馬可，方俊清，鄭曉敏，陳玉銀

（浙江大學(xué)應(yīng)用生物資源研究所，浙江 杭州 310058）

不同家蠶品種血液黃酮類化合物含量的測定及分析

馬可，方俊清，鄭曉敏，陳玉銀*

（浙江大學(xué)應(yīng)用生物資源研究所，浙江 杭州 310058）

本研究對浙江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院家蠶種質(zhì)資源庫中四種不同繭色的家蠶品種即綠色繭P50、黃色繭金秋、白色繭玉豐以及紅色繭HHM的五齡第1～6天黃酮類化合物含量進行了測定，同時對種質(zhì)資源庫中其他蠶品種五齡第4天血液中黃酮類化合物含量進行了測定，并且分析了不同蠶品種以及不同繭色之間的差異及變化規(guī)律。結(jié)果顯示黃酮類化合物的峰值依品種特性出現(xiàn)在五齡第3或第4天，綠色繭的黃酮類含量變化規(guī)律與其他品種截然不同，品種間黃酮類化合物的含量差異很大，可能與品種的全繭量及五齡發(fā)育經(jīng)過長短有關(guān)。

黃酮類化合物；家蠶種質(zhì)資源；繭色

黃酮類化合物是一類天然色素及苷類的總稱，是一大類以苯色酮環(huán)為基礎(chǔ)的酚類化合物。黃酮類化合物已經(jīng)廣泛應(yīng)用于食品和醫(yī)藥等各個方面。研究表明，黃酮類化合物對人體具有消除氧自由基、抗氧化、抗過敏、抗炎、抗菌、抗突變、抗腫瘤、保肝、雌激素樣作用，以及保護心腦血管系統(tǒng)、降血糖等生理活性，且毒副作用小的優(yōu)點。因此黃酮也是評價食品營養(yǎng)價值，開發(fā)新的食品資源的一個重要指標(biāo)。

目前對黃酮類化合物提取的主要原材料來自植物如槐花、銀杏、大豆等，動物方面主要有蜜蜂的相

關(guān)產(chǎn)品如蜂膠等。國內(nèi)外學(xué)者研究表明用家蠶幼蟲制成的全蠶粉具有顯著的降血糖作用，這已分別由Ryu等［1］、桂仲爭等［2］、陳智毅等［3］、肖輝等［4］在動物實驗和臨床研究中得到了證實，推測可能與全蠶粉中高含量的黃酮類功能性物質(zhì)有關(guān)。同時研究表明，用5齡第3 d蠶冷凍干燥制成的全蠶粉，較用其它生長發(fā)育階段蠶制成的全蠶粉表現(xiàn)出較高的降血糖作用，所以用于降血糖的全蠶粉均選用5齡第3 d蠶制作。劉淑梅等［5］建立了家蠶幼蟲體中黃酮類化合物的測定方法，查明家蠶幼蟲體中富含黃酮類化合物。金吉等［6］研究了12個不同品種、不同生長發(fā)育階段、不同性別家蠶幼蟲體中黃酮類化合物含量的變化規(guī)律。發(fā)現(xiàn)家蠶幼蟲體黃酮類化合物含量在蠶品種及雜交組合存在顯著差異，高低相差3倍之多；在性別間，雄蠶高于雌蠶；在不同發(fā)育階段隨齡期增大而逐漸增加；在5齡期，隨生長而逐漸升高，至第3 d達到峰值，此后除第5 d有一小波動外逐日漸下降，至成熟時又稍有上升。該研究所用的材料為生產(chǎn)上實用品種，都為白色繭品種。而家蠶有非常豐富的種質(zhì)資源庫，除白色繭外還有紅色、黃色及綠色繭等蠶品種。本研究通過對黃酮類化合物的含量進行測定分析，尋找合適的家蠶種質(zhì)資源，為特殊功能性家蠶品種的選育提供參考依據(jù)，并為家蠶種質(zhì)資源信息庫充實數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試蠶品種

