劉雪瑩

山東省菏澤醫(yī)學(xué)專科學(xué)校

1 概述

抗菌藥物被廣泛應(yīng)用于治療養(yǎng)殖動(dòng)物，有時(shí)也被作為生長促進(jìn)劑使用[1]。這些藥物的大量利用必然導(dǎo)致食品中留有殘留物?？咕幬餁埩粑锏拇嬖谝鹆巳藗儗?duì)消費(fèi)者健康的關(guān)注。主要考慮對(duì)象為：（i）對(duì)接觸過的個(gè)體可能產(chǎn)生的過敏性敏化作用；（ii）抗菌藥物殘留物甚至在濃度低于最高殘留限量時(shí)也有可能對(duì)人體腸道施加選擇性壓力；（iii）選擇抗藥性細(xì)菌的可能性。

根據(jù)高性能的非侵入性二氧化碳傳感器的具體應(yīng)用情況，人們研發(fā)了電化學(xué)傳感器系統(tǒng)，以可靠、快速、低成本的研究微生物學(xué)過程。在本研究中，作者將二氧化碳傳感器用于檢測(cè)和鑒定牛奶中殘留的喹諾酮和四環(huán)素。這種測(cè)量以生成二氧化碳的速率為基礎(chǔ)，其中二氧化碳生成的速率與敏感菌生長的抑制有關(guān)。本文針對(duì)喹諾酮和四環(huán)素開展了實(shí)驗(yàn)研究，因?yàn)槿藗冋J(rèn)為應(yīng)特別關(guān)注牲畜生產(chǎn)中最后使用的這些物質(zhì)，而且這些物質(zhì)能夠治療通過食物鏈把動(dòng)物源性細(xì)菌傳播至人體而導(dǎo)致的各種人體感染（包括胃腸道感染）。對(duì)喹諾酮和四環(huán)素的耐藥性會(huì)限制許多感染的藥物選擇。此外，對(duì)這兩種藥物具有耐藥性的生物體通常也會(huì)對(duì)其它類別的抗菌藥物產(chǎn)生耐藥性。這種情況下，首先必須鑒定在養(yǎng)殖動(dòng)物中喹諾酮和四環(huán)素的使用給公共衛(wèi)生造成的風(fēng)險(xiǎn)，這有助于研發(fā)適合于有效食品管理的分析方法。

2.實(shí)驗(yàn)

2.1 材料和試劑

2.1.1 氣體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（GRMs）

在傳感器標(biāo)定中使用了濃度分別為348、1253、1745、2881和6600ppm的CO2（產(chǎn)自意大利羅馬的SIADSrl）。

2.1.2.微生物

本研究所用的微生物為大腸桿菌ATCC11303。也測(cè)試了其它微生物，但是因?yàn)榇竽c桿菌對(duì)喹諾酮和四環(huán)素比較敏感、繁殖時(shí)間短、更重要的是，大腸桿菌不會(huì)致病，所以選定了大腸桿菌。把細(xì)胞存儲(chǔ)于4℃環(huán)境下的Mueller-Hinton瓊脂斜面上，并在37℃環(huán)境下的Mueller-Hinton肉湯中生長。利用紫外分光光度計(jì)（確定培養(yǎng)基的標(biāo)準(zhǔn)為1×107mL-1。

2.1.3.標(biāo)準(zhǔn)

Sigma提供了四環(huán)素（TC）、土霉素（OTC）、氯四環(huán)素（CTC）、萘啶酸（NALA）、恩諾沙星（ENRO）、麻保沙星（MAR）、諾氟沙星（NOR）、環(huán)丙沙星（CIPRO）、氟甲喹（FLU）和單諾沙星（DAN）等標(biāo)準(zhǔn)品。制備了各喹諾酮和四環(huán)素在水中的標(biāo)準(zhǔn)貯備液（10mg/L），并把它們存放于-18℃的環(huán)境中。用適量的水稀釋了各標(biāo)準(zhǔn)貯備液，從而制備了所有藥物的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.2.樣品制備

