羅素慧，張緒梅，黃國(guó)偉

（天津醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生教研室，天津300070）

腦血栓、腦梗死、腦血管痙攣等缺血缺氧性腦損傷在臨床上常見(jiàn)，其發(fā)病率、致殘率和致死率均較高。尤其是發(fā)生于宮內(nèi)和新生兒期的缺血缺氧性腦損傷，是造成腦癱、癲癇及智力低下的重要原因。近年來(lái)研究表明，神經(jīng)細(xì)胞凋亡在腦缺血缺氧損害中發(fā)揮著重要作用，是缺血缺氧性腦損傷的重要機(jī)制之一[1]。有研究報(bào)道，低氧促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞（NSCs）的存活增殖，長(zhǎng)期缺氧則誘導(dǎo)NSCs的凋亡[2]。目前，缺血缺氧對(duì)NSCs凋亡影響的機(jī)制尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)將通過(guò)體外分離培養(yǎng)新生SD大鼠的海馬NSCs，探討缺氧對(duì)NSCs凋亡的影響及分子機(jī)制，為臨床預(yù)防和治療缺血性腦病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 24h內(nèi)同窩新生SD大鼠，購(gòu)自中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.2 主要試劑 DMEM培養(yǎng)液、L-谷氨酰胺；F12和B27添加劑（美國(guó)Gibco公司）；堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（basic fibroblast growth facter,bFGF）、表皮生長(zhǎng)因子（epidermal growth factor,EGF,Perotech公司）；山羊抗小鼠IgG、山羊抗兔IgG/辣根酶標(biāo)記，兔抗大鼠多克隆抗體Caspase-3(北京中杉金橋科技公司)；小鼠抗Bcl-2，小鼠抗Bax多克隆抗體（Cell signaling technology公司）；小鼠抗大鼠單克隆抗體βactin IgG、ECL發(fā)光試劑盒（Santa Cruz公司）；BCA蛋白定量試劑盒（武漢博士德生物公司）；Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（南京凱基生物科技公司）；Rhodamine123(Sigma公司)。

1.1.3 儀器 3111型CO2水套培養(yǎng)箱（Thermoelectroncorporation，美國(guó)），VD-1320型超凈工作臺(tái)（哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)公司），低溫高速離心機(jī)（Sigma），DYY-III8A穩(wěn)壓穩(wěn)流定時(shí)電泳儀（北京六一儀器廠），BD FACSCalibur流式細(xì)胞儀（美國(guó)Becton-Dickin－son公司），DYCZ-40D型迷你轉(zhuǎn)移槽（北京六一儀器廠），化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)MLTRA.LUM. Inc）。

1.2 方法

1.2.1 NSCs原代分離、培養(yǎng) 將新生SD大鼠用75%酒精浸泡15s，快速在超凈臺(tái)中取出腦組織，用手術(shù)鑷分離大腦半球，分離大腦皮層取出海馬，放入盛有HBSS緩沖液的無(wú)菌培養(yǎng)皿中，并用HBSS緩沖液洗2遍，DMEM/F12培養(yǎng)液洗一遍，剪碎成0.5mm×0.5mm小塊，用玻璃吸管反復(fù)吹打，細(xì)胞篩網(wǎng)（0.76μm）過(guò)濾，制成細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液離心（800r/min）5min，去除上清液，加入培養(yǎng)液（DMEM/F12、EGF 20μg/L、bFGF 20μg/L、L-谷氨酰胺2mmol/L、2%B27、青霉素和鏈霉素100U/mL），細(xì)胞計(jì)數(shù)，以5×105/mL的密度接種于培養(yǎng)瓶。置37℃、5%CO2孵育箱中培養(yǎng)，隔天換液，倒置顯微鏡下觀察。

1.2.2 分組情況 將分離出的新生鼠NSCs分為2組：正常對(duì)照(NC)組、缺氧模型(Hyp)組。

1.2.3 缺氧模型建立 正常條件下（37℃、5%CO2）培養(yǎng)NSCs，于增殖第3天，將缺氧組細(xì)胞放入三氣培養(yǎng)箱進(jìn)行缺氧培養(yǎng)，通過(guò)調(diào)整N2的濃度而設(shè)定所需O2的濃度（37℃，5%CO2、94%N2、1%O2），6h后取出放回CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，收集第6天細(xì)胞。

1.2.4 采用AnnexinV/PI雙標(biāo)記流式細(xì)胞儀檢測(cè)NSCs凋亡率 收集缺氧后第6天的NSCs，采用機(jī)械吹打法吹打成單個(gè)細(xì)胞，分別置15mL離心管中，1000r/min離心5min，棄上清，用4℃PBS重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)細(xì)胞密度，細(xì)胞數(shù)目達(dá)106～107/mL。取1mL細(xì)胞懸液，用4℃PBS洗滌兩次，重懸于500μL結(jié)合液(Binding Buffer)中，加入5μL FITC標(biāo)記的AnnexinV，于25℃避光孵育30min，再加入5μL PI，室溫避光染色5min。在1h內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析，同時(shí)以不加AnnexinV-FITC及PI的1管單細(xì)胞懸液作為陰性對(duì)照。激發(fā)波長(zhǎng)480nm，計(jì)數(shù)104個(gè)細(xì)胞，數(shù)據(jù)經(jīng)Cell Quest軟件分析處理，記錄位于右下象限的AnnexinV陽(yáng)性、PI陰性細(xì)胞數(shù)的百分比，即細(xì)胞早期凋亡率。

