張樹振，金 樑，周 虹，韓春芳，楊 龍，王曉娟

(蘭州大學草地農(nóng)業(yè)科技學院，甘肅 蘭州 730020)

紫花苜蓿(Medicagosativa)屬于異花授粉植物，花粉和種子傳播是影響其遺傳分化的主要因素，遺傳漂變或自然選擇而非遷移或基因流是影響其種群分化的主要因素[1]。與自花授粉植物相比較，異花授粉植物大多數(shù)高頻率的等位基因都出現(xiàn)在種群內部，而種群間相似性較高，差異較小，導致種群間的變異相對小于種群內部[2-3]。異花授粉植物的高度雜合性和異質性，使得在其更新繁殖過程中如何保持其原有的遺傳完整性(Genetic Integrity)成為目前國內外探討的熱點問題[4]。

紫花苜蓿作為多年生豆科牧草，因其營養(yǎng)價值高、適口性好，被譽為“牧草之王”，加之苜蓿具有抗寒、耐旱、耐鹽堿等優(yōu)點，在改善生態(tài)環(huán)境、退耕還草以及調整農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結構中具有重要作用[5]。鑒于此，培育生產(chǎn)品質優(yōu)良、生態(tài)適應性強的苜蓿新品種顯得十分迫切，而利用雄性不育特性獲得雜種優(yōu)勢是培育高產(chǎn)、優(yōu)質、抗逆性強的苜蓿品種的有效途徑[2,6]。研究發(fā)現(xiàn)，紫花苜蓿經(jīng)過兩輪以上的自交會出現(xiàn)嚴重的自交衰退現(xiàn)象[6]，因此，為了獲得保持遺傳完整性的材料用于進一步的研究和育種等，有必要對特定單株材料進行扦插繁殖。其中，莖段扦插是苜蓿最常采用的扦插繁殖方式，對于擴繁優(yōu)良單株用于雜交制種等具有重要意義[7-8]。

影響插穗扦插繁殖效率的因素包括植物自身特性和外部因子，前者包括插穗發(fā)育時期、生長部位及切口處理等，而后者主要包括外源生長調節(jié)劑、栽培基質和環(huán)境因子如溫度、濕度和光照等。研究發(fā)現(xiàn)，苜蓿不同部位莖段和插穗基部切口方式對其扦插克隆效率均具有顯著影響，以中部節(jié)間扦插的效果最好[9]，而插穗發(fā)育時期以現(xiàn)蕾初期扦插成活率最高，達97.2%[10]。與此同時，外源植物生長調節(jié)物質通過促進扦插枝條內部營養(yǎng)物質重新分配和內源激素的表達提高插穗植物細胞內滲透壓、吸水能力和酶活性，進而使細胞順利進行脫分化和再分化，促進插條生根[11]。目前，有關紫花苜蓿扦插繁殖影響因素的報道較少，尚未建立高效成熟的扦插繁殖技術體系。本研究以前期篩選鑒定的紫花苜蓿雄性不育突變體ms1[12]為研究材料，對影響苜蓿插穗成活的外源生長調節(jié)劑和基質配方進行系統(tǒng)研究，并建立苜蓿優(yōu)良種質材料擴繁體系，以期為加快其良種繁育速度提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1供試材料 試驗材料為溫室種植生長兩年的紫花苜蓿雄性不育突變體ms1，于孕蕾初期選取健壯無病植株中部節(jié)間進行試驗。

1.2試驗設計 苜蓿插穗一芽一節(jié)，插穗長度6～7 cm，上部剪成平茬，基部剪成斜茬，不帶葉片[9]。使用前消毒處理育苗盤，扦插深度為3～4 cm。試驗在蘭州大學智能溫室內進行，光照時間16 h·d-1，光照強度>600 μmol·m-2·s-1，白天溫度24～26 ℃，夜間溫度18～20 ℃，相對濕度50%～60%。所有插穗按照溫室常規(guī)管理方法進行，保持基質表面濕潤，試驗期間未發(fā)生病蟲害。

1.2.1不同生長調節(jié)劑及其濃度梯度 選用吲哚丁酸(IBA)、萘乙酸(NAA)和生根粉(ABT)作為苜蓿莖段扦插繁殖生根生長調節(jié)劑，每種生長調節(jié)劑分別設置50、100、150 mg·L-1共計3個濃度，采用蒸餾水作為對照處理(CK)，插穗基部在以上處理液中處理1 h，扦插基質為160 ℃干熱滅菌4 h的蛭石，每個處理設3次重復，每個重復20個插穗。