就各個(gè)被測(cè)驗(yàn)的抗生素而言，都用了純牛奶樣本（X0）作為對(duì)照組，分析了三種添加25（X1）、50（X2）和100（X3）μg/L喹諾酮和四環(huán)素的牛奶樣品。選擇了濃度為25μg/L的牛奶，因?yàn)檫@一濃度比牛奶的最高殘留限量（即30μg/L的單諾沙星）低。牛奶中喹諾酮和四環(huán)素等其它最高殘留限量都較高，在50至100μg/L范圍之內(nèi)。

制備樣品時(shí)，添加了4mL培養(yǎng)基、0.5mL標(biāo)準(zhǔn)化的細(xì)菌培養(yǎng)基（1×107mL-1）作為接種物、以及0.5mL純牛奶；而在制備對(duì)照樣品時(shí)，添加了0.5mL三種不同濃度的添加藥物的牛奶。

2.3 傳感器分析

2.3.1 總體微生物環(huán)境因素

眾所周知，用時(shí)間函數(shù)描繪細(xì)菌增長的實(shí)驗(yàn)曲線是S形曲線；曲線表示了四個(gè)不同的階段：即遲緩期（潛生長）、對(duì)數(shù)期（指數(shù)生長）、穩(wěn)定期和衰亡期。

命名為對(duì)數(shù)期的原因是因?yàn)橥ǔＳ脤?duì)數(shù)型數(shù)學(xué)模型代表這一階段。事實(shí)上，在這一階段，微生物（Mi）的數(shù)量增加，各繁殖時(shí)間（tr）內(nèi)微生物數(shù)量翻倍增長；求得時(shí)間t時(shí)Mi（n）的數(shù)量為：

其中n0表示Mi的起始數(shù)量。n與2(t/tr)之間存在指數(shù)關(guān)系；而logn與t之間存在線性關(guān)系。必須添加正確的條件，同時(shí)考慮Mi的衰亡率、基質(zhì)以及微觀環(huán)境因素。

根據(jù)方程（1），假設(shè)各微生物以恒定的速度（G，mol/s）通過呼吸生成CO2，那么求得對(duì)數(shù)期CO2的總體生成速率（CO2，mol/s）為：

2.3.2 抑制劑的作用

可以通過如下等式表示存在抑制劑時(shí)微生物的有氧呼吸過程：

其中沒有水；Mi表示微生物；M表示培養(yǎng)基；In表示抑制劑；Ca表示降解產(chǎn)物；而O2和CO2表示溶解氧和二氧化碳，取自于氣相。分析測(cè)量可能會(huì)考慮到所有這些成分（即，Mi、M、In、Ca、O2和CO2）。在本研究中，用于間接測(cè)定抑制劑抗菌活性的分析物為CO2。

利用培養(yǎng)基中的載氣分離了微生物生成的二氧化碳，從而求得了與二氧化碳?xì)怏w濃度相關(guān)的emf（E，mV）：

其中，k°和k表示利用氣體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（如已知yco2值的空氣樣品）通過校正步驟求得的實(shí)驗(yàn)值。

圖1.CO2傳感器設(shè)計(jì)圖

圖2.電化學(xué)生物傳感器系統(tǒng)簡圖

圖3.所記錄信號(hào)E相對(duì)時(shí)間的曲線

2.3.3.儀器

利用高性能的非侵入性二氧化碳傳感器，結(jié)合使用敏感細(xì)胞等細(xì)菌培養(yǎng)基，研發(fā)了一種新的分析系統(tǒng)。該電化學(xué)儀器是一種原電池，其中包括浸泡于工作電解液（WS）的參比電極（RE），并通過蠶絲（親水性物質(zhì)）與指示電極（IE）相接；這種蠶絲作為傳感器薄膜（SM）使用。指示電極是一種金屬腐蝕電極，而參比電極是傳統(tǒng)型電極或與指示電極類似的腐蝕電極。工作電解液是一種流動(dòng)性的或靜止溶液；其構(gòu)成成分符合yco2水平要求，并能預(yù)防其它氣體化學(xué)物的阻礙作用。在本研究中，工作電解液就是0.1m水中的KCl、濃度為10-4至10-2m的強(qiáng)堿（如Na2CO3）、以及二氧化碳，直至溶液飽和為止。圖1所示為二氧化碳傳感器。該傳感器的外殼能保護(hù)它不受電流和通風(fēng)的影響。在傳感器中鋼管與玻璃行業(yè)特有的電解池相接。利用個(gè)人計(jì)算機(jī)控制的萬用表（產(chǎn)自惠普，型號(hào)為Agilent34401A）開展了電位測(cè)量。用個(gè)人計(jì)算機(jī)的目的在于獲取和加工數(shù)據(jù)（計(jì)算機(jī)產(chǎn)自惠普的AgilentIntuiLink）。圖2所示為電化學(xué)生物傳感器系統(tǒng)的簡圖。

