施李楊，張海萍，鄧連霞，朱良均

（浙江大學(xué)應(yīng)用生物資源研究所，浙江 杭州 310058）

靜電紡絲素納米纖維在修復(fù)醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用

施李楊，張海萍，鄧連霞，朱良均*

（浙江大學(xué)應(yīng)用生物資源研究所，浙江 杭州 310058）

靜電紡絲是目前制備納米纖維的一種非常有效的方法之一。由于該技術(shù)具有裝置簡單、價廉、獲得的納米纖維和細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)非常相似，因此，越來越受到研究者的關(guān)注。絲素蛋白是一種天然的、可降解、低免疫原性的結(jié)構(gòu)蛋白，在生物材料中具有廣泛的應(yīng)用前景。本文綜述了靜電紡納米絲素在修復(fù)醫(yī)學(xué)中的研究進(jìn)展，并對以后的發(fā)展趨勢提出了想法。

絲素；靜電紡絲；修復(fù)醫(yī)學(xué)；應(yīng)用

1 引言

絲素蛋白是一種含有18種氨基酸的天然高分子纖維蛋白，其中甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸約占85%。由于絲素蛋白具有良好的生物相容性和生物降解性能、優(yōu)良的機(jī)械性能、易加工和修飾、降解產(chǎn)物無毒性和低免疫源性以及產(chǎn)量豐富等優(yōu)點，可用于研制各種用途的生物材料［1］。近年來隨著納米技術(shù)的發(fā)展，基于絲素蛋白的納米纖維在修復(fù)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用得到了廣泛關(guān)注［2］。而采用靜電紡絲法制備納米纖維，具有方法簡單、設(shè)備要求低等優(yōu)點，是目前研究較多的手段之一。

2 靜電紡絲技術(shù)和絲素納米纖維的制備

靜電紡絲是目前制備納米纖維的一種非常有效的方法。早在1917年，Zeleny首次闡述了靜電紡絲的基本原理［3］，1934年美國人Fomthals申請了第一項有關(guān)靜電紡絲的專利［4］，1969年，Taylor提出了Taylor錐和臨界電壓的概念，奠定了靜電紡絲的理論基礎(chǔ)［5］。靜電紡絲的基本原理相對比較簡單，它是使高聚物溶液或熔體帶電，并置于噴絲口與接收裝置之間的高壓電場之中，當(dāng)電場強(qiáng)度增加時，噴絲頭上呈半球形的液滴變長從而形成Taylor錐，當(dāng)電場強(qiáng)度達(dá)到一定值時，電場力克服液體的表面張力，溶液射流便從泰勒錐的尖端噴射出去，經(jīng)過一定距離的飛行，射流變細(xì)，溶劑揮發(fā)或者熔體固化，從而在接地的接收裝置上得到由亞微米級或者納米級的纖維構(gòu)成的、以隨機(jī)取向或定向排列形式存在的靜電紡基質(zhì)材料。

在生物體內(nèi)，細(xì)胞外基質(zhì)（ECMs）主要由粘多糖（GAGs）以及纖維蛋白（膠原、彈力蛋白等）組成，ECMs的主要作用是使細(xì)胞重新排列和胞外信號傳導(dǎo)［6］。ECMs中的纖維蛋白的直徑在50～500 nm，由于其小于細(xì)胞直徑所以能夠很好的調(diào)節(jié)細(xì)胞的三維排列［7］。靜電紡絲方法制備的納米纖維無紡布基質(zhì)，其直徑大小和ECMs中纖維直徑很相近，能夠很好的模擬ECMs一些性質(zhì)。國此，該納米纖維無紡布有望用于再生醫(yī)學(xué)組織修復(fù)領(lǐng)域。

靜電紡制備納米纖維的裝置，主要包括三個部分，高壓電源、推力裝置和接收器（圖1，Sukigara）。該研究組，詳細(xì)研究了絲素溶液濃度、電場大小、噴絲頭到接收器之間的距離對絲素納米纖維直徑以及形態(tài)的影響［8］。此外，他們還分析了絲素?zé)o紡布的二級結(jié)構(gòu)和力學(xué)性能［9］。

