移栽后40天根系分泌物在酸性提取條件下檢測(cè)到的主要組分中有機(jī)酸種類最多，共30種，所占百分含量為17.87%；酯類物質(zhì)共包含6種，占59.34%，其中鄰苯二甲酸二丁酯為34.73%，含量最多酰胺類物質(zhì)共包括3種，分別為肉豆蔻酰胺、9-油酰胺和硬脂酸酰胺，所占比例為4.74%；烷烴類物質(zhì)包括4種，分別為環(huán)戊烷、環(huán)十四烷、2，2-雙（4-羥基）苯丙烷和十七碳烯，所占比例為0.83%；還包括甘油、油酸腈和煙堿，含量分別為0.17、0.65和0.12%。

表3 K326與NC89堿性提取條件下根系分泌物主要成分比較分析

續(xù)表3

2.3 K326與NC89堿性提取條件下根系分泌物主要成分比較分析

表3為K326和NC89在堿性提取條件下得到根系分泌物的種類。K326和NC89共有的根系分泌物包括月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、鄰苯二甲酸二丁酯、己二酸二辛酯和環(huán)戊烷。

在堿性提取條件下，K326主要根系分泌物所占比例為87.49%，根系分泌物種類仍以有機(jī)酸類，共11種，包括2－羥基丙酸、3－羥基丁酸、4-羥基丁酸、丁二酸、月桂酸、肉豆蔻酸、十五烷酸、順－9－十六（碳）烯酸、棕櫚酸、油酸和硬脂酸，所占比例為3.62%；酯類物質(zhì)共7種，分別為己二酸二辛酯、乙酸-2-苯基乙酯、鄰苯二甲酸二庚酯、鄰苯二甲酸單乙基己基酯、鄰苯二甲酸二丁酯、鄰苯二甲酸二乙酯和東莨菪素，所占比例為47.17%，其中鄰苯二甲酸二丁酯所占比例為31.25%，乙二酸二辛酯為14.41%；酰胺類物質(zhì)4種，分別為三氟乙酰胺、9－油酸酰胺、硬脂酸酰胺和十六酰胺，所占比例為35.08%；烷烴類物質(zhì)包括二丁基羥基甲苯、十六烷和環(huán)戊烷，所占比例分別為0.05、0.03和0.1%；煙堿含量占0.74%；甘油和油酸腈含量分別為0.06和0.64%。

NC89移栽40天根系分泌物用堿性條件進(jìn)行提取的主要種類及含量。共提取到的種類為13種，包括有機(jī)酸類、酯類、酰胺類、烷烴類和甘油，所占比例為80.93%，有機(jī)酸類包括6種，分別為硼酸、2-羥基乙二酸、棕櫚酸、月桂酸、肉豆蔻酸和硬脂酸，所占比例為3.65%；酯類物質(zhì)包括3種，分別為鄰苯二甲酸二丁酯、己二酸二辛酯和鄰苯二甲酸單（2-乙基己醇）酯，所占比例分別為51.13、19.49和3.48%；酰胺類物質(zhì)包括月桂酰胺和硬脂酸酰胺兩種，百分含量分別為1.4%和8.02%；烷烴類物質(zhì)包括環(huán)戊烷和2,2-雙（4-羥基苯）丙烷，含量分別為0.23%和0.9%；甘油含量為0.63%。

3 結(jié)論與討論

通過對(duì)K326和NC89兩個(gè)品種移栽后40天3種不同提取條件下的根系分泌物主要成分分析得出，兩個(gè)品種共有的根系分泌物包括17種有機(jī)酸，分別為2-羥基丙酸、3-甲基-2-羥基丁酸、4-羥基丁酸、苯甲酸、丁二酸、肉桂酸、3-羥基苯甲酸、4-羥基苯乙酸、月桂酸、3-甲氧基-4-羥基苯乙酸、3,4-2羥基苯甲酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、9,12-十八碳二烯酸、油酸、硬脂酸、苯丙酸；2種烷烴，分別為環(huán)戊烷和環(huán)十四烷；4種酯類：鄰苯二甲酸二辛酯、鄰苯二甲酸二丁酯、己二酸二辛酯、東莨菪素，以及硬脂酸酰胺、甘油和煙堿。甘油、苯甲酸、月桂酸、鄰苯二甲酸二丁酯、肉豆蔻酸和硬脂酸在根際土壤中也已被檢測(cè)到[17]。

由于烷烴類物質(zhì)不具有極性，丁二酸是三羧酸循環(huán)中一種有機(jī)酸，排除作為化感物質(zhì)。目前研究公認(rèn)酚酸類物質(zhì)是造成連作障礙的主要化感物質(zhì)，苯甲酸及其衍生物已在多種作物中被確認(rèn)為化感物質(zhì)，如黃瓜[6]、大豆[12]等；土壤中的對(duì)羥基苯甲酸含量隨著花生連作年限的增加而增加[13]、鄰苯二甲酸被認(rèn)為是辣椒中的主要化感物質(zhì)之一[7]；肉桂酸可抑制茄子黃萎菌孢子的萌發(fā)，當(dāng)濃度為0.5 mmol·L-1時(shí)抑制作用最大[14]，茄子與煙草同屬茄科，該結(jié)論有一定借鑒作用，肉桂酸對(duì)煙草的化感作用需進(jìn)一步研究；棕櫚酸是一種重要的化感物質(zhì)[15-16]，本研究中兩個(gè)烤煙品種根系分泌物中棕櫚酸含量都較高，其作用機(jī)理有待深入研究，肉桂酸、月桂酸、肉豆蔻酸以及兩個(gè)品種共有的酯類物質(zhì)在多種作物中被證明具有化感作用。

本研究為水培條件下得到的煙草根系分泌物種類，由于土壤、尤其是根際土壤中發(fā)生著復(fù)雜的理化及生物學(xué)反應(yīng)，所以在實(shí)際生產(chǎn)中會(huì)因土壤、栽培等條件的不同而產(chǎn)生多種根系分泌物種類，水培條件下得到的根系分泌物種類這些反應(yīng)的物質(zhì)基礎(chǔ)。研究煙草根系分泌物的化感作用是下一步需要做的工作。

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