表1

2.3.4.分析程序

讓載氣以恒定的速率通過含有5mL培養(yǎng)基的參比電池以及二氧化碳傳感器流動(dòng)，直至基線值（E°，MV）保持恒定不變?yōu)橹?。然后，通過樣品電池（Xi）連續(xù)把載氣轉(zhuǎn)移，然后到傳感器中。至180分鐘時(shí)求得了電位差ΔE和時(shí)間的值。

五分鐘的分析過程如下：

一分鐘分析。

四分鐘用于分析傳感器重新平衡以及通過參比電池（R）的載氣。圖3所示為所記錄的信號(hào)。

2.3.5.統(tǒng)計(jì)分析

用參數(shù)和非參數(shù)統(tǒng)計(jì)分析獲得了各微生物的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。此外，為了評(píng)估不同濃度抗菌物與純牛奶之間差異的顯著性，開展了多因子變異數(shù)分析。并將Statgraphics軟件用于編程。

3.結(jié)果與討論

對(duì)氣體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（GRMs）的分析測(cè)定結(jié)果表明，濃度在348至6600ppm這一區(qū)間時(shí)，傳感器的精確度良好（0.8左右），相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（σ，%）大約為2.4%。

表1所示為所有樣本分析的結(jié)果。

總之，研究中的所有喹諾酮和四環(huán)素都具有很強(qiáng)的抗菌活性。結(jié)果充分證明，在120分鐘后抑制程度具有顯著意義。在180分鐘范圍內(nèi)，抑制程度一直呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。過了這一時(shí)間后，ΔE不再發(fā)生顯著變化。

結(jié)語

本研究研發(fā)的實(shí)驗(yàn)方法和分析方法似乎足以達(dá)到本文的目的。例如，與傳統(tǒng)的篩查法，細(xì)菌抑制法和免疫測(cè)定法相比，本文研發(fā)的實(shí)驗(yàn)與分析方法具有如下優(yōu)勢(shì)：（i）分析所費(fèi)時(shí)間非常短（大約120分鐘）；（ii）樣本量較小（大約為0.5mL）；（iii）不需要處理樣本；（iv）精確度高；以及（v）可能會(huì)連續(xù)地跟蹤抑制過程。

此外，把二氧化碳傳感器系統(tǒng)與大腸桿菌ATCC11302培養(yǎng)基結(jié)合使用，特定用于測(cè)驗(yàn)喹諾酮與四環(huán)素；但是其它抗菌藥物沒有產(chǎn)生可測(cè)量的分析信號(hào)。因此，可以把該方法用于鑒定陽性樣品，而且該方法有助于更好的進(jìn)行之后的化學(xué)鑒定。

最后，發(fā)現(xiàn)傳感器的靈敏度很好，因?yàn)樗軝z測(cè)濃度小于等于25μg/L時(shí)殘留的所有本文研究的喹諾酮類與四環(huán)素類物質(zhì)。從這點(diǎn)來看，當(dāng)前為牛奶確定的最高殘留限量（MRLs）都比25μg/L這一濃度高。

鑒于本研究獲得的良好結(jié)果，之后會(huì)利用不同于大腸桿菌的其它試驗(yàn)微生物研究其它類別的抗菌藥物，以擴(kuò)展這一方法的應(yīng)用領(lǐng)域。此外，也將考慮其它食品基質(zhì)。這會(huì)是替代傳統(tǒng)篩查法的一種有效措施，為此，這是個(gè)很好的值得研究的出發(fā)點(diǎn)。通常情況下，把這種簡單、低成本、快速靈敏的方法用于檢測(cè)殘留的抗菌物，以加強(qiáng)抗菌藥物領(lǐng)域的食品管理與監(jiān)督。

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