圖1 靜電紡絲裝置示意圖［8］Figure 1 The schematic diagram of electrostatic spinning device

3 靜電紡絲素納米纖維在修復(fù)醫(yī)學(xué)的中應(yīng)用

3.1絲素納米纖維在血管修復(fù)工程中應(yīng)用

2008年，Bondar等［10］人將血管上皮細(xì)胞（EC），種植到納米或微米級的靜電紡絲素纖維上，檢測了細(xì)胞和材料的相容性，增殖和細(xì)胞粘附性能，結(jié)果顯示這種微納米級的絲素纖維能夠促進(jìn)EC的生長，并且無細(xì)胞毒性作用。另外他們用免疫組織化學(xué)的方法檢測PECAM-1蛋白VE-cadherin蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示實驗組和對照組有明顯差異。這可以說明這種材料具有血管修復(fù)的應(yīng)用價值。Soffer等［11］用滾筒收集器成功的制備出了內(nèi)徑在3 mm左右，厚度在1.8 mm左右的管狀納米絲素纖維，其平均耐受壓（UTS）為2.42±0.48MPa，線性模量為2.45±0.47 MPa，這雖然和金標(biāo)準(zhǔn)的人造血管還有一段距離，但是比較膠原支架已經(jīng)有了很大的提高。

3.2 絲素納米纖維皮膚輔料的應(yīng)用

Min等對納米絲素纖維應(yīng)用于皮膚輔料做了詳細(xì)的研究。單獨的絲素納米纖維可以促進(jìn)角質(zhì)化細(xì)胞和上皮細(xì)胞的增殖。當(dāng)殼聚糖負(fù)載在絲素纖維上時，能夠起到止血的作用，并能夠促使上皮細(xì)胞的粘附和增值。以上結(jié)果表明納米絲素在皮膚創(chuàng)傷修復(fù)中能夠應(yīng)用［12～13］。

3.3 絲素納米纖維在骨修復(fù)中應(yīng)用

Meechaisue1等［14］用85%甲酸為溶劑溶解再生絲素，制得紡絲液，以電壓為20 kv針頭到接收器距離為10 cm為條件電紡，用甲醇水溶液（90/10）處理得到絲素?zé)o紡布。將鼠成骨樣細(xì)胞（MC3T3-E1）種植到上述無紡布上，MTT檢測細(xì)胞增殖，SEM觀察細(xì)胞在機(jī)制上的生長狀態(tài)。結(jié)果表明，絲素?zé)o紡布基質(zhì)能夠提高M(jìn)C3T3-E1的增值，在骨組織工程中具有潛在的應(yīng)用價值。Jin等［15］人首先將再生絲素水溶液和PEO混合制得紡絲液，電放得到絲素/PEO無紡布，甲醇固定后，37℃水洗48 h后除去PEO。當(dāng)用上述材料培養(yǎng)人骨髓間充質(zhì)細(xì)胞（hBMSC）時，發(fā)現(xiàn)去除PEO的絲素?zé)o紡布能夠促進(jìn)細(xì)胞的增值和粘附。此外，Kim等［16］人同樣使用MC3T3-E1為研究對象，將其種植到絲素納米纖維上，骨鈣蛋白（OCN）含量隨著時間的變化發(fā)生顯著性變化。在堿性磷酸酶（ALP）和磷酸鈣鹽的沉積上絲素?zé)o紡布組顯示出明顯與塑料對照組明顯的不同。為了考察這種無紡布基質(zhì)在體內(nèi)誘導(dǎo)骨形成的能力，他們使用成年雄性新西蘭白兔為對象，制備了直徑為8 mm全層厚度大小的顱骨創(chuàng)傷模型，并將絲素基質(zhì)植入到創(chuàng)傷處，分別在4周、8周、12周觀察創(chuàng)傷愈合情況，并進(jìn)行組織學(xué)觀察。結(jié)果顯示，和對照組相比，實驗組能夠更快速地誘導(dǎo)新骨的形成。同時，實驗組觀察到完全的創(chuàng)傷愈合，而對照組則只是小部分的愈合。組織學(xué)切片觀察顯示，在愈合組織附近，實驗組有更多的成骨樣細(xì)胞，但是未見巨噬細(xì)胞等炎癥細(xì)胞的存在。