1.2.5 流式細(xì)胞儀測(cè)定線粒體跨膜電位 收集缺氧后第6天的NSCs，采用機(jī)械吹打法吹打成單個(gè)細(xì)胞，分別置15mL離心管中，1000r/min離心5min，棄上清，用4℃PBS重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)細(xì)胞密度，細(xì)胞數(shù)目達(dá)106～107/mL。取1mL細(xì)胞懸液，PBS洗滌，用新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，加入Rhodamine1230.5μL (終濃度為0.5μmol/L)，于37℃避光孵育30min，再用PBS洗細(xì)胞3次，留細(xì)胞懸液1mL，過(guò)200目尼龍網(wǎng)。流式細(xì)胞儀FL1通道檢測(cè)聚集在細(xì)胞質(zhì)中的綠色熒光單體。同時(shí)以不加Rhodamine123的1管單細(xì)胞懸液做為陰性對(duì)照，計(jì)數(shù)104個(gè)細(xì)胞，在流式細(xì)胞儀上用Cell Quest軟件分析，繪制線粒體膜電位變化的平均熒光值分布圖。其中橫坐標(biāo)為線粒體膜電位的平均熒光值的對(duì)數(shù)值，縱坐標(biāo)為細(xì)胞體積。

1.2.6 Western blot檢測(cè)缺氧NSCs凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3和Bcl-2、Bax的表達(dá) 用Western-blot技術(shù)，將蛋白上清液與上樣緩沖液按5∶1的比例混合，100℃變性5min，冷卻后離心上樣。10%聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離蛋白，電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上。用5%脫脂奶粉室溫封閉2h，一抗1∶1000稀釋，4℃搖床孵育過(guò)夜，TBST（Tris-buffered saline Tween-20）漂洗5次，每次5min。二抗1∶10000稀釋。室溫?fù)u床孵育2h，TBST漂洗3次，每次15min。化學(xué)發(fā)光，凝膠成像系統(tǒng)照相。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS 16.0軟件包處理數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)以±s的形式表示，均數(shù)間兩兩比較采用t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 缺氧對(duì)NSCs凋亡率的影響 缺氧處理后，收集第6天的NSCs，經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)NSCs的凋亡率，圖1A、B分別為NC組和Hyp組的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果（圖1）。對(duì)兩組結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，缺氧處理組細(xì)胞早期凋亡率增加，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖1C。

圖1 AnnexinV/PI雙標(biāo)記流式細(xì)胞儀檢測(cè)NSCs凋亡率Fig 1 The apoptotic rate of NSCs detected by FCM

2.2 缺氧對(duì)NSCs線粒體跨膜電位的影響 圖2中A，B分別為線粒體跨膜電位結(jié)果。和正常對(duì)照組比較，缺氧處理組細(xì)胞熒光強(qiáng)度下降，線粒體跨膜電位降低，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖2C。

圖2 流式細(xì)胞儀測(cè)定NSCs線粒體跨膜電位的變化Fig 2 The mitochondrial trans-membrane potential of NSCs

2.3 缺氧對(duì)NSCs凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3活性表達(dá)的影響 用Western blot檢測(cè)Caspase-3表達(dá)。結(jié)果表明：缺氧處理后Hyp組Caspase-3活性表達(dá)高于NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖3。

2.4 缺氧對(duì)NSCs線粒體通路凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)的影響 統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示：缺氧處理后Hyp組中抑凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)低于NC組，而促凋亡蛋白Bax的表達(dá)高于NC組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖4。

圖3 Western blot檢測(cè)Caspase-3表達(dá)Fig 3 The expression of Caspase-3detected by Western blot

圖4 Western blot檢測(cè)Bcl-2和Bax活性表達(dá)Fig 4 The expression of Bcl-2and Bax detected by Western blot

