周長勝，王進(jìn)昆，王偉民，王崇謙，尚亞軍，王波，牟臨杰，張浩，蘇穩(wěn)，丁鵬

膠質(zhì)瘤中過氧化物酶體增殖物激活受體γ表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系①

周長勝，王進(jìn)昆，王偉民，王崇謙，尚亞軍，王波，牟臨杰，張浩，蘇穩(wěn)，丁鵬

目的 探討人腦膠質(zhì)瘤組織中過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)γ表達(dá)水平與患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。方法采用免疫組織化學(xué)法檢測48例人腦膠質(zhì)瘤組織PPARγ的表達(dá)水平，Kaplan-Meier生存曲線比較PPARγ高表達(dá)組與低表達(dá)組患者的無進(jìn)展生存期及總生存期。結(jié)果PPARγ表達(dá)在Ⅰ～Ⅳ級膠質(zhì)瘤組織中隨腫瘤惡性程度增加而降低(P＜0.01)，表達(dá)水平與病理級別呈負(fù)相關(guān)(r=-0.770,P＜0.01)。高表達(dá)組和低表達(dá)組無進(jìn)展生存期和總生存期均有非常顯著性差異(P＜0.01)。結(jié)論P(yáng)PARγ表達(dá)與膠質(zhì)瘤的惡性程度相關(guān)，可以為臨床判斷腦膠質(zhì)瘤患者預(yù)后提供依據(jù)。

神經(jīng)膠質(zhì)瘤；過氧化物酶體增殖物激活受體γ；免疫組織化學(xué)；預(yù)后

[本文著錄格式]周長勝，王進(jìn)昆，王偉民，等.膠質(zhì)瘤中過氧化物酶體增殖物激活受體γ表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系[J].中國康復(fù)理論與實(shí)踐,2013,19(3):235-238.

腦膠質(zhì)瘤發(fā)生于神經(jīng)外胚層，是顱內(nèi)最常見的惡性腫瘤，約占顱內(nèi)腫瘤的44.69%[1]。膠質(zhì)瘤的發(fā)生是多階段、多步驟、多因素發(fā)展的過程。近年研究顯示，多種基因或蛋白參與膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展[2]。過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferators-activated receptors,PPARs)是一類由配體激活的轉(zhuǎn)錄因子，屬于核激素受體超家族成員，包括 PPARα、PPARβ/δ、PPARγ 3種亞型。其中PPARγ處于多種信號傳導(dǎo)途徑的交叉點(diǎn)，參與調(diào)節(jié)體內(nèi)多種生理與病理過程[3]。越來越多的前瞻性研究表明，PPARγ在多種腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，對腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、轉(zhuǎn)移、侵襲等生物學(xué)行為有影響[4]。本研究檢測不同病理分級膠質(zhì)瘤中PPARγ表達(dá)水平，分析其與膠質(zhì)瘤的臨床病理的關(guān)系及其對患者預(yù)后的影響。

1 材料和方法

1.1 臨床資料

收集2007年1月～2010年6月間昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院手術(shù)切除的膠質(zhì)瘤標(biāo)本48例，均經(jīng)病理證實(shí)。其中男性27例，女性21例；年齡37～72歲，平均(53.15±8.86)歲；參照2007年WHO的神經(jīng)上皮源性腫瘤的分類與分級標(biāo)準(zhǔn)[5]，Ⅰ～Ⅳ級各12例。所選患者均為初發(fā)病例，術(shù)前未接受化療和放療等治療，無糖尿病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、甲狀腺功能亢進(jìn)等其他疾病，臨床及隨訪資料完整(包括性別、年齡、治療效果)；隨訪從術(shù)后開始，隨訪方法為電話和信件；生存期的計(jì)算從手術(shù)日期到隨訪截止日期或死亡日期為止。所有標(biāo)本切片采用10%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片。

1.2 PPARγ檢測

每個(gè)標(biāo)本連續(xù)切取白片2張，采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶(Streptavidin-Perosidase,SP)二步法進(jìn)行免疫組化染色(操作步驟參照試劑盒說明書進(jìn)行)：微波修復(fù)抗原，以PBS代替一抗染色作為陰性對照；免抗鼠PPARγ多克隆抗體(1∶100)購自北京博奧森公司。

