陳木旺

（麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司，福建 廈門 361006）

引 言

普通的顯微鏡在獲得聚焦處信息的同時(shí)也獲得離焦處的信息，該離焦信息會(huì)影響觀察到的圖像，其效果猶如在聚焦處鋪上了一層“薄紗”，大大降低了圖像的對比度。所謂的共聚焦顯微鏡，可以盡量多地抑制聚焦處之外的雜散光，以保證獲得的圖像僅僅來自樣品聚焦處的信息，即像面和觀察面是完全“共軛”的，去除了“薄紗”的影響，對比度更高，且可分層獲得樣品的信息，也就是光學(xué)共聚焦圖像，獲得樣品多幅連續(xù)的共聚焦圖像，即在不破壞樣品的情況下可用這些二維共聚焦圖像重建出樣品的三維圖像，非常適合于活體觀察，并已成為生物醫(yī)學(xué)、材料科學(xué)和半導(dǎo)體等領(lǐng)域的重要研究工具。目前除了傳統(tǒng)的激光掃描共聚焦顯微鏡（laser scanning confocal microscopy，LSCM）之外，還有碟片共聚焦顯微鏡（spinning－disk confocal microscopy，SDCM）和結(jié)構(gòu)光顯微鏡（structured illumination microscopy，SIM）。

1 激光掃描共聚焦技術(shù)原理及其特點(diǎn)［1］

激光掃描共聚焦顯微鏡，是在普通顯微鏡的基礎(chǔ)上增加了“共聚焦技術(shù)”和“激光掃描技術(shù)”。共聚焦技術(shù)，就是在共聚焦顯微鏡的光路中設(shè)置了兩個(gè)共聚焦針孔，即照明針孔和探測器針孔，并與樣品上的聚焦點(diǎn)共軛。具體原理如圖1所示，激光光源發(fā)出的激光束，通過照明針孔后成為點(diǎn)光源，經(jīng)物鏡成像在樣品上為一個(gè)聚焦點(diǎn)，從聚焦點(diǎn)發(fā)出（或反射）的光反方向經(jīng)物鏡成像在探測器針孔處，也就是說，放置在探測器針孔后面的探測器只能接收來自聚焦點(diǎn)的光，減少了非聚焦處雜散光的干擾，從而提高獲得圖像的對比度。這就是一個(gè)點(diǎn)物體的共聚焦成像原理，需要配合對樣品的逐點(diǎn)掃描才能實(shí)現(xiàn)樣品的二維共聚焦成像。一般采用激光掃描技術(shù)實(shí)現(xiàn)對樣品的二維掃描成像，即在光路中安裝兩個(gè)檢流鏡，其轉(zhuǎn)動(dòng)角度可控制，分別用于控制光束對樣品進(jìn)行X和Y 方向的逐點(diǎn)掃描成像，以獲得樣品某個(gè)深度的共聚焦圖像，改變載物臺(tái)的軸向（Z 方向）位置，并獲得一系列樣品不同深度的共聚焦圖像，即可在不破壞樣品的情況下對樣品進(jìn)行三維重建，實(shí)現(xiàn)樣品的三維觀察。

LSCM 的橫向分辨率接近于普通顯微鏡的2倍，軸向分辨率可達(dá)到幾百納米。雖然如此，但由于存在共聚焦針孔，抑制了絕大部分的雜散光，使得探測器接收到信號很微弱，需要高靈敏度的光電倍增管PMT 作為探測器，但其量子效率低，獲得的圖像信噪比低；另外，由于采用逐點(diǎn)掃描成像，成像時(shí)間長，結(jié)構(gòu)也比較復(fù)雜，還需要高成本的激光作為光源。

圖1 LSCM 的原理Fig.1 Principle of LSCM

2 碟片共聚焦技術(shù)原理及其特點(diǎn)［2］

LSCM 是基于單光束掃描成像，效率低，成像速度過慢，不利于活體的觀察。碟片共聚焦顯微鏡是基于多光束掃描的方法，速度大大地提高，可以實(shí)時(shí)成像。其具體原理如圖2所示，在樣品聚焦平面的共軛面上放置一個(gè)可以旋轉(zhuǎn)的碟片，碟片上開有很多針孔陣列，光源發(fā)出的光經(jīng)過這些針孔后形成許多點(diǎn)光源，經(jīng)過物鏡成像在樣品的聚焦平面上，從樣品聚焦點(diǎn)發(fā)出（或反射）的光反方向經(jīng)過物鏡成像后又聚焦到原來的針孔上（即碟片上的針孔同時(shí)充當(dāng)照明針孔和探測器針孔），通過45o分光鏡后成像在面陣探測器上，這樣可以同時(shí)多個(gè)點(diǎn)成像，再配合碟片的高速旋轉(zhuǎn)，可以實(shí)現(xiàn)快速的二維成像。用碟片上的微透鏡陣列提高照明效率，以進(jìn)一步提高成像速度［2］。