選取浙江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院家蠶資源庫中保存的不同系統(tǒng)和化性、品質(zhì)與繭色有代表性的部分品種，其品種名如下：D93A、新苗A3、新苗、明日A2、明日A、明日B、84MA、GSC、GSJA、YC菁松、YJ皓月、薪2桂、豐一改、薪杭改、白云改、秋豐、白玉、菁松、ZYM、濃綠白玉、云5B白玉、N春菁秋豐、HB、碧蓮、Dz白玉、綠秋豐、沔陽紅、大團圓、HHM、ZYD、金秋、初日、HB秋豐、ZAU2A、54Nd蘇12、B84、法PS黑縞、PMYW、褐圓限性、玉豐、明珠、銀豐、P50、皓月B84、豐B84、五四3B84、薪杭3B84、白云3B84、白玉2B84、鎮(zhèn)豐3B84、白沔、銀豐N、秋豐P、N滯育。

1.2 主要試劑及儀器

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品購于Sigma公司，80%乙醇（分析純），無水甲醇（色譜醇）；島津UV-2450紫外分光光度計［Shimadzu（suzhou）Instuments Manufacturing,Co., Ltd.］；臺式離心機為杭州達科科學(xué)儀器有限公司。

1.3 血液樣品的制取

每個蠶品種取試樣蠶10條，剪去腹足，將血液放出至1.5 m l離心管內(nèi)。另每個品種取10條，同樣操作后，將其保存于-20℃冰箱中供備用。從裝有血液樣品的1.5 m l離心管中各取100μl血液樣品至3個2 m l離心管中，并向其中分別加入1.5 m l 80%酒精進行稀釋，供黃酮類化合物測定。

1.4 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

稱取10 mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，置于50 m l的容量瓶內(nèi)，得到0.2 mg/m l的標(biāo)準(zhǔn)溶液。然后分別取標(biāo)準(zhǔn)溶液0、1、2、3、4、5及6 m l后加入300μl 5%NaNO2溶液，搖勻并且靜置6 min，然后加入300μl 10%的Al-Cl3·6H2O溶液，混合后靜置6 min，然后加入1 Mol/L的NaOH溶液4m l，混勻。加入75%乙醇溶液定容至25 ml，使標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度分別為0、0.008、0.016、0.032、0.040和0.048 mg/ml，然后在510 nm下測定吸光值，空白對照組用純水作相同處理，重復(fù)三次。

1.5 黃酮類化合物的測定

參考劉淑梅等［5］的方法，使用硝酸鋁顯色法進行黃酮類物質(zhì)含量的測定。取試樣液1.5 m l，加入60μl 5%的NaNO2，搖勻并靜置6 min。然后加入60μl 10%的AlCl3·6H2O，混合后靜置6 min。加入1 Mol/L的NaOH溶液800μl，最后加入75%乙醇定容至2.5 ml。在510 nm下測定吸光值。對照組用純水，并做同樣處理。

2 結(jié)果與分析

2.1蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)實驗方法所述，得到如圖1所示的標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為Y=11.41129X+0.01730，相關(guān)系數(shù)為r2=0.99401。濃度與對應(yīng)的吸光度呈良好的線性關(guān)系。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 1 Standard Curve of the Rutin

2.2 四種不同繭色家蠶品種五齡不同發(fā)育時期的黃酮含量變化

取家蠶綠色、金黃色、白色及紅色繭蠶品種各一個，測定其五齡第1～6 d黃酮類含量的變化，結(jié)果如圖2所示。

從圖2可知，各品種的五齡第1～6 d黃酮類化合物含量的變化不盡相同，除綠色繭品種P50外，總體上有隨著發(fā)育經(jīng)過先上升后下降的趨勢，五齡第1 d的黃酮類含量相對較低，隨著發(fā)育經(jīng)過逐日增加，至五齡第3或4 d達到峰值，隨后又開始下降。各品種的變化規(guī)律也有所不同，其中玉豐的黃酮類含量隨著發(fā)育經(jīng)過變化幅度比較大，五齡第1 d相對比其他品種低一些，但高峰值卻為最高，隨后降至低于第1 d的含量。HHM的變化比較平穩(wěn)，金秋在五齡早期相對較高，但隨后降幅較大，后期為含量最低的品種。綠色繭品種P50幼蟲黃酮含量的變化趨勢則截然不同，在五齡第1 d時最高，達到0.427 mg，隨著發(fā)育經(jīng)過黃酮類含量反而降低，至五齡第4 d最低，隨后又開始上升。

