馮曉東，劉嬌，陳立典

·基礎(chǔ)研究·

電針對(duì)局灶性腦缺血大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響及其機(jī)制①

馮曉東1，劉嬌2，陳立典1

目的 觀察電針神庭、百會(huì)對(duì)局灶性腦缺血大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響，以及海馬組織病理學(xué)和核因子-κB p65 (NF-κB-p65)及其抑制蛋白(IκB)mRNA表達(dá)的改變。方法線栓法制備局灶性腦缺血損傷大鼠模型。45只Sprague-Dawley大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、電針組，每組15只。電針組行電針干預(yù)14 d。14 d后行跳臺(tái)測(cè)試；HE染色觀察大鼠海馬組織形態(tài)學(xué)；逆轉(zhuǎn)錄-PCR(RT-PCR)檢測(cè)大鼠海馬組織中NF-κB-p65和IκB mRNA水平。結(jié)果跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)顯示，電針組大鼠在3 min內(nèi)受到電擊次數(shù)(2.2±0.94)次，較模型組的(7.60±2.67)次顯著減少(P＜0.001)，電針組跳下平臺(tái)的平均潛伏期(137.33±32.20)s，較模型組的(76.93± 28.57)s顯著延長(zhǎng)(P＜0.001)。電針組大鼠海馬區(qū)域細(xì)胞損傷及NF-κB-p65 mRNA水平明顯降低、IκB mRNA水平明顯提高。結(jié)論抑制腦缺血海馬組織中神經(jīng)細(xì)胞的溶解及NF-κB-p65的活化，可能是電針改善局灶性腦缺血再灌注大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的機(jī)制之一。

腦缺血；電針；學(xué)習(xí)記憶；核因子-κB；核因子-κB抑制蛋白

[本文著錄格式]馮曉東，劉嬌，陳立典.電針對(duì)局灶性腦缺血大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響及其機(jī)制[J].中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐, 2013,19(3):227-230.

認(rèn)知功能障礙是腦缺血損傷后患者常見(jiàn)的功能障礙之一。認(rèn)知障礙患者的計(jì)算、記憶等高級(jí)腦功能受損[1]，不僅直接影響患者日常生活能力和生活質(zhì)量[2]，而且嚴(yán)重影響運(yùn)動(dòng)、感覺(jué)等其他功能康復(fù)。本課題組前期臨床實(shí)踐發(fā)現(xiàn)，電針督脈穴神庭、百會(huì)可改善腦缺血后患者的認(rèn)知功能。近年來(lái)初步研究證實(shí)，大鼠腦組織缺血后，缺血區(qū)域核因子-κB p65(nuclear factor κB p65,NF-κB-p65)表達(dá)升高，NF-κB-p65抑制劑可明顯改善缺血大鼠學(xué)習(xí)記憶功能，提示NF-κB-p65在腦缺血后學(xué)習(xí)記憶功能的恢復(fù)中起重要作用[3]。本研究觀察電針神庭、百會(huì)對(duì)局灶性腦缺血再灌注大鼠學(xué)習(xí)記憶能力、大鼠海馬組織病理形態(tài)學(xué)及NF-κB-p65及其抑制蛋白(IκB)mRNA水平的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

45只清潔級(jí)健康雄性Sprague-Dawley大鼠，體重(260±20)g，由福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(許可證號(hào)：SYXK(閩)2005-004)。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠編號(hào)，并分為假手術(shù)組(n= 15)、模型組(n=15)、電針組(n=15)。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑及儀器

1.2.1 試劑 10%水合氯醛；蘇木精、伊紅：福建中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供；Trizol：Invitrogen；cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及 PCR Master Mix：Fermentas；NF-κB-p65、IκB mRNA上下游引物：上海生工公司合成。

1.2.2 儀器 熒光定量PCR儀：BioRad,Model Gel Doc 2000,USA；DTT-2型大鼠跳臺(tái)儀：中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所；YF-7FB型攤片烤片機(jī)：湖北省孝感市亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司。

