符運(yùn)良，林 紅

（海南師范大學(xué) 物理與電子工程學(xué)院，海南 ?？?571158）

引 言

基于表面等離子共振（surface plasmon resonance，SPR）原理的生物傳感技術(shù)是一種先進(jìn)的光學(xué)生物化學(xué)檢測(cè)技術(shù)，近幾年來，該生物化學(xué)傳感檢測(cè)技術(shù)在監(jiān)測(cè)生物分子之間的結(jié)合反應(yīng)方面有著廣泛的應(yīng)用［1］，該傳感檢測(cè)技術(shù)與傳統(tǒng)的生化分析方法（如液相色譜等）相比，具有檢測(cè)時(shí)間少、檢測(cè)樣品無需任何標(biāo)記、檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、檢測(cè)靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，并且還能夠?qū)崿F(xiàn)在線、實(shí)時(shí)連續(xù)檢測(cè)。目前，基于表面等離子共振檢測(cè)技術(shù)還在生物科技、藥物篩選、環(huán)境檢測(cè)、食品檢測(cè)等多個(gè)領(lǐng)域，成為最具發(fā)展?jié)摿Φ纳瘷z測(cè)方法之一［2－5］。國(guó)內(nèi)已有多家單位設(shè)計(jì)、研制基于SPR 的生化傳感器，而可靠性能高、便攜式SPR 生化傳感器［6－7］，是SPR 生化分析儀發(fā)展的方向。以河南農(nóng)業(yè)大學(xué)迅捷公司生產(chǎn)的HPSPR－6000生化分析儀為例，對(duì)儀器的工作原理、技術(shù)參數(shù)等方面進(jìn)行介紹，同時(shí)介紹其在磺胺二甲嘧啶抗原與抗體結(jié)合反應(yīng)檢測(cè)中的應(yīng)用結(jié)果。

1 SPR原理

SPR 原理如圖1所示，光源發(fā)出的單色光，經(jīng)過TM 波偏振器（圖中未標(biāo)）產(chǎn)生的偏振光經(jīng)過耦合棱鏡，照射到金膜表面上，金膜表面另一側(cè)流有被測(cè)樣品（液體、氣體等），反射光信號(hào)由線陣列CCD 檢測(cè)。由于光照射，在金膜表面將產(chǎn)生表面等離子波，當(dāng)表面等離子波與入射光波在平行表面分量相等時(shí)，發(fā)生等離子諧振，導(dǎo)致反射光強(qiáng)減少，導(dǎo)致CCD 檢測(cè)器接收到的光強(qiáng)度急劇下降，形成一條黑線，則為SPR 共振峰，被檢信號(hào)可通過數(shù)模轉(zhuǎn)換后由計(jì)算機(jī)顯示輸出。

對(duì)于生物分子的識(shí)別檢測(cè)或分子之間的動(dòng)態(tài)反應(yīng)程度檢測(cè)，首先在芯片表面固定一層生物分子識(shí)別膜，如果樣品中有能夠與芯片表面的生物分子識(shí)別膜相互作用的分子，由于結(jié)合反應(yīng)，就會(huì)引起表面物質(zhì)折射率變化，從而導(dǎo)致反射光強(qiáng)變化。通過實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)SPR 傳感器反射光強(qiáng)變化過程，可獲得生物分子動(dòng)態(tài)結(jié)合或解離過程，可以獲得被分析物的濃度、親和力、動(dòng)力學(xué)常數(shù)和特異性等信息［8］。HPSPR－6000生物分析儀采用Kretschmann結(jié)構(gòu)構(gòu)建高精度光學(xué)傳感系統(tǒng)，光源為L(zhǎng)ED 光源，波長(zhǎng)為850nm，并把上述光源、TM 偏振器、棱鏡、信號(hào)檢測(cè)轉(zhuǎn)換等器件集成在一個(gè)黑色盒子里（如圖2所示），以消除外界雜散光對(duì)檢測(cè)信號(hào)的影響。

圖1 SPR 傳感器原理圖Fig.1 Schematic of SPR sensor

圖2 SPR 傳感器集成器件Fig.2 Integrated component of SPR sensor

圖3 SPR 傳感器結(jié)構(gòu)圖Fig.3 Schematic illustration of SPR sensor

2 技術(shù)參數(shù)

HPSPR－6000生化分析儀由液體動(dòng)力系統(tǒng)、進(jìn)樣系統(tǒng)、模式選擇系統(tǒng)和檢測(cè)系統(tǒng)4部分組成，其結(jié)構(gòu)如圖3所示。

2.1 動(dòng)力系統(tǒng)