PPARγ蛋白陽性表達(dá)判定：細(xì)胞形態(tài)完整，結(jié)構(gòu)清晰；以胞核和/或胞漿染成棕黃色為陽性細(xì)胞。采用Image-ProPlus 6.0圖像處理軟件(美國Media Cybernetics公司)，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野(400×)，分別測得5個(gè)視野累積光密度(integrated optical density，IOD)及圖片去除空白處的面積，得出該圖片的平均累計(jì)光密度(Mean IOD)，作為免疫反應(yīng)強(qiáng)度指標(biāo)。以Mean IOD中位數(shù)為界，將表達(dá)強(qiáng)度再分為高、低亞組。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布。多組定量資料采用單因素ANOVA分析，兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)；應(yīng)用Spearman秩相關(guān)分析病理級別與PPARγ表達(dá)的關(guān)系。顯著性水平α= 0.05。繪制Kaplan-Meier生存曲線，并采用log-rank檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 PPARγ的表達(dá)

所有病例中均有PPARγ浸潤(圖1)。膠質(zhì)瘤標(biāo)本切片中PPARγ染色主要位于胞漿和/或胞核，在切片中呈灶性或彌漫性分布，有明顯的異質(zhì)性。

圖1 不同病理分級膠質(zhì)瘤中PPARγ表達(dá)(SP染色，400×)

2.2 PPARγ表達(dá)與病理學(xué)分級的關(guān)系

PPARγ陽性表達(dá)在Ⅰ～Ⅳ級中呈遞減趨勢(P＜0.01)，見表1。PPARγ陽性表達(dá)與腦膠質(zhì)瘤病理級別呈負(fù)相關(guān)(r=-0.770,P＜0.01)。

表1 不同病理分級膠質(zhì)瘤中PPARγ表達(dá)(Mean IOD)

2.3 PPARγ表達(dá)與臨床特征的關(guān)系

PPARγ陽性表達(dá)水平在膠質(zhì)瘤不同病理分級間有顯著性差異(P＜0.01)；在不同的性別、年齡、腫瘤大小、腫瘤位置、有無囊變患者間無顯著性差異(P＞0.05)。見表2。

表2 不同臨床特征患者膠質(zhì)瘤PPARγ表達(dá)水平(n)

2.4 PPARγ表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系

以Mean IOD的中位值0.0704為界，將標(biāo)本分成低表達(dá)組和高表達(dá)組。其中低表達(dá)組來源患者24例，無進(jìn)展生存期為(324.667±34.919)d，總生存期為(488.250±51.754)d；高表達(dá)組24例，無進(jìn)展生存期為(698.750±45.727)d，總生存期為(985.542±54.065)d。 Kaplan-Meier生存曲線顯示，兩者間無進(jìn)展生存期及總生存期log-rank檢驗(yàn)均有顯著性差異(P＜0.01)。

3 討論

PPARs是一類由配體激活的核轉(zhuǎn)錄因子，維生素D、甲狀腺激素、蛻化素、維甲酸和孤兒受體等均為此家族成員[6]。在成人大腦神經(jīng)元細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞中，PPARs的3種亞型均有表達(dá)，大多位于細(xì)胞核[7]。

人類的PPARγ基因位于3p25，全長大于100 kb，有9個(gè)外顯子。由于啟動(dòng)子和5'端外顯子的拼接方式不同可分為4種mRNA，但4種mRNA只翻譯出2種PPARγ蛋白。PPARγ有6個(gè)區(qū)域(A～F，其中4個(gè)為功能結(jié)構(gòu)區(qū)域)[8]：N端的A/B區(qū)是不依賴配體的活性區(qū)，包含激活功能-1(AF-1)；C區(qū)具有高度的保守性，其中約70個(gè)氨基酸序列構(gòu)成DNA結(jié)合區(qū)(DBD)，含有2個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)，分別具有D盒和P盒，可特異性結(jié)合靶基因上的PPAR反應(yīng)元件(PPRE)；D區(qū)又稱鉸鏈區(qū)，將DBD與配體結(jié)合區(qū)(LBD)相連；C端的E/F區(qū)為配體結(jié)合區(qū)(LBD)，含有激活功能-2 (AF-2)，該區(qū)具有結(jié)合配體-受體二聚體和結(jié)合輔助因子的功能，在轉(zhuǎn)錄激活信號調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮重要作用。

