邱文英，郝偉偉，徐 靜，方鵬飛，張 洪，向丕元

（四川省華派生物制藥有限公司，四川 簡(jiǎn)陽(yáng) 641400）

豬喘氣病，又名豬地方性肺炎，是由豬肺炎支原體引起的慢性接觸性呼吸道疾病。豬肺炎支原體感染豬后將引起豬的肺部損傷，使之表現(xiàn)出咳嗽和氣喘等癥狀。豬肺炎支原體和豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）共同感染時(shí)，由于PRRSV可以造成豬的免疫抑制，因而加劇肺部癥狀，使疾病進(jìn)一步惡化。

豬肺炎支原體P46基因全長(zhǎng)為1260bp，編碼419個(gè)氨基酸（46kD）。編碼的P46蛋白是豬肺炎支原體的表面抗原，可引起機(jī)體對(duì)豬肺炎支原體的早期免疫反應(yīng)。P46基因序列中有3個(gè)編碼Trp的密碼子TGA，而在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中TGA為終止子，因此要使P46基因在大腸桿菌中順利地表達(dá)有兩種方法：一是將編碼Trp的密碼子TGA突變?yōu)門GG；二是構(gòu)建通讀TGA的表達(dá)系統(tǒng)。由于構(gòu)建通讀TGA的表達(dá)系統(tǒng)較困難且表達(dá)量較低，而定點(diǎn)突變法更為簡(jiǎn)單，因此定點(diǎn)突變方法被更多人采用。

本文通過(guò)重疊延伸PCR法（SOE-PCR）將P46基因中的3個(gè)密碼子TGA定點(diǎn)突變?yōu)門GG，從而使P46基因能在大腸桿菌中順利地進(jìn)行表達(dá)，為P46重組蛋白的獲得及豬肺炎支原體的診斷檢測(cè)奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒 含豬肺炎支原體SC株P(guān)46基因的pEasy-P46質(zhì)粒由四川省華派生物制藥有限公司克隆及保存。

1.2 試劑 PCR Master Mixture、小量DNA回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司，DNA Marker、pEasy-T載體購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。其余試劑均為分析純。

1.3 定點(diǎn)突變引物設(shè)計(jì) 根據(jù)豬肺炎支原體SC株P(guān)46測(cè)序結(jié)果及重疊延伸PCR原理，設(shè)計(jì)1對(duì)全長(zhǎng)引物及3對(duì)突變引物用于將TGA定點(diǎn)突變?yōu)門GG。引物序列見表1。

表1 P46基因全長(zhǎng)引物及突變引物序列

1.4 SOE-PCR定點(diǎn)突變 采用SOE-PCR法進(jìn)行定點(diǎn)突變的操作過(guò)程（見圖1）如下：首先以pEasy-P46質(zhì)粒為模板，分別以F1和RB，F(xiàn)B和R1兩對(duì)引物擴(kuò)增得到2段PCR產(chǎn)物D和E，D、E經(jīng)切膠純化后作為模板，以F1和R1為引物擴(kuò)增得到B位點(diǎn)已突變的P46基因；再以B位點(diǎn)已突變的P46基因?yàn)槟０?，以F1和RA，F(xiàn)A和RC，F(xiàn)C和R1為引物擴(kuò)增得到3段PCR產(chǎn)物F、G、H，并將PCR進(jìn)行切膠純化；以純化后的F、G作為模板，以F1和RC為引物擴(kuò)增得到PCR產(chǎn)物I并進(jìn)行切膠純化；以純化后的I、H為模板，以F1和R1為引物擴(kuò)增即可得到A、B、C 3個(gè)位點(diǎn)均突變的P46基因。

圖1 重疊延伸PCR定點(diǎn)突變示意圖

1.5 克隆及測(cè)序 將SOE-PCR產(chǎn)物進(jìn)行切膠純化后與pEasy-T載體連接，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，根據(jù)《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》進(jìn)行陽(yáng)性克隆菌落的篩選，挑取白斑進(jìn)行PCR鑒定。將鑒定為陽(yáng)性的質(zhì)粒送往上海英濰捷基生物技術(shù)有限公司測(cè)序，經(jīng)測(cè)序鑒定的陽(yáng)性質(zhì)粒命名為pEasy-P46m。

2 結(jié)果

圖2 PCR產(chǎn)物D、E瓊脂糖凝膠電泳

圖3 PCR產(chǎn)物F、G和H瓊脂糖凝膠電泳

圖4 PCR產(chǎn)物I瓊脂糖凝膠電泳

2.1 SOE-PCR定點(diǎn)突變 在使用重疊延伸PCR對(duì)3個(gè)TGA密碼子進(jìn)行突變的過(guò)程中共進(jìn)行了8次PCR，其產(chǎn)物D、E片段大小分別為303bp和957bp，產(chǎn)物F、G、H片段大小分別為210bp、552bp和498bp，產(chǎn)物I片段大小為752bp。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳（見圖2、3、4），結(jié)果表明這些片段大小與預(yù)期結(jié)果相符。

2.2 克隆及測(cè)序 重疊延伸PCR進(jìn)行定點(diǎn)突變后，將突變的P46基因克隆至T載體中并測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明，P46基因中原有的3個(gè)TGA密碼子成功地突變?yōu)門GG（見圖5、6、7）。

圖5 A處堿基A定點(diǎn)突變?yōu)镚

圖6 B處堿基A定點(diǎn)突變?yōu)镚

圖7 C處堿基A突變?yōu)镚

3 討論

1989年，Horton等成功建立了重疊延伸PCR（SOEPCR）法，并應(yīng)用此技術(shù)成功構(gòu)建了一種雜交基因。利用SOE-PCR不僅能對(duì)基因進(jìn)行定點(diǎn)突變，還實(shí)現(xiàn)了大片段的插入及刪除。本研究利用SOE-PCR對(duì)豬肺炎支原體SC株的P46基因進(jìn)行了定點(diǎn)突變，使其中3個(gè)編碼Trp的密碼子TGA定點(diǎn)突變?yōu)門GG。

早前就有利用SOE-PCR對(duì)豬肺炎支原體P46基因進(jìn)行定點(diǎn)突變的報(bào)道。利用SOE-PCR進(jìn)行P46基因定點(diǎn)突變的過(guò)程中，多采用突變引物分段擴(kuò)增后再順次連接的方法。由于在分段擴(kuò)增過(guò)程中，第2擴(kuò)增片段小于100bp，就使得PCR產(chǎn)物的純化及回收存在一定的難度。本研究先進(jìn)行了B位點(diǎn)的定點(diǎn)突變，獲得B位點(diǎn)已突變的P46基因后，再進(jìn)行A位點(diǎn)和C位點(diǎn)的定點(diǎn)突變，這就可以避免由于小片段PCR產(chǎn)物純化所造成的困難。

用豬肺炎支原體表面膜蛋白P46檢測(cè)抗原時(shí)具有很好的特異性和敏感性，由此基于P46蛋白的血清學(xué)檢測(cè)方法可以用于對(duì)豬肺炎支原體的特異性檢測(cè)。本研究成功地對(duì)P46基因進(jìn)行了定點(diǎn)突變，使P46基因可以在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)，為P46重組蛋白的表達(dá)及豬肺炎支原體的檢測(cè)診斷奠定了基礎(chǔ)。

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