1.3 動(dòng)物模型制備

術(shù)前所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物禁食12 h。大鼠稱重后，以腹腔注射水合氯醛3 ml/kg麻醉。分離并暴露左側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈及其深部分支翼腭動(dòng)脈。依次結(jié)扎頸總動(dòng)脈近心端、頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)心端，并于頸總動(dòng)脈分叉處近心端預(yù)留結(jié)扎線。用微動(dòng)脈夾夾閉翼腭動(dòng)脈及遠(yuǎn)端頸內(nèi)動(dòng)脈。距頸總動(dòng)脈分叉處1.0 mm處用顯微剪刀剪一切口，將備好的線栓插入頸內(nèi)動(dòng)脈，插入長(zhǎng)度約18.0～22.0 mm，至大腦前動(dòng)脈近端，完全阻斷大腦中動(dòng)脈血供?？`緊預(yù)先放置于頸總動(dòng)脈的結(jié)扎線，頸部傷口常規(guī)縫合。2 h后，輕柔回抽線栓至頸總動(dòng)脈分叉處。術(shù)中和術(shù)后保持室溫25℃左右，用白熾燈照射動(dòng)物，使其肛溫維持在(37±1)℃，直到恢復(fù)活動(dòng)。假手術(shù)組只分離動(dòng)脈，不結(jié)扎、插線。手術(shù)結(jié)束后，動(dòng)物置于室溫(25℃)環(huán)境下蘇醒，正常飲食。

1.4 干預(yù)措施

1.4.1 電針組 參考《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》取大鼠神庭和百會(huì)穴，應(yīng)用GM101電針儀，電壓峰值6 V，以針體輕輕抖動(dòng)為度，疏密波，頻率1～20 Hz。每次30 min，每天1次。手術(shù)后2 h開(kāi)始治療，直至動(dòng)物被處死。

1.4.2 模型組 造模后回籠飼養(yǎng)，只給予同等條件抓取，不給予任何治療。

1.4.3 假手術(shù)組 置于普通籠中飼養(yǎng)，只給予同等條件抓取，不給予任何治療。

1.5 跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)

在造模后第13天電針干預(yù)完畢后，將各組大鼠放入跳臺(tái)儀的反應(yīng)箱中，箱底鋪直徑為1 mm銅柵，通36 V交流電；銅柵的一角固定一橡膠平臺(tái)作為安全區(qū)。將動(dòng)物放在銅柵上，當(dāng)動(dòng)物四足同時(shí)接觸銅柵時(shí)，會(huì)受到2 s，0.5 mA電擊，使動(dòng)物從銅柵跳到平臺(tái)上；當(dāng)動(dòng)物再次回到銅柵時(shí)將受到1次電擊。記錄3 min內(nèi)大鼠受到電擊次數(shù)。動(dòng)物受電擊后，放回飼養(yǎng)籠中；24 h后，再將動(dòng)物放到平臺(tái)上，記錄動(dòng)物移到銅柵的時(shí)間(潛伏期)。

1.6 取材及檢測(cè)

1.6.1 HE染色 麻醉下開(kāi)胸，生理鹽水200 ml經(jīng)左心室快速?zèng)_洗，4%多聚甲醛(pH=7.4)400 ml灌流固定。取腦后置入4%多聚甲醛內(nèi)4℃固定24～48 h。定位腦缺血區(qū)，常規(guī)脫水，石蠟包埋，冠狀切片，片厚5 μm。二甲苯脫蠟、梯度酒精脫水，蘇木精和伊紅染色，光鏡下觀察組織病理學(xué)變化。

1.6.2 NF-κB-p65、IκB mRNA水平檢測(cè) 取左側(cè)海馬組織置于液氮罐中速凍，再置于-80℃冰箱保存。

取100 mg腦組織，研磨后加入Trizol 1 ml，震蕩30 s。加氯仿0.2 ml，劇烈搖動(dòng)30 s，室溫靜置5 min。12000 g、4℃離心15 min。輕輕吸取上層無(wú)色水相，移入另一只EP管中(約0.5 ml)。加等體積異丙醇，室溫放置10 min。12000 g、4℃離心10 min。加入75%乙醇1 ml，振蕩。7500 g、4℃離心5 min。棄上清，小心吸取殘留乙醇，開(kāi)蓋干燥5 min。用DEPC水20 μl溶解RNA，檢測(cè)RNA濃度，根據(jù)RNA濃度，計(jì)算RNA體積。