PPARγ的配體分為天然配體和人工合成配體。天然配體包括花生四烯酸系列代謝產(chǎn)物、長鏈多聚不飽合脂肪酸等，其中前列腺素J2衍生物(15d-PGJ2)是PPARγ最主要的內(nèi)源性配體，也是最常用的PPARγ激活劑。人工合成配體包括唑烷二酮類化合物(TZDs)，如吡格列酮、羅格列酮、曲格列酮等；非甾體類抗炎藥物(NSAIDS)，如吲哚美辛[9]、氟芬那酸、布洛芬、非諾洛芬等；含有酪氨酸結(jié)構(gòu)的藥物，如GI262570、GW1929等。

PPARγ的配體可以與PPARγ結(jié)合，活化后的PPARγ能和維甲酸受體(retinoic acid receptor,RAR)形成異源二聚體，進(jìn)入核內(nèi)與目標(biāo)基因的PPRE結(jié)合，抑制編碼c-myc和轉(zhuǎn)鐵蛋白受體生長相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，抑制c-raf激活蛋白激酶活性，阻止生長因子誘導(dǎo)有絲分裂發(fā)生，同時(shí)阻斷轉(zhuǎn)鐵蛋白與瘤細(xì)胞表面轉(zhuǎn)鐵蛋白受體結(jié)合，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞分化和成熟。也能通過抑制核因子-κB(NF-κB)、信號轉(zhuǎn)錄子、激活蛋白-1介導(dǎo)等信號通路的激活，調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄、翻譯及生物學(xué)效應(yīng)[3]。

PPARγ表達(dá)影響膠質(zhì)瘤生物學(xué)特性的機(jī)制復(fù)雜，主要通過以下路徑：①PPARγ配體抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及分化；②PPARγ活化后可通過上調(diào)絲裂原活化蛋白激酶ERK1/2及下調(diào)細(xì)胞周期蛋白Cyclin D、E的表達(dá)，使膠質(zhì)瘤細(xì)胞停滯在G0/G1期，從而抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長；③PPARγ活化后可增強(qiáng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞Caspase3/8的活性，可以同時(shí)增加FasL蛋白和mRNA的表達(dá)水平，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡；④抑制環(huán)氧合酶-2(COX-2)表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；⑤誘導(dǎo)腫瘤抑制基因第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因(PTEN)的表達(dá)；⑥抑制腫瘤血管生成：研究發(fā)現(xiàn)激活PPARγ能抑制膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生血管生成因子，并抑制其轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子NF-κB的產(chǎn)生，提示PPARγ參與調(diào)節(jié)腫瘤血管網(wǎng)絡(luò)的形成，進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移[10]。PPARγ對多個(gè)細(xì)胞傳導(dǎo)通路都有影響，通過與它們的相互調(diào)節(jié)而發(fā)揮作用，包括雌激素受體(ER)、原癌基因人類表皮生長因子受體-2(HER2/ErbB2)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子5B(STAT5B)、NF-κB、轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)、磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B (P13K/AKt)信號通路。這些研究表明PPARγ及其配體在膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后中起到重要的調(diào)節(jié)作用，可能成為抗膠質(zhì)瘤治療的新靶點(diǎn)。

國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，PPARγ在結(jié)腸癌、前列腺癌、胃癌、肺癌和胰腺癌等多種惡性腫瘤中高表達(dá)與腫瘤的浸潤、轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后有關(guān)[11]，推測其在膠質(zhì)瘤患者的疾病演變過程中可能同樣起著重要作用。

本研究結(jié)果顯示，PPARγ在膠質(zhì)瘤組織中均有表達(dá)，并且與病理分級呈負(fù)相關(guān)；PPARγ低表達(dá)組患者的無進(jìn)展生存期和總生存期明顯低于高表達(dá)組，提示PPARγ能抑制膠質(zhì)瘤的惡性進(jìn)展，改善膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后。

綜上所述，人腦膠質(zhì)瘤組織中PPARγ表達(dá)與膠質(zhì)瘤惡性程度相關(guān)。但其詳細(xì)機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

[1]Chow LML,Endersby R,Zhu X,et al.Cooperativity within and among Pten,p53,and Rb pathways induces high-grade astrocytoma in adult brain[J].Cancer Cell,2011,19(3):305-315.