相對于LSCM，由于多點(diǎn)成像，探測器的積分時(shí)間可以比較長，且采用面陣圖像傳感器如CCD，其量子效率比較高，獲得的圖像信噪比也會(huì)比較高，不需要激光作為光源；多點(diǎn)成像也帶來些不足，一是雜散光會(huì)通過鄰近的針孔進(jìn)入面陣探測器，降低圖像的對比度，影響分辨率；二是碟片的針孔大小是固定的，不像LSCM 的探測器針孔是可以調(diào)節(jié)的，也就不能改變分辨率；三是系統(tǒng)更復(fù)雜、昂貴。

圖2 SDCM 的原理Fig.2 Principle of SDCM

3 結(jié)構(gòu)光顯微技術(shù)原理及其特點(diǎn)

結(jié)構(gòu)光顯微鏡SIM 是將結(jié)構(gòu)光測量方法應(yīng)用到共聚焦測量中的一種顯微鏡。它是在落射顯微鏡基礎(chǔ)上增加照明調(diào)制功能，即在照明光路中插入一個(gè)空間光調(diào)制器（如光柵），見圖3所示，照明受到光柵調(diào)制后經(jīng)物鏡投影在樣品上，在樣品的聚焦平面上將受到調(diào)制照明的照射，而在遠(yuǎn)離聚焦平面處則不被調(diào)制，受調(diào)制的聚焦平面信息和不受調(diào)制的非聚焦平面信息將同時(shí)進(jìn)入成像探測器，改變照明的調(diào)制相位并成像，獲得一組不同調(diào)制相位的圖像，如圖4（a）所示，采用相移算法可以算出聚焦層的圖像即共聚焦圖像［3－4］，如圖4（b）所示。

圖3 SIM 的光路圖Fig.3 Optical layout of SIM

圖4 SIM 的原理Fig.4 Principle of SIM

該方法只需獲得3幀調(diào)制圖像即可重建出一幅共聚焦圖像，且采用的是面陣相機(jī)，速度可以大大地提高。實(shí)現(xiàn)也簡單：硬件上只需增加照明調(diào)制及相移功能，可以采用空間光調(diào)制器如數(shù)字微鏡陣列（DMD）來實(shí)現(xiàn)［5］，再配合軟件上簡單的相移算法，即可在普通的落射顯微鏡上獲得共聚焦圖像。Maryland大學(xué)的Adam Puche博士對該技術(shù)與LSCM 的性能進(jìn)行了比較測試，見圖4所示，表明SIM 獲得的圖像質(zhì)量接近于LSCM［4］；且該技術(shù)也不需要采用激光作為光源，成本低，也被稱為“窮人的共聚焦顯微鏡”。

4 結(jié) 論

從上述的三種共聚焦顯微鏡的原理及其技術(shù)特點(diǎn)來看，LSCM 雖然具有分辨率最高，且軸向分辨率可調(diào)整的優(yōu)點(diǎn)，但是其成像速度慢、信噪比也不高、系統(tǒng)復(fù)雜且昂貴，在一定程度上限制了其應(yīng)用，特別是不能用于活體觀察；SDCM 的成像速度快，可以實(shí)時(shí)成像，但其分辨率有所降低，軸向分辨率不可調(diào)，系統(tǒng)復(fù)雜，價(jià)格昂貴；而SIM 具有實(shí)現(xiàn)簡單，成本低廉，且成像質(zhì)量接近于LSCM，速度較LSCM 快，性價(jià)比較高。

圖4 SIM 和LSCM 獲得切層圖像比較Fig.4 Comparison of optical section image between SIM and LSCM

［1］ PAWLEY J B.Handbook of biological confocal microscopy［M］.Madison：University of Wisconsin，2006：207－219，221－237.

［2］ WANG E，BABBEY C M，DUNN K W.Performance comparison between the high－speed Yokogawa spinning disc confocal system and single－point scanning confocal systems［J］.J Microscopy，2005，218（2）：148－159.

［3］ QIOPTIQ.OptiGrid structured－illumination microscopy［EB／OL］.［2012－06－18］.http：∥www.aic－imagecentral.com／products／pdfs／OptiGrid＿Brochure.pdf.

［4］ PUCHE A.Independent resolution test of OptiGrid structured light imaging system［EB／OL］.［2012－06－18］.http：∥www.qioptiq.com／download／OptiGrid%20Resolution%20Comp.pdf.

［5］ 官志超，張運(yùn)波，侯文玫.基于數(shù)字微鏡的共焦顯微系統(tǒng)的光路設(shè)計(jì)［J］.光學(xué)儀器，2011，33（3）：53－61.