HPSPR－6000生化分析儀的動(dòng)力系統(tǒng)的動(dòng)力源為蠕動(dòng)泵，蠕動(dòng)泵的工作控制面板如圖4所示，通過觸摸按鍵，實(shí)現(xiàn)蠕動(dòng)泵右轉(zhuǎn)和左轉(zhuǎn)的功能選擇，以及轉(zhuǎn)速的選擇，轉(zhuǎn)速以數(shù)字方式顯示在控制面版上。另外，還可實(shí)現(xiàn)蠕動(dòng)泵暫停和加速，使用非常方便。它的作用是為三個(gè)樣品流通通道的樣品流動(dòng)提供動(dòng)力，當(dāng)生物分子樣品流經(jīng)檢測(cè)芯片表面時(shí)，進(jìn)而研究分子間的相互作用或溶液的濃度。樣品流動(dòng)系統(tǒng)是一種高精密的進(jìn)樣控制系統(tǒng)，樣品流速可控制在0.006～29mL／min。

圖4 蠕動(dòng)泵工作控制面板Fig.4 Control panel of peristaltic pump

圖5 功能選擇菜單Fig.5 Menu of function selection

2.2 樣品處理系統(tǒng)

樣品處理系統(tǒng)的主要功能是將被測(cè)液體樣品注入到流通池中，HPSPR－6000生化分析儀采用內(nèi)置樣品架，連接三條微型軟管，構(gòu)成三通道進(jìn)樣系統(tǒng)。當(dāng)蠕動(dòng)泵工作時(shí)，通過微型軟管，將液體樣品注入到流通池中，采用自動(dòng)進(jìn)樣工作方式，儀器具有自動(dòng)化、智能化。另外，將分析測(cè)試后的液體樣品，也通過微型軟管回收到廢液瓶中。

2.3 工作通道選擇

HPSPR－6000生化分析儀有三個(gè)工作通道，通過功能菜單選擇其中某個(gè)通道為工作通道，使液體樣品在該通道中流動(dòng)及檢測(cè)。另外，為了消除背景噪聲對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，也可以選兩個(gè)通道，其中一個(gè)通道內(nèi)流通被測(cè)液體樣品，作為信息通道，另外一個(gè)通道流通基質(zhì)樣品，作為參考通道，信息通道響應(yīng)扣除參考通道響應(yīng)，即可得到精確的液體樣品結(jié)合反應(yīng)響應(yīng)。

2.4 檢測(cè)系統(tǒng)

檢測(cè)系統(tǒng)是HPSPR－6000生化分析儀的主要核心，檢測(cè)芯片是在玻璃基片上鍍一層50nm 厚的金膜，形成裸金片，根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求，在裸金片表面可固定羧甲基化、氨基端等不同功能分子層。HPSPR－6000生化分析儀將芯片固定在集成盒子邊上，然后將芯片連接在檢測(cè)元件上，檢測(cè)的樣品折射率范圍為1.30～1.36。

2.5 檢測(cè)和分析軟件

HPSPR－6000生化分析儀配套軟件分為在線檢測(cè)軟件和分析軟件，對(duì)于在線檢測(cè)軟件，可通過菜單進(jìn)行選擇實(shí)現(xiàn)某個(gè)功能，如圖5所示。如選擇、傳感器、通訊和測(cè)試菜單，選擇菜單下又有通道、曲線、分析方法、累加次數(shù)等子菜單功能，通道子菜單可以選擇檢測(cè)通道，等等。另外，將檢測(cè)到的樣品信號(hào)同步呈現(xiàn)在LCD 界面上，形成直觀的檢測(cè)SPR 曲線。分析軟件對(duì)檢測(cè)軟件生成的數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)傳送保存，并對(duì)生物分子之間進(jìn)行動(dòng)力學(xué)和相關(guān)性分析，計(jì)算出不同生物分子之間的結(jié)合和解離常數(shù)。

3 SPR生化分析儀在藥物殘留檢測(cè)中的應(yīng)用

免疫特異性結(jié)合反應(yīng)檢測(cè)是表面等離子共振傳感器應(yīng)用最多的檢測(cè)手段之一［9－10］，用HPSPR－6000生化分析儀檢測(cè)了磺胺二甲嘧啶抗體與其衍生物的特異性結(jié)合，方法步驟為：首先在芯片表面自組裝一層單分子膜磺胺二甲嘧啶－BSA，SPR 生化分析儀傳感響應(yīng)曲線如圖6所示。（1）傳感器初始化后，點(diǎn)擊“標(biāo)定”，出現(xiàn)SPR 曲線，曲線穩(wěn)定后，向芯片表面流動(dòng)注入1mol／L的11－巰基十一烷酸，時(shí)間約2h，待信號(hào)穩(wěn)定后，用PBS緩沖液沖洗，從而使芯片表面羧基化；（2）將0.4mol／L EDC和0.1mol／L NHS（1∶1，體積比）混合后，注入芯片表面，流速為10μL／min，活化芯片表面的羥基，形成活性酯，SPR 信號(hào)上升，如圖6中的1所示。用PBS 緩沖液注入沖洗表面，SPR 信號(hào)下降；（3）將磺胺二甲嘧啶－BSA 用醋酸緩沖液（pH＝4.4）1∶50倍稀釋，以10μL／min流速注入芯片中，結(jié)合信號(hào)上升，如圖6中的2所示，用PBS緩沖液沖洗，這樣抗原便固定在芯片表面上；（4）將1mol／L 乙醇胺（pH＝8.5）以10μL／min的流速注入，滅活封閉芯片表面上末被蛋白結(jié)合的活性位點(diǎn)，如圖6中的3所示，以PBS緩沖液沖洗，信號(hào)強(qiáng)度回到基線，如圖6中的4所示，這樣完成分子識(shí)別膜的制備。