[2]Bai P,Houten SM,Huber A.Poly(ADP-ribose)polymerase-2 controls adipocyte differentiation and adipose tissue function through the regulation of the activity of the retinoid X receptor/ peroxisome proliferator-activated receptor-gamma heterodimer[J].J Biol Chem,2007,282(52):37738-37746.

[3]Zieleniak A,Wójcik M,Wo?niak LA,et al.Structure and physiological functions of the human peroxisome proliferator-activated receptor γ[J].Arch Immunol Ther Exp,2008,56(5): 331-345.

[4]Theocharis S,Klijanienko J,Giaginis C,et al.Peroxisome proliferator-activated receptor-γ in mobile tongue squamous cell carcinoma:associations with clinicopathological parameters and patients survival[J].J Cancer Res Clin Oncol,2011,137 (2):251-259.

[5]Louis DN,Ohgaki H,Wiestler OD,et al.The 2007 WHO classification of tumours of the central nervous system[J].Acto Neuropathol,2007,114(2):97-109.

[6]Semple RK,Chatterjee VKK,O'Rahilly S,et al.PPAR gamma and human metabolic disease[J].J Clin Invest,2006,116(3): 581-589.

[7]Moreno S,Farioli-Vecchioli S,Ceru MP,et al.Immunolocalization of peroxisome proliferator-activated receptors and retinoid X receptors in the adult rat CNS[J].Neuroscience,2004,123 (1):131-145.

[8]Mansure JJ,Nassim R,Kassouf W,et al.Peroxisome proliferator-activated receptor γ in bladder cancer:A promising therapeutic target cancer[J].Bioll Ther,2009,8(7):6-15.

[9]Styner M,Sen B,Xie Z,et al.Indomethacin promotes adipogenesis of mesenchymal stem cells through a cyclooxygenase independent mechanism[J].J Cell Bioehem,2010,111(4): 1042-1050.

[10]Keshamouni VG,Arenberg DA,Reddy RC,et al.PPAR-γ activation inhibits angiogenesis by blocking ELR+CXC chemokine production in non-small cell lung cancer[J].Neoplasia, 2005,7(3):294-301.

[11]Krishnan A,Nair SA,Pillai MR,et al.Biology of PPAR in Cancer:a critical review on existing lacunae[J].Curr Mol Med,2007,7(6):532-540.

Relationship between Expression of Peroxisome Proliferators-activated Receptors γ in Gliomas and Outcome of Patients

ZHOU Chang-sheng,WANG Jin-kun,WANG Wei-min,et al.Department of Neurosurgery,First Hospital of Kunming Medical University,Kunming 650032,Yunnan,China

ObjectiveTo explore the relationship among expression of peroxisome proliferators-activated receptors γ(PPARγ)in human glioma,malignancy and outcome.MethodsThe level of PPARγ was detected with immunohistochemistry in the glioma from 48 cases with glioma.The progression-free survival and overall survival were compared with Kaplan-Meier survival curve between the patients with more expression of PPARγ and less ones.ResultsThe expression of PPARγ decreased(P＜0.01)with the the tumor malignancy increasing from grade I to IV,which was negatively correlated(r=-0.770,P＜0.01).Both the progression-free and overall survival time were significant difference between the patients with more expression of PPARγ and less ones(P＜0.01).ConclusionPPARγ expression correlates with the malignancy of human glioma,which may predict the outcome of the patients.

glioma;peroxisome proliferators-activated receptors γ;immunohistochemistry;outcome

R730.264

A

1006-9771(2013)03-0235-04

2012-09-11

2012-10-16)

云南省科技廳-昆明醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合專項(xiàng)基金(No.2010CD157）。

昆明醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科，云南昆明市650032。作者簡介：周長勝(1972-)，男，湖北十堰市人，碩士研究生，副主任醫(yī)師，主要研究方向：主要從事神經(jīng)干細(xì)胞基礎(chǔ)研究及腦膠質(zhì)瘤的體外誘導(dǎo)凋亡和顱內(nèi)腫瘤及腦血管病的治療與研究。通訊作者：丁鵬。

10.3969/j.issn.1006-9771.2013.03.009