韓軍鴿，王程寶，李興彪，范琰琰，馮相平

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)系，浙江溫州 325035；2.皖南醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)院，安徽蕪湖 241002）

·技術(shù)與應(yīng)用·

硅藻硝酸消化法與浮游生物16S rDNA PCR法在溺死鑒定中的比較

韓軍鴿1，王程寶2，李興彪1，范琰琰1，馮相平1

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)系，浙江溫州 325035；2.皖南醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)院，安徽蕪湖 241002）

目的比較和探討硅藻硝酸消化法與浮游生物16S rDNA PCR法在溺死鑒定中的應(yīng)用價值。方法收集40例溫州醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)系2010—2011年受理并證實溺死的鑒定案件，每例案件標(biāo)本包括肺、腎、肝及現(xiàn)場水樣4份樣本，分別運用硅藻硝酸消化法與浮游生物16S rDNA PCR法對標(biāo)本進行檢驗，硅藻硝酸消化法和浮游生物16S rDNA PCR法所需各器官檢材量分別為約20g和2g，現(xiàn)場水樣分別為15mL和1.5mL，從所需檢驗時間以及檢出率等方面進行比較分析。結(jié)果硅藻硝酸消化法檢出硅藻主要為中心硅藻綱和羽紋硅藻綱，浮游生物16S rDNA PCR法可擴增出一條162bp的條帶。平均檢驗每例案件所需的檢驗時間，硅藻硝酸消化法為（95.30±2.78）min，少于浮游生物16S rDNA PCR法（325.33±14.18）min（P＜0.05）。兩種方法對現(xiàn)場水樣及肺樣本的檢出率均為100%，而對肝及腎樣本的檢出率，浮游生物16S rDNA PCR法均為80%，高于硅藻硝酸消化法40%和30%（P＜0.05）。結(jié)論在溺死的法醫(yī)學(xué)鑒定中，應(yīng)根據(jù)具體情況來挑選合適的實驗室檢驗方法。與硅藻硝酸消化法相比，浮游生物16S rDNA PCR法具有檢材用量少、信息量大、特異性高等特點，有一定的推廣和實踐價值。

法醫(yī)病理學(xué)；溺水；16S rDNA；聚合酶鏈反應(yīng)；硝酸消化法；浮游生物；硅藻類

在法醫(yī)學(xué)檢案中，溺死的鑒定始終是法醫(yī)工作者所關(guān)注的重點和難點之一。在實踐中，水中尸體被發(fā)現(xiàn)時常處于晚期腐敗狀態(tài)，此時較有意義的溺死尸體征象多遭到破壞或已消失，單憑尸表征象和尸體解剖很難鑒定溺死。實驗室檢查中，水中尸體器官中的硅藻檢驗一直是鑒定溺死的重要輔助手段，但其在鑒定溺死的可靠性上仍有爭議[1-3]。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展和多學(xué)科技術(shù)的交叉應(yīng)用，國內(nèi)外許多法醫(yī)工作者通過檢驗水中尸體器官中浮游生物16S rDNA PCR法進行溺死的鑒定[4-7]。本研究針對運用國內(nèi)普遍采用的硅藻硝酸消化法與PCR擴增浮游生物16S rDNA V3、V4可變區(qū)序列的方法進行比較分析，為溺死的實驗室檢查方法的選取提供理論依據(jù)，并探討其應(yīng)用價值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象

收集2010—2011年溫州醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)系硅藻實驗室所受理的已確定為溺死案件40例，每例案件標(biāo)本同時包括肺、腎、肝及現(xiàn)場水樣4份樣本。其中男性24例，女性16例，年齡16～58歲。