按照Fermentas公司提供的cDNA逆轉(zhuǎn)錄及PCR擴(kuò)增試劑盒及說(shuō)明書(shū)加入相應(yīng)量的試劑。引物序列：NF-κB-p65：正義：5′-GTG CAG AAA GAA GAC ATT GAG TG-3′，反義：5′-AGG CTA GGG TCA GCG TAT GG-3′；IκB：正義：5′-AAG CGG TCG GAC AAT ACT TCA C-3′，反義：5′-TTG CCA AAA CAA TGG GTG TAA G-3′；β-actin：正義：5′-ACT GGC ATT GTG ATG GAC TC-3′，反義：5′-CAG CAC TGT GTT GGC ATA GA-3′。擴(kuò)增體系20 μl,其中cDNA模板1 μl，上下游引物各0.4 μl，Mix 10 μl，加水8.2 μl。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min，95℃變性30 s，NF-κB-p65 60℃、IκB 56℃、β-actin 58℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)。取PCR產(chǎn)物5 μl，1.5%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色鑒定，凝膠成像。計(jì)算圖像軟件分析電泳條帶。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)

電針組大鼠遭受電擊次數(shù)顯著少于模型組(P＜0.001)，電針組大鼠跳下平臺(tái)的平均潛伏期顯著延長(zhǎng)(P＜0.001)。見(jiàn)表1。

2.2 HE染色

模型組大鼠海馬組織中神經(jīng)細(xì)胞稀少、排列疏松；存在廣泛神經(jīng)細(xì)胞溶解；細(xì)胞結(jié)構(gòu)模糊、變形，少數(shù)神經(jīng)細(xì)胞染色加深，組織間質(zhì)疏松。電針組損傷較模型組細(xì)胞溶解較輕，排列致密，結(jié)構(gòu)較完整。假手術(shù)組未見(jiàn)病理改變(圖1)。

2.3 PCR

模型組大鼠海馬組織中NF-κB-p65 mRNA擴(kuò)增產(chǎn)物電泳條帶光密度較假手術(shù)組升高，IκB mRNA較假手術(shù)組降低。與模型組相比，電針組NF-κB-p65 mRNA擴(kuò)增產(chǎn)物電泳條帶光密度降低，IκB mRNA升高(圖2)。見(jiàn)表2。

表1 各組大鼠跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表2 各組大鼠NF-κB-p65和IκB mRNA水平(相對(duì)值)

圖1 HE染色觀察電針對(duì)大鼠海馬組織病理形態(tài)學(xué)的影響

圖2 各組海馬組織NF-κB-p65和IκB mRNA

3 討論

神庭屬督脈，可寧神醒腦；百會(huì)位居巔頂，經(jīng)氣沿走向過(guò)頭部，與大腦聯(lián)系密切。兩穴通常合用而起到開(kāi)竅醒神，補(bǔ)腎養(yǎng)精，改善認(rèn)知功能的作用[4-5]。

NF-κB在許多免疫和炎癥反應(yīng)、凋亡的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)中起著重要作用[6]。正常情況下，在大腦皮層和海馬區(qū)域，NF-κB與其抑制蛋白IκB結(jié)合，處于低水平狀態(tài)。腦缺血再灌注后，氧化應(yīng)激的產(chǎn)生導(dǎo)致自由基和白細(xì)胞增多，當(dāng)細(xì)胞受到細(xì)胞因子等信號(hào)刺激時(shí)，IκB在IκB激酶(IκB kinase,Iκk)的作用下發(fā)生磷酸化而降解，與NF-κB解離，游離NF-κB迅速由細(xì)胞質(zhì)移位到細(xì)胞核，與多種基因的啟動(dòng)子部位κB位點(diǎn)結(jié)合，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)多種細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)、黏附分子、生長(zhǎng)因子等，被認(rèn)為是炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)的中心靶點(diǎn)。因此抑制NF-κB活性及其轉(zhuǎn)錄途徑現(xiàn)已成為藥物研發(fā)的熱門(mén)靶點(diǎn)[7]。

完整的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)是學(xué)習(xí)和記憶功能的物質(zhì)基礎(chǔ)，以海馬部位為代表的大腦邊緣系統(tǒng)既是腦缺血的敏感區(qū)域，也是學(xué)習(xí)記憶功能形成的關(guān)鍵部位[8]。大腦中動(dòng)脈閉塞(MCAO)后，由于遠(yuǎn)隔損害所造成的非梗死血管管轄區(qū)如海馬部位軸突退行性改變、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子缺乏、神經(jīng)生長(zhǎng)抑制因子的存在、局部腦血流的減少、神經(jīng)遞質(zhì)調(diào)節(jié)失衡及蛋白合成減少等原因[9]，導(dǎo)致其對(duì)應(yīng)功能如學(xué)習(xí)、記憶能力受損。