1.2.2不同栽培基質配比 采用5種栽培基質配方，包括兩種單一基質M1(園土)和M2(蛭石)，以及3種復合基質M3(河沙∶蛭石=1∶1，體積比，下同)、M4(蛭石∶園土∶珍珠巖=3∶1∶1)和M5(園土∶河沙∶珍珠巖=7∶2∶1)。所有基質使用前經(jīng)160 ℃干熱滅菌4 h，插穗采用100 mg·L-1ABT溶液處理1 h。每個處理設3次重復，每個重復20個插穗。

1.3測定指標 扦插30 d后測定各處理條件下苜蓿插穗成活率、生根數(shù)、根長和葉數(shù)量，并按照以下公式計算根系效果指數(shù)[13]：

根系效果指數(shù)=(平均根長×根系數(shù)量×生根率)/生根插穗數(shù)。

1.4數(shù)據(jù)處理 所有數(shù)據(jù)均以平均值±標準誤表示。采用SPSS(v17.0)軟件分別對生長調節(jié)劑和基質處理進行單因素方差分析，采用Duncan新復極差法檢驗處理進行多重比較，P<0.05表示差異顯著。

2 結果

2.1生長調節(jié)劑對紫花苜蓿插穗成活率的影響 不同濃度IBA、NAA和ABT處理后苜蓿插穗的成活率不同，其中，150 mg·L-1ABT處理的插穗成活率最高，達88%，比對照高71.0%，150 mg·L-1IBA處理的插穗成活率最低，僅為35%(圖1)。方差分析表明，50和150 mg·L-1ABT處理的插穗成活率顯著高于其余處理組(P<0.05)，不同濃度的ABT處理插穗的成活率也均顯著高于對照；而不同濃度的IBA處理，除150 mg·L-1IBA處理的插穗成活率顯著低于對照外，其余兩個處理濃度均與對照無顯著差異(P>0.05)。對于NAA處理，除50 mg·L-1NAA處理的插穗成活率與對照無顯著差異外，其余兩個處理濃度下插穗的成活率均顯著高于對照。這說明該濃度梯度下NAA和ABT對紫花苜蓿插穗生根成活的促進作用優(yōu)于IBA。

圖1 不同生長調節(jié)劑處理條件下紫花苜蓿的插穗成活率Fig.1 The survival rate of alfalfa cuttings under different growth regulators treatments

2.2生長調節(jié)劑對紫花苜蓿插穗生長性狀的影響

2.2.1不同濃度IBA、NAA和ABT處理對紫花苜蓿插穗生根數(shù)的影響 除150 mg·L-1NAA處理的成活插穗生根數(shù)高于對照外，其余處理均低于對照，其中以50 mg·L-1IBA處理的扦插成活枝穗的生根數(shù)最少，僅為1.95條，較對照降低112%(表1)。

表1 不同濃度IBA、NAA和ABT處理對紫花苜蓿扦插效果的影響Table 1 Propagation effects of alfalfa cuttings treated by different concentrations of IBA, NAA and ABT

方差分析表明，150 mg·L-1IBA處理插穗的平均生根數(shù)與100 mg·L-1IBA處理無顯著差異(P>0.05)，150 mg·L-1NAA處理的扦插生根數(shù)顯著高于50 mg·L-1IBA處理和100 mg·L-1NAA處理(P<0.05)，其余各處理間無顯著差異。

2.2.2不同濃度IBA、NAA和ABT處理對紫花苜蓿插穗根長的影響 100 mg·L-1IBA和100 mg·L-1NAA處理成活插穗的平均根長最長，為9.96 cm，平均根長最低的是50 mg·L-1IBA處理，僅為5.19 cm(表1)。方差分析表明，150 mg·L-1IBA處理的插穗根長與其它IBA處理間無顯著差異(P>0.05)，50 mg·L-1IBA處理顯著低于100 mg·L-1的IBA處理(P<0.05)；150 mg·L-1NAA處理株的平均根長顯著低于其它NAA處理；而ABT各濃度之間無顯著差異。50 mg·L-1IBA、150 mg·L-1NAA及100 mg·L-1ABT處理對插穗的平均根長均顯著低于對照。

2.2.3不同濃度IBA、NAA和ABT處理對紫花苜蓿插穗葉片數(shù)量的影響 對照處理的葉片數(shù)量高于各生長調節(jié)劑處理，為12.12枚，100 mg·L-1NAA處理插穗的葉片數(shù)量最低，僅為7.00枚(表1)。方差分析顯示，100 mg·L-1IBA處理顯著低于150 mg·L-1IBA處理(P<0.05)，兩者與50 mg·L-1IBA處理均無顯著差異(P>0.05)。NAA各處理濃度之間無顯著差異。100 mg·L-1ABT處理顯著低于其余ABT處理(P<0.05)。100 mg·L-1IBA、100和150 mg·L-1NAA及100 mg·L-1ABT處理插穗的葉片數(shù)量均顯著低于對照。