1.1.2 儀器與試劑

Eppendorf 5804R離心機（德國Eppendorf公司）；UNIVERSAL 32R離心機（德國Hettich公司）；Olympus CX21顯微鏡（日本Olympus公司）；PC-815 PCR儀（日本Astec公司）；電泳儀（北京市六一儀器廠）；Nikon P90數(shù)碼相機（日本Nikon公司）；浮游生物16S rDNA V3、V4可變區(qū)引物[4，6]（上海桑尼生物科技有限公司），其中包括V3引物（AAGAAGAAGATCTGACGGT）和V4引物（GGAGTTAAGCTCCACGCTTT）；濃硝酸（濃度65%～68%）和國產(chǎn)分析純等。

1.2 方法

對40例案件標(biāo)本包括肺、腎、肝及現(xiàn)場水樣4份樣本分別進行硅藻硝酸消化法、浮游生物16S rDNA PCR法兩種方法檢驗。檢驗結(jié)果均用Nikon P90數(shù)碼相機拍照存檔，對送檢器官與現(xiàn)場水樣中的硅藻種類（浮游生物條帶）進行比較確認(rèn)結(jié)果，并記錄每例案件從開始檢驗到結(jié)束所用時間。

1.2.1 硅藻硝酸消化法

取送檢的肺、肝及腎邊緣組織20g，放入1000mL燒杯里剪碎，加入濃硝酸50mL，加熱消化，待冷。以離心半徑10 cm，4 000 r/min，離心15 min，去其上清液，加入蒸餾水，再以離心半徑10 cm，4 000 r/min，離心15min，去其上清液，將沉淀液逐滴滴在載玻片上、烘干、環(huán)氧樹脂封固鏡檢。取送檢現(xiàn)場水樣標(biāo)本15mL用上述同樣方法離心、鏡檢。

1.2.2 浮游生物16S rDNA PCR法

取送檢的肺、肝及腎組織各2g，剪碎并加入4mL雙蒸水后用勻漿器勻漿。勻漿后以離心半徑8 cm，6 000 r/min，離心5 min，取上清液以離心半徑8 cm，12000r/min，離心10min，棄上清液，雙蒸水洗滌1次后，向沉渣中加入5%Chelex-100 150μL，-80℃冷凍60 min，再按Chelex-100法提取DNA。取現(xiàn)場水樣1.5mL，以離心半徑10cm，12000r/min，離心10min，雙蒸水洗滌1次，向沉渣中加入5%Chelex-100 150μL，-80℃冷凍60min，再按Chelex-100法提取DNA[4]。

進行PCR擴增的反應(yīng)體系為10 μL，內(nèi)含200 μmol/L dNTPs，50 mmol/L KCL，10 mmol/L Tris-HCl，1.5mmol/L MgCl2，0.5μmol/L V3引物，0.5μmol/L V4引物，0.5 U Taq DNA聚合酶，0.16 μg/μL小牛血清白蛋白，模板DNA 4μL。PCR熱循環(huán)參數(shù)為：95℃2 min；94℃30 s，60℃40 s，72℃40 s，35個循環(huán)；72℃10min。擴增產(chǎn)物采用聚丙烯酰胺凝膠（T=6%，C=5%）電泳，銀染檢驗。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

計算兩種方法檢驗平均每例案件所用檢驗時間均值，結(jié)果以x ±s表示；比較兩種方法對各器官及現(xiàn)場水樣的檢出結(jié)果并計算檢出率；應(yīng)用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行處理，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 硅藻硝酸消化法與浮游生物16S rDNA PCR法檢測結(jié)果

硅藻硝酸消化法可檢出藻類主要有中心綱圓篩藻屬、中心綱小環(huán)藻屬、羽紋綱舟形藻屬以及羽紋綱棒形藻屬等（圖1），PCR擴增浮游生物16S rDNA法在肺、腎、肝及現(xiàn)場水樣中可見162bp的擴增條帶（圖2）。

2.2 檢驗時間以及檢出率比較結(jié)果

兩種方法檢驗每例案件所用的檢驗時間見表1，硅藻硝酸消化法的檢驗時間少于浮游生物16S rDNA檢驗法，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；兩種方法對各器官及現(xiàn)場水樣的檢出數(shù)（率）見表2，兩種方法對現(xiàn)場水樣及肺的檢出率相同均為100%，而對肝及腎的檢出率，浮游生物16S rDNA檢驗法高于硅藻硝酸消化法，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖2 浮游生物16S rDNA PCR法檢測結(jié)果