3 討論

NSCs在神經(jīng)發(fā)育和修復(fù)受損神經(jīng)中發(fā)揮重要作用，是當(dāng)前神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，其凋亡是一個(gè)非常復(fù)雜的過(guò)程，受到內(nèi)外環(huán)境中眾多調(diào)節(jié)因子的調(diào)節(jié)，組成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，但其確切調(diào)控機(jī)制尚不明確。氧作為機(jī)體重要的病理生理調(diào)節(jié)因素，其濃度的改變可以影響生命過(guò)程，輕度缺氧可通過(guò)機(jī)體自身代償性的生理性調(diào)節(jié)，減輕對(duì)機(jī)體的損傷，如果氧濃度的改變超出了機(jī)體正常生理代償?shù)姆秶?，可以引發(fā)多種疾病和衰老退變[3]。腦組織間隙中氧水平較低，其范圍在0.55%～8%，研究發(fā)現(xiàn)，在5%的氧濃度下，神經(jīng)干細(xì)胞表現(xiàn)增殖增加，而在<1%的氧濃度下則會(huì)誘發(fā)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡[4]，但凋亡具體調(diào)控機(jī)制尚不明確。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，將原代培養(yǎng)的NSCs在第3天進(jìn)行1%O2缺氧處理，6h后恢復(fù)正常培養(yǎng)，6d后檢測(cè)細(xì)胞的凋亡率，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡率升高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明缺氧可能誘導(dǎo)NSCs的凋亡，進(jìn)而影響到因缺血缺氧造成神經(jīng)損傷的修復(fù)。

凋亡是指細(xì)胞在一定生理或病理?xiàng)l件下，由基因控制，通過(guò)表達(dá)特定的RNA和蛋白質(zhì)介導(dǎo)的細(xì)胞自主而有序地死亡，在正常腦發(fā)育過(guò)程中起著非常重要的作用。細(xì)胞凋亡是受高度調(diào)控的程序性死亡過(guò)程，在眾多的信號(hào)傳導(dǎo)通路中，B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）蛋白家族在細(xì)胞凋亡的線粒體途徑中起重要調(diào)控作用[5]。Bcl-2家族包括兩類(lèi)蛋白質(zhì)：一類(lèi)是抗凋亡蛋白，包括Bcl-2、Bcl-xl、Bcl-w等；另一類(lèi)是促凋亡蛋白，包括Bax、Bid、Bak等，其中Bcl-2和Bax是目前研究相對(duì)比較明確的功能對(duì)立的細(xì)胞凋亡調(diào)控蛋白。Bax是重要的促凋亡蛋白，一種可溶性的蛋白分子，正常情況下Bax蛋白位于細(xì)胞質(zhì)中，但當(dāng)?shù)蛲霭l(fā)生時(shí)，通過(guò)增加線粒體膜通透性使其從胞漿轉(zhuǎn)移到線粒體并與線粒體膜相結(jié)合[6]，形成同源二聚體后被激活，發(fā)生構(gòu)象改變，可引起線粒體大量釋放CytC，啟動(dòng)Caspase-3的活化，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；另外，Bax的促凋亡作用能被Bcl-2所抑制。國(guó)內(nèi)外研究資料表明，大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元對(duì)腦缺血缺氧反應(yīng)敏感，缺血早期即以凋亡、壞死為主，最終導(dǎo)致神經(jīng)元數(shù)目減少，超微結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，進(jìn)而影響動(dòng)物的學(xué)習(xí)、記憶功能[7-8]。但是，目前缺氧對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制尚不明確。我們實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，缺氧處理后，線粒體通路中抑凋亡蛋白Bcl-2活性表達(dá)下降，促凋亡蛋白Bax活性表達(dá)升高，從而激活凋亡蛋白Caspase-3表達(dá)，故推測(cè)缺氧可改變多種凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，打破了其動(dòng)態(tài)平衡，從而產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用，導(dǎo)致神經(jīng)干細(xì)胞的凋亡。

總之，缺氧損傷可激活凋亡蛋白的表達(dá)，誘導(dǎo)NSCs凋亡，在缺血性腦病的預(yù)防、治療有一定臨床意義。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為缺血缺氧性胚胎腦損傷的基礎(chǔ)和臨床研究提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，但缺氧對(duì)NSCs的更多機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

［1］ TaoufikE,ProbertL.Ischemicneuronaldamage[J].Curr Pharm Des, 2008,14（33）:3565

［2］ Santilli G,Lamorte G,Carlessi L,et al.Mild hypoxia enhances proliferation and multipotency of human neural stem cells[J].PLoS One,2010,5（1）:e8575

［3］ Kadenbach B,Ramzan R,Vogt S.Degenerative diseases,oxidative stress and cytochrome c oxidase function[J].Trends Mol Med,2009, 15（4）:139

［4］ De Filippis L,Delia D.Hypoxia in the regulation of neural stem cells[J].Cell Mol Life Sci,2011,68（17）:2831

［5］ Hu W,Xie J,Zhao J,et al.Involvement of Bcl-2family in apoptosis and signal pathways induced by cigarette smoke extract in the human airway smooth muscle cells[J].DNA Cell Biol,2008,17（12）:13

［6］ Middleton G,Cox S W,Korsmeyer S,et al.Differences in Bcl-2-and Bax-independent function in regulating apoptosis in sensory neuron populations[J].Eur J Neurosci,2000,12（3）:819

［7］ Blomgren K,Leist M,Groc L.Pathological apoptosis in the developing brain[J].Apoptosis,2007,12（5）:993

［8］ Uchiyama Y,Koike M,Shibata M.Autophagic neuron death in neonatal brain ischemia/hypoxia[J].Autophagy,2008,4（4）:404