2.2.4不同濃度IBA、NAA和ABT處理對紫花苜蓿插穗根系效果指數(shù)的影響 對照處理的根系效果指數(shù)最高，為0.82，其次是100 mg·L-1IBA處理，50 mg·L-1IBA處理根系效果指數(shù)最低，僅為0.23(表1)。方差分析表明，除50 mg·L-1IBA和100 mg·L-1ABT處理的根系效果指數(shù)顯著低于對照外(P<0.05)，其余各處理與對照均無顯著差異。

2.3不同基質配方對紫花苜蓿插穗成活率的影響 5種基質配方條件下紫花苜蓿扦插成活率差異較小(圖2)，其中，基質M3上插穗的成活率最高，達79.0%，基質M1插穗成活率最低，為64.7%。統(tǒng)計分析表明，M1、M2、M3、M4和M5這5種扦插基質苜蓿插穗成活率差異不顯著(P>0.05)。

2.4不同基質配方對紫花苜蓿插穗生長性狀的影響

2.4.1不同基質配方對紫花苜蓿插穗生根數(shù)的影響 基質M4上插穗的生根數(shù)最多，達3.76條；基質M3上插穗的生根數(shù)最少，為2.67條(表2)。統(tǒng)計分析表明，基質M2、M3、M4和M5上插穗的生根數(shù)與M1之間均無顯著差異(P>0.05)，M3上插穗的生根數(shù)量顯著低于基質M4和M5(P<0.05)，生根數(shù)量依次為M4>M5>M2>M1>M3。

2.4.2不同基質配方對紫花苜蓿插穗根長的影響 基質M2上成活插穗的根長最長，為6.50 cm，M1上成活插穗的根長最短，僅為4.39 cm(表2)。統(tǒng)計分析表明，基質M2上成活插穗的根長顯著高于M1(P<0.05)，基質M3、M4和M5上插穗的根長與M1或M2之間均無顯著差異(P>0.05)。

圖2 不同基質配方對紫花苜蓿插穗成活率的影響Fig.2 The survival rate of alfalfa cuttings on different substrates

2.4.3不同基質配方對紫花苜蓿插穗葉片數(shù)量的影響 不同扦插基質對插穗葉片數(shù)量影響不同(表 2)，其中基質M5上成活插穗的葉片數(shù)量最多，達9.80枚，基質M2上插穗的平均葉片數(shù)量最少，為7.20枚。統(tǒng)計分析表明，基質M4、M5和M1上插穗的平均葉片數(shù)量均顯著高于基質M2處理(P<0.05)。

2.4.4不同基質配方對紫花苜蓿插穗根系效果指數(shù)的影響 基質M2的根系效果指數(shù)最高，為0.47，其次是基質M4，M1的根系效果指數(shù)最低，為0.28(表2)。統(tǒng)計分析顯示，基質M2的根系效果指數(shù)顯著高于M3和M1(P<0.05)，基質M4和M5的根系效果指數(shù)與M1、M2和M3之間無顯著差異(P>0.05)。

3 討論

扦插繁殖技術不僅能保證在短時間內獲得大量扦插成活苗，而且還能保持植物特有的遺傳性質，是植物無性繁殖的重要方法之一。影響插穗成活生根的因素很多，扦插成活率除受到植物自身的生物學特性、插穗的發(fā)育程度及外界條件(如溫度、濕度、光照等)等因素影響外[14]，處理插穗的生長調節(jié)劑種類和濃度以及扦插基質對插穗成活生根也具有重要的影響[11,15]。不同因素對插穗生根效果不同，潘惠忠[16]研究發(fā)現(xiàn)，植物生長調節(jié)劑種類、濃度、浸泡時間和扦插基質4個因素對桂花(Osmanthusfragrans)生根率的影響大小依次為植物生長調節(jié)劑>浸泡時間>濃度>扦插基質。