2.3 不同家蠶品種五齡第四周天幼蟲的黃酮類化合物含量

根據(jù)家蠶五齡期的生理生化變化規(guī)律，一般認(rèn)為五齡第3 d是家蠶生理轉(zhuǎn)折期，第4天是處于代謝高峰期，因此取5齡第4 d為測定各品種的時間點，結(jié)果如表1所示。

由表1可見，家蠶品種之間血液黃酮類含差異較大，高的明日可達0.347 mg/m l，低的綠秋豐只有0.053 mg/m l，達到6.5倍的差異。將品種按照繭的顏色歸類求平均值，其中綠色繭由于P50在前面的測定中發(fā)現(xiàn)黃酮類含量較高，所以將含有P50系統(tǒng)的綠繭品種歸一類，把其他的綠色繭品種歸為一類，結(jié)果可見，每類繭中品種之間的黃酮類含量差異也比較大?？傮w而言，各組的平均值之間沒有太顯著的差異，只有綠色繭1組的黃酮含量特別低，而這一組的繭色綠色最為鮮艷，綠色2組為含有P50血統(tǒng)的一類綠色繭，其綠色偏黃。分析可能綠色繭1組所具有的基因能把大量的黃酮類化合物運送到絲腺體內(nèi)，使蠶絲成為自然的綠色，因而導(dǎo)致血液中黃酮類化合物含量反而低，這一推測有待進一步的試驗測定來驗證。綠色繭2組的各品系由于都含有P50血統(tǒng)，品種間黃酮類的含量差異不大。在白繭組中黃酮類化合物含量品種間的差異比較大，總的趨勢是繭絲量高、五齡發(fā)育經(jīng)過長的白繭品種含量相對較高，如表格中較靠前的這些白繭品種；繭層量較低、五齡發(fā)育經(jīng)過相對較短的白繭品種黃酮類含量也相對較低。而在品種的化性和系統(tǒng)之間，并沒有明顯的變化規(guī)律可循，中系品種中有D93A，新苗等高含量的品種，也有銀豐、秋豐等低含量的品種，日系品種中也有明日、玉豐等高含量的和ZAU2A、白玉等低含量的品種。但總體來說，在所測定的品種中，較高黃酮含量的品種日系居多。

圖2 不同繭色家蠶品種五齡第1～6天黃酮類化合物含量變化趨勢Figure 2 Variation of flavonoids contents in larval hemolymph of silkworm Bombyxmori from day 1 to 6 of fifth instar

表1 不同家蠶品種五齡第四天黃酮含量（單位：mg/m l）Table 1 The flavonoids content of silkworm in the fourth day of five age with different varieties

3 討論

關(guān)于五齡不同發(fā)育時期黃酮類化合物含量的變化規(guī)律，金吉［6］等用秋豐×白玉為材料測定結(jié)果認(rèn)為五齡第3 d達到峰值，隨后降低。但本研究用不同繭色的原種進行測定，發(fā)現(xiàn)因品種而異，總的趨勢是繭絲量相對較低、五齡發(fā)育經(jīng)過較短的品種在五齡第3 d達到峰值，而繭絲量較高、五齡發(fā)育經(jīng)過較長的品種在五齡第4 d達到峰值。這一結(jié)果與金吉等的結(jié)果也并不矛盾，因為金吉等只測定了一個品種，用的實驗材料秋豐×白玉系強健性中絲量雜交種，五齡發(fā)育經(jīng)過相對較短，因此峰值出現(xiàn)在五齡第3 d。

關(guān)于綠色繭P50的異常變化規(guī)律，作者認(rèn)為可以從該品種繭色控制基因的遺傳差異來解釋。在五齡第1 d，其血液中的黃酮類含量比其他品種高，但是由于綠色繭所帶有的基因可以將血液中的黃酮類物質(zhì)運輸?shù)浇z腺體內(nèi)，隨著五齡的發(fā)育經(jīng)過絲腺體大量合成絲蛋白，生理活性處于活躍期，因此血液中的黃酮類物質(zhì)也被大量的運輸?shù)浇z腺體內(nèi)，而導(dǎo)致血液中黃酮類化合物含量下降，至五齡第4 d達到最低值，隨后隨著五齡發(fā)育后期向成熟方向發(fā)展，運輸?shù)浇z腺體的物質(zhì)逐漸減少，血液中黃酮的含量就隨之增加。這一推測有待進一步的實驗來證實。