通過改變靜電紡絲技術(shù)，可以制備出三維絲素納米支架材料，相對于二維基質(zhì)，三維材料由于其有較大的孔隙率和孔徑，能夠顯著提高M(jìn)C3T3-E1增值和伸展。通過免疫印跡法檢測調(diào)控細(xì)胞增值的一些信號蛋白（如FAK、Tyr397、ERK1/2等）顯示出同樣的結(jié)果［17］。

由于絲素蛋白性質(zhì)單一，有時通過復(fù)合其他物質(zhì)制備出絲素復(fù)合無紡布材料在骨修復(fù)中顯得尤為重要。Li等人［18］將BMP-2、納米羥基磷灰石（nHAP）分別復(fù)合到絲素（SF）納米纖維上，制備出SF/BMP-2，SF/nHAP以及SF/BMP-2/nHAP復(fù)合無紡布基質(zhì)。將hBMSC種植到上述絲素功能基質(zhì)上，負(fù)載有BMP-2的基質(zhì)能夠明顯提高細(xì)胞鈣沉積以及各種骨分化標(biāo)志蛋白的轉(zhuǎn)錄水平上表達(dá)。進(jìn)一步的結(jié)果顯示，同時負(fù)載nHAP和BMP-2的基質(zhì)具有最好的促進(jìn)骨分化的作用。另外，絲素和殼聚糖復(fù)合無紡布基質(zhì)，在骨組織工程中的應(yīng)用也有報道［19］。

4 總結(jié)

通過靜電紡得到的模擬細(xì)胞外質(zhì)的絲素納米纖維能夠廣泛的應(yīng)用修復(fù)醫(yī)學(xué)的各個方面，并有很好的體外細(xì)胞粘附功能，其在人造血管、皮膚創(chuàng)傷修復(fù)以及骨組織工程中的研究受到了廣泛關(guān)注。但靜電紡絲法絲素?zé)o紡布材料在結(jié)構(gòu)與制備等方面仍存在缺陷，不能滿足實際臨床應(yīng)用需求。首先，靜電紡纖維基質(zhì)基本上為二維結(jié)構(gòu)材料，限制了其在體內(nèi)的應(yīng)用，因此，獲得絲素納米纖維多孔支架材料是今后研究的一個重要方向。其次，絲素主要采用甲酸或六氟異丙醇等有機(jī)溶劑溶解制備，這些溶劑具有一定的毒性，因此，探索安全無毒方法制備絲素溶液是非常迫切的。目前科研工作者們著力通過改變靜電紡絲設(shè)備以及優(yōu)化紡絲過程解決上述問題，但收效甚微。利用轉(zhuǎn)基因手段制備水溶性可紡重組絲素蛋白，可為制備安全可靠絲素納米纖維基質(zhì)提供一種新思路和新手段。

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App lication of Electrospun Silk Fibrion Nanofibers in Regenerative M edicine

SHI Li-yang,ZHANG Hai-ping,DENG Lian-xia,ZHU Liang-jun
（Institute ofApplied Bioresources,Zhejiang University,Hangzhou 310058,China）

Electrospinning is a very effectivemethod to fabricate nanofibers.This technique has been achieved more attention due to its cheap cost,simple device and obtaining nanofibers similar to extracellularmatrix.Silk fibroin(SF)is a natural protein with good biodegradability and low immunogenicity,Therefore,it can be widely applied in tissue engineering.In this paper,we summarize the research of electrospun silk fibrion nanofibers in regenerative medicine.Furthermore,the future research work of SF nanofiberswas suggested.

silk fibrion;electrospinning;regenerativemedicine;application

S886.7

：A

0258-4069［2013］04-014-05

施李楊（1991-），男，碩士生。從事蠶絲蛋白生物資源高分子材料研究。E-mail:bshiliyang@126.com

朱良均，男，教授。E-mail:ljzhu@zju.edu.cn