抗體濃度以PBS緩沖液稀釋100倍，與磺胺二甲嘧啶樣品（濃度4.5ng／mL）混合，以10μL／min 流速注入芯片表面，芯片表面抗原與抗體發(fā)生抑制免疫結(jié)合反應(yīng)，SPR 信號(hào)上升，如圖6中的5所示，放大曲線如圖7所示，基線響應(yīng)值為23 600IU（intensity unit），樣品流入表面，響應(yīng)值為24 730IU，結(jié)合響應(yīng)值為1 130IU。從圖7，當(dāng)被測(cè)樣品濃度較低時(shí)，在反應(yīng)起始的一段時(shí)間內(nèi)，相對(duì)響應(yīng)值與時(shí)間近似呈線性關(guān)系。

圖6 芯片表面固定磺胺二甲嘧啶－BSAFig.6 Immobilization of SMT－BSA

圖7 抗原與抗體的結(jié)合反應(yīng)Fig.7 The inhibition response SPR curve

圖8 磺胺二甲嘧啶連續(xù)檢測(cè)響應(yīng)曲線Fig.8 Sensorgram of continuous detection for sulfamethazine（SM2）

利用連續(xù)檢測(cè)的方法對(duì)磺胺二嘧啶進(jìn)行了檢測(cè)。三個(gè)不同濃度磺胺二甲嘧啶與抗體混合后，依次流過芯片表面，兩個(gè)混合物之間交替注入PBS緩沖液，所得到的連續(xù)檢測(cè)曲線如圖8所示，混合物中磺胺二甲嘧啶樣品與抗體結(jié)合，剩余的抗體與芯片表面的抗原結(jié)合，SPR 響應(yīng)曲線上升，當(dāng)注入緩沖液后，抗體從芯片表面解離，但是由于解離的速度緩慢，對(duì)應(yīng)于SPR 響應(yīng)曲線平緩區(qū)。連續(xù)檢測(cè)是基于一定濃度的抗體與固定在芯片表面的磺胺二甲嘧啶抗原結(jié)合所得相對(duì)響應(yīng)值與時(shí)間近似呈線性關(guān)系，而且樣品濃度在較小的一定范圍內(nèi)，樣品濃度的連續(xù)檢測(cè)，對(duì)于減少芯片的再生過程，減少檢測(cè)時(shí)間具有重要的作用。

當(dāng)樣品中含有磺胺二甲嘧啶時(shí)，與磺胺二甲嘧啶抗體結(jié)合，則抑制抗體與芯片表面的抗原結(jié)合，導(dǎo)致結(jié)合值減少，SPR 信號(hào)響應(yīng)下降，磺胺二甲嘧啶樣品濃度越大，抑制抗體與芯片表面抗原的結(jié)合的能力越強(qiáng)，結(jié)合值就越少，檢測(cè)到的SPR 信號(hào)響應(yīng)越小。因此，通過競(jìng)爭(zhēng)抑制反應(yīng)的結(jié)合值與磺胺二甲嘧啶樣品濃度之間的關(guān)系，便可得到濃度抑制的標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線，當(dāng)檢測(cè)到某濃度的結(jié)合響應(yīng)值時(shí)，由標(biāo)準(zhǔn)曲線便可得到某磺胺二甲嘧啶樣品的濃度。

4 結(jié) 論

以HPSPR－6000生化分析儀為例，介紹了其工作原理、技術(shù)參數(shù)、結(jié)構(gòu)組成和各部分的功能，并用分析儀得到芯片表面生長(zhǎng)磺胺二甲嘧啶—BSA 分子識(shí)別膜過程的SPR 響應(yīng)信號(hào)，并用抗原與抗體之間的免疫特異性結(jié)合，檢測(cè)了反應(yīng)響應(yīng)曲線。HPSPR－6000生化分析儀使用方便、操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)靈敏度高、結(jié)果準(zhǔn)確，對(duì)于生化分子之間的動(dòng)力反應(yīng)過程研究是一種較好的儀器。

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