表1 兩種方法檢驗每例案件所用的檢驗時間（n=40，x ±s，min）

表2 兩種方法檢驗每例案件的檢出數(shù)（率）［例（%）］

3 討論

浮游生物是指生活于水中而缺乏有效移動能力的漂流生物，其中分有浮游植物及浮游動物[8]。硅藻是廣泛存在于自然界的單細(xì)胞低等浮游植物，以水中含量最為豐富。在溺水過程中，攜帶浮游生物的溺液通過溺水者主動呼吸進入肺泡，使肺泡擴張，造成毛細(xì)血管膜的微小損傷，溺液中微小的浮游生物可穿過損傷的血管膜，進入肺靜脈循環(huán)，再到左心，后隨體循環(huán)到達(dá)全身各器官；而死后再被拋入水中的尸體，雖無主動呼吸，但可通過擴散和滲透的方式使少量的浮游生物進入肺泡而不會隨體循環(huán)進入體內(nèi)其他器官[9]。因此，通過檢驗?zāi)缢勒叻渭捌渌鞴俳M織中的浮游生物種類和數(shù)量，與尸體被發(fā)現(xiàn)現(xiàn)場水樣進行對比，是鑒定溺死的重要輔助手段。本研究通過對40例溺死案例分別運用硅藻硝酸消化法與浮游生物16S rDNA PCR法對現(xiàn)場水樣及溺死尸體不同器官進行對比研究，并探討兩種方法在溺死鑒定中的應(yīng)用價值，為溺死的實驗室檢查方法的選取提供理論依據(jù)。

本研究中，為防止干性溺死、浴室及游泳池內(nèi)溺死等情況對本實驗的影響，故在選取案例時，要確定選取的送檢器官及現(xiàn)場水樣中存在浮游生物，而結(jié)果顯示兩種方法對現(xiàn)場水樣及肺的檢出率相同均為100%，故驗證了所選取的案例的確均為溺死。本研究所采用的硅藻硝酸消化法在檢材需求量、實驗試劑及檢驗步驟等方面是本系硅藻實驗室根據(jù)實際條件及長期實踐的經(jīng)驗總結(jié)，而據(jù)國內(nèi)外報道[10-12]硅藻硝酸消化法的實驗試劑及檢驗步驟基本相同，檢材需求量為5、20、30及50g，可能與各個實驗室條件及要求不同，但檢驗結(jié)果相差不大。據(jù)報道[4-7]，浮游生物16S rDNA PCR法有很多種，檢出率均較高，而在檢材需求量方面具有很大差異，有1 mg、30 mg、1 g及2 g不等。本研究根據(jù)實驗室實際情況采用PCR擴增浮游生物16S rDNA V3、V4可變區(qū)序列的方法，檢材需求量為2g，檢出率與報道[6]基本一致。

在水中尸體的實驗室檢驗方法中，國內(nèi)基層公安系統(tǒng)及司法鑒定機構(gòu)最常用的是硅藻硝酸消化法，因其檢驗時間短（消化能力強、消化時間短）、設(shè)備和試劑經(jīng)濟等優(yōu)點，應(yīng)用已比較成熟，易于操作、推廣普遍，在溺死的法醫(yī)學(xué)鑒定中一直被認(rèn)為是首選的檢驗方法。然而，硅藻硝酸消化法雖在溺死鑒定中發(fā)揮了很大的作用，但隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展和對環(huán)境保護的認(rèn)識，其局限性越來越受到注意：（1）硝酸對硅藻的破壞性強，檢材需求量大，靈敏度低；（2）檢驗過程中會灼傷實驗員，危險性大；（3）檢驗過程中會產(chǎn)生二氧化氮和強酸廢液，環(huán)境污染大；（4）對實驗室潔凈度要求高，影響因素多，故存在假陰性或假陽性。