關(guān)于不同品種間血液黃酮類含量的差異，由于五齡4 d并不是所有品種的峰值期，單從這一測定時間在品種間比較黃酮類化合物含量的高低是不可靠的。從本研究結(jié)果看，除綠色繭這一特殊的類別以外，似乎與蠶品種的全繭量及發(fā)育經(jīng)過有關(guān)，全繭量高、五齡發(fā)育經(jīng)過長的品種，黃酮類含量相對較高，而在品種的系統(tǒng)間似乎沒有明顯可循的變化規(guī)律。金吉等的研究認(rèn)為五齡幼蟲體黃酮類化合物的含量中系高于日系，但本研究的結(jié)果顯示很多日系品種的黃酮類化合物含量遠(yuǎn)高于中系品種，這是因為金吉等研究測定時間點在五齡第3 d，而本試驗在五齡第4 d。多數(shù)日系品種的五齡發(fā)育經(jīng)過比中系長，可能的峰值會出現(xiàn)在五齡第4 d而不是第3 d，所以前者研究結(jié)果日系品種的黃酮類含量往往比實際峰值低，而本研究的結(jié)果則中系品種的黃酮類化合物含量很可能會比實際峰值低。因此作者認(rèn)為，對品種間黃酮類化合物含量比較應(yīng)該測定五齡第3 d和4 d兩個時間段為比較合理。

［1］Kang Sun Ryu，Heui San Lee，Sung Hyun Chung，et a1．An activity of lowering blood-glucose levels according to preparative condition of silkworm powder［J］.Korean J Seric Sci，1997，39（1）：79～85.

［2］桂仲爭，陳杰，陳偉華，等.全蠶粉（sP）降血糖的作用效果及其機理的研究［J］.蠶業(yè)科學(xué)，200l，27（2）：114～118.

［3］陳智毅，廖森泰，李清兵，等.多化性黃血蠶的食用和藥用價值的研究［J］.蠶業(yè)科學(xué)，2002，28（2）：173～176.

［4］肖輝，施新琴，羅存敏，等.蠶粉復(fù)合物對小鼠若干生理指標(biāo)的影響［J］.蠶業(yè)科學(xué)，2004，30（1）：111～114.

［5］劉淑梅，時連根，李有貴.家蠶幼蟲體黃酮類化合物的測定方法［J］.蠶業(yè)科學(xué)，2005，3l（1）：74～78.

［6］金潔，劉淑梅，時連根.家蠶幼蟲體中黃酮類化合物含量的變化規(guī)律［J］.2005，31（2）：141～144.

Analysis on Flavonoids Content in Larval Hemolym ph of Silkworm (Bombyxmori)Varieties Conserved in Germplasm Resources

MA Ke,FANG Jun-qing,ZHENG Xiao-m in,CHEN Yu-yin*
（Institute ofApplied Sciences,Zhejiang University,Hangzhou 310058,China）

Flavonoids content in larval hemolymph of four silkworm varieties with different cocoon color from day 1 to day 6 of fifth instar and some other silkworm varieties from germplasm resource were analyzed in the present study.Results showed that peak value of flavonoids appeared in day 3 or 4 depending on the developmental duration and cocoon weight of different silkworm varieties,meanwhile,the silkworm varietieswith green cocoon color showed completely different pattern.There are significant differences of flavonoids contents among silkworm varieties,which is no close relationship with the silkworm races butmight related with their cocoon weightand developmental duration.

Germplasm Resources of Bombyxmori;Cocoon color

S882

：A

：0258-4069［2013］04-021-05

浙江省農(nóng)業(yè)新品種選育重大科技專項（2012C12910）

馬可（1991-），男，浙江臨安人，本科生，主要從事家蠶生化物質(zhì)與品種方向的關(guān)系研究。E-mail：809417071@qq.com

陳玉銀，女，教授。E-mail：chenyy@zju.edu.cn