表2 不同基質配方對紫花苜蓿扦插效果的影響Table 2 Rooting of alfalfa cuttings on different substrates

3.1植物生長調節(jié)劑對苜蓿扦插效果的影響 適宜的外源生長調節(jié)劑可以促進插穗內部IAA向生根部的運輸，改變IAA/ABA比值，并能在愈傷形成期降低GA含量，使內源激素之間達到一定平衡，進而提高插穗的細胞滲透壓、吸水性和酶活性，使插穗基部的薄壁細胞脫分化，產(chǎn)生愈傷組織，促進不定根的生成，還可促使養(yǎng)分向插穗基部運輸，形成養(yǎng)分吸收中心，從而縮短插穗生根時間、提高生根率、根系質量及移栽成活率[17-18]。耿慧等[8]研究表明，施用IBA-NAA生根劑可明顯縮短苜蓿插穗的發(fā)芽時間，促進生根，提高分枝數(shù)。此外，插穗成活率瑟外源生長調節(jié)劑濃度密切相關。如，當外源生長調節(jié)劑超過一定濃度后，葫蘆茶(Tadehagitriquetrum)插穗成活率隨處理濃度的增加而降低[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，對于NAA而言，除50 mg·L-1NAA處理的插穗成活率與對照無顯著差異外，其余處理均顯著提高插穗成活率(P<0.05)，而IBA處理對苜蓿插穗成活率無顯著促進效應，甚至在150 mg·L-1處理下顯著低于對照處理，這可能是由于植物對外源生長調節(jié)劑的應用濃度范圍要求比較嚴格，且不同生長調節(jié)劑適宜插穗生根的濃度不同，超過一定的量，則會出現(xiàn)毒害現(xiàn)象[19]。因此，在使用植物生長調節(jié)劑時，應嚴格掌握生長調節(jié)劑種類和濃度配比。

本研究發(fā)現(xiàn)，對照與生長調節(jié)劑處理相比，雖然成活率較低，但成活插穗具有較高的生根數(shù)、根長、葉片數(shù)量及根系效果指數(shù)，這與以往研究不同[8,11]。得到以上苜蓿扦插繁殖效果可能存在如下原因：1)未加外源激素誘導而生根的苜蓿插穗具有較強的生長活力和較高營養(yǎng)成分；2)外源生長調節(jié)劑雖然能夠促進內源激素的表達，但不同時期效果不同，如IBA在扦插初期可誘導根源基的發(fā)生，而根源基形成后，則會誘導愈傷組織的大量生成，阻礙根的生長[17,20]。張博等[21]在研究楸樹(Catalpabungei)扦插繁殖中發(fā)現(xiàn)，最佳生根率和最優(yōu)生根性狀不相關，且生根率和產(chǎn)生愈傷組織的插穗個數(shù)之間也未發(fā)現(xiàn)明確的對應關系。

3.2栽培基質對紫花苜蓿扦插效果的影響 栽培基質配方是影響扦插效果的重要因素之一，它的透氣性、透水性都會對插穗的成活與生根產(chǎn)生重要的影響[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，100 mg·L-1ABT處理的苜蓿插穗在不同生長基質中成活率差異不顯著(P>0.05)，這與占正軍等[15]在櫸樹(Zelkovaschneideriana)中的研究結果一致，其原因可能是植物生長調節(jié)劑對插穗生根的影響能力高于基質[16]，施用外源生長調節(jié)劑后基質對插穗生根的影響降低了?；|自身特性和插穗生根效果具有密切聯(lián)系，園土的透氣性差，阻礙插穗不定根的形成，所以園土作為單一基質時，插穗的成活率最低。而河沙和蛭石的混合基質插穗成活率最高，是由于蛭石本身是一種保溫材料，作為扦插基質時有利于提高苗盤內溫度，而且其透氣性好，再加上河沙較好的透水性，能夠避免因基質含水量過高而引起插穗腐爛，所以成活率高。

綜合各種基質對苜蓿插穗生長效果的分析可知，不同基質配方處理對紫花苜蓿插穗的生根數(shù)、根長、葉片數(shù)量及根系效果指數(shù)影響不同。復合基質優(yōu)于單一基質，主要原因是園土中含有一定的營養(yǎng)物質，可保證插穗后續(xù)生長過程中養(yǎng)分的供給，且持水保水能力強并能固定插穗，但透氣性差；蛭石具有透氣保水、含菌量低、離子交換能力強等優(yōu)點，但營養(yǎng)匱乏，固定能力差導致物理性能容易破壞；河沙透氣排水性好，但保溫性能差，缺乏營養(yǎng)；珍珠巖具有較好的透氣保水性能，質輕有利于插穗生根，但其缺乏營養(yǎng)且離子交換能力差；而復合基質可以集合多種基質的優(yōu)點，克服單一基質的不足，既能為苜蓿插穗提供良好的生存環(huán)境，又能保證插穗后期生長的營養(yǎng)供給，進而提高插穗的扦插繁殖效率。

4 結論

本研究發(fā)現(xiàn)，適宜的外源生長調節(jié)劑的施用可以提高紫花苜蓿扦插效率，其中以ABT效果最好，NAA次之，IBA效果最差，而且以150 mg·L-1ABT處理效果最佳。5種栽培基質處理在紫花苜蓿扦插成活率無顯著差異(P>0.05)，但對插穗的后續(xù)生長有一定的影響，混合基質的效果優(yōu)于單一基質，河沙+蛭石成活率最高，園土+蛭石+珍珠巖和園土+河沙+珍珠巖的成活率較高，后續(xù)生長效果好，園土效果最差。

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