浮游生物16S rDNA PCR法是利用PCR技術(shù)檢驗水中尸體器官組織內(nèi)是否存在浮游生物16S rDNA標(biāo)記。此法與硅藻硝酸消化法相比較，具有以下優(yōu)勢：（1）檢材需求量小，靈敏度高；（2）檢驗過程安全、環(huán)境污染少；（3）信息量豐富，鑒別能力強，檢出率高；（4）建立地域性浮游生物群落特征多樣性數(shù)據(jù)庫，可應(yīng)用于推斷溺死地點和時間。然而，浮游生物16S rDNA PCR法與硅藻硝酸消化相比，也存在不足之處：（1）檢驗時間相對較長；（2）對實驗人員要求較高，應(yīng)具備一定的分子生物學(xué)專業(yè)背景；（3）檢驗儀器、試劑等投入成本較高；（4）因其靈敏度高，若死者生前長期生活在含浮游生物量高的地區(qū)，會造成較高的假陽性。

4 小結(jié)

在溺死的法醫(yī)學(xué)鑒定中，要根據(jù)具體情況來挑選適當(dāng)?shù)臋z驗方法；與傳統(tǒng)的硅藻硝酸消化法相比，浮游生物16S rDNA PCR法具有檢材用量少、信息含量大、特異性高、抗污染能力強、檢驗范圍廣等優(yōu)點，有一定的推廣和實踐價值。

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（本文編輯：張建華）

Comparative Analysis between Diatom Nitric Acid Digestion Method and Plankton 16S rDNA PCR Method

HAN Jun-ge1,WANG Cheng-bao2,LI Xing-biao1,FAN Yan-yan1,FENG Xiang-ping1
（1.Department of Forensic Medicine,Wenzhou Medical University,Wenzhou 325035,China;2.School of Forensic Medicine,Wannan Medical College,Wuhu 241002,China）

ObjectiveTo compare and explore the application value of diatom nitric acid digestion method and plankton 16S rDNA PCR method for drowning identification.MethodsForty drowning cases from 2010 to 2011 were collected from Department of Forensic Medicine of Wenzhou Medical University. Samples including lung,kidney,liver and field water from each case were tested with diatom nitric acid digestion method and plankton 16S rDNA PCR method,respectively.The Diatom nitric acid digestion method and plankton 16S rDNA PCR method required 20g and 2g of each organ,and 15mL and 1.5mL of field water,respectively.The inspection time and detection rate were compared between the two methods.ResultsDiatom nitric acid digestion method mainly detected two species of diatoms,Centriae and Pennatae,while plankton 16S rDNA PCR method amplified a length of 162bp band.The average inspection time of each case of the Diatom nitric acid digestion method was（95.30±2.78）min less than （325.33±14.18）min of plankton 16S rDNA PCR method（Plt;0.05）.The detection rates of two methods for field water and lung were both 100%.For liver and kidney,the detection rate of plankton 16S rDNA PCR method was both 80%,higher than 40%and 30%of diatom nitric acid digestion method（Plt;0.05）, respectively.ConclusionThe laboratory testing method needs to be appropriately selected according to the specific circumstances in the forensic appraisal of drowning.Compared with diatom nitric acid digestion method,plankton 16S rDNA PCR method has practice values with such advantages as less quantity of samples,huge information and high specificity.

forensic pathology;drowning;16S rDNA;polymerase chain reaction;nitric acid digestion method;plankton;diatoms

DF795.1

A

10.3969/j.issn.1004-5619.2013.05.010

1004-5619（2013）05-0356-04

浙江省教育廳科研資助項目（Y201016768）

韓軍鴿（1977—），女，河南許昌人，博士，講師，主要從事法醫(yī)分子遺傳學(xué)研究及鑒定工作；E-mail：hanjunge@wzmc. edu.cn

2012-11-01）