本研究中，我們觀察到電針14 d可以明顯提高腦缺血再灌注損傷大鼠的被動(dòng)學(xué)習(xí)和記憶能力，HE染色觀察到電針可以減少大鼠海馬組織中神經(jīng)細(xì)胞溶解、壞死，從而從動(dòng)物行為學(xué)、病理形態(tài)學(xué)上初步證實(shí)了電針神庭、百會(huì)對(duì)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的改善及其神經(jīng)保護(hù)作用。

本研究還顯示，局灶性腦缺血再灌注損傷引起NF-κB-p65抑制蛋白IκB的磷酸化降解，從而活化了NF-κB-p65，而電針能降低NF-κB-p65的活化。提示電針神庭、百會(huì)改善腦缺血再灌注損傷大鼠學(xué)習(xí)和記憶能力可能與抑制NF-κB-p65的活化有關(guān)。

對(duì)電針神庭和百會(huì)干預(yù)腦缺血再灌注損傷大鼠進(jìn)行認(rèn)知行為學(xué)、組織病理學(xué)和分子生物學(xué)的研究有助于全面闡明電針治療腦缺血再灌注損傷后學(xué)習(xí)記憶障礙的作用機(jī)制。仍需深化研究，為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

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Effect of Electroacupuncture on Learning and Memory Ability for Cerebral Ischemia/Reperfusion Injured Rats

FENG Xiao-dong, LIU Jiao,CHEN Li-dian.College of Rehabilitation Medicine,Fujian University of Traditional Chinese Medicine,Fuzhou 350122,Fujian, China

ObjectiveTo observe the effect of electroacupuncture at Shenting(DU24)and Baihui(DU20)on learning and memory ability,as well as the finding of histopathology and the expression of mRNA of nuclear factor κB p65(NF-κB-p65)and its inhibitor(IκB)in the hippocampus of rats with cerebral ischemia/reperfusion(I/R)injury.Methods45 male Sprague-Dawley rats were were randomly diveded into sham control group(SC,n=15),ischemia control group(IC,n=15)and electroacupuncture group(EA,n=15).The latter 2 groups were modeled as focal cerebral I/R injury,and the EA group received electroacupuncture at Shenting(DU24)and Baihui(DU20)for 14 d.They were evaluated with the step down test,their hippocampus was observed under HE staining and the level of NF-κB-p65 and IκB mRNA was determined with RT-PCR 14 d after modeling.ResultsThe frequence of shock was less,and the latency jumping down from the safe platform was longer in the EA group than in the IC group(P＜0.001).The damage of the nerve cell and the expression of NF-κB-p65 mRNA significantly decreased and the expression of IκB mRNA increased in the EA group compared with those of IC group(P＜0.001).ConclusionThe inhibition of NF-kB-p65 might mediate the recovery of learning and memory impairment after electroacupuncture for cerebral ischemia.

cerebral ischemia;electroacupuncture;learning and memory;nuclear factor κB;inhibitor of nuclear factor κB

R743.3

A

1006-9771(2013)03-0227-04

2012-12-20

2013-01-30)

1.福建省科技廳重點(diǎn)項(xiàng)目(No.2010I0007)；2.科技部國(guó)際科技合作項(xiàng)目(No.2011DFG33240)。

1.福建中醫(yī)藥大學(xué)康復(fù)醫(yī)學(xué)院，福建福州市350122；2.河南中醫(yī)學(xué)院，河南鄭州市450008。作者簡(jiǎn)介：馮曉東(1968-)，男，河南鄭州市人，博士研究生，教授，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，主要研究方向：腦病后功能障礙的康復(fù)和評(píng)定。通訊作者：陳立典(1962-)，男，福建政和市人，博士，教授，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，主要研究方向：中風(fēng)后認(rèn)知障礙、手功能障礙及痙攣肌的中西醫(yī)結(jié)合康復(fù)治療。

10.3969/j.issn.1006-9771.2013.03.007