付治卿，李小鷹，魯曉春，米亞非，周聲安

·基礎(chǔ)研究·

過表達(dá)肌漿網(wǎng)Ca2+-ATP酶對(duì)慢性心力衰竭犬神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的影響①

付治卿，李小鷹，魯曉春，米亞非，周聲安

目的 研究心肌過表達(dá)肌漿網(wǎng)Ca2+-ATP酶(SERCA2a)基因?qū)β孕牧λソ呷窠?jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的影響。方法超聲心動(dòng)圖檢測(cè)SERCA2a基因轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)慢性心力衰竭犬心臟收縮功能的影響，放射免疫法測(cè)定血管緊張素Ⅱ與心房利鈉肽、內(nèi)皮素-1、腫瘤壞死因子-α、白介素-6等神經(jīng)內(nèi)分泌因子。結(jié)果SERCA2a基因轉(zhuǎn)導(dǎo)后心力衰竭犬的心臟收縮功能得到改善(P＜0.05)，同時(shí)上述神經(jīng)內(nèi)分泌因子水平均減低(P＜0.05)。結(jié)論SERCA2a過表達(dá)能改善心肌收縮功能，阻斷神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的惡性循環(huán)，可能阻止或逆轉(zhuǎn)心肌重塑。

慢性心力衰竭；肌漿網(wǎng)Ca2+-ATP酶；過表達(dá)；神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)

[本文著錄格式]付治卿，李小鷹，魯曉春，等.過表達(dá)肌漿網(wǎng)Ca2+-ATP酶對(duì)慢性心力衰竭犬神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的影響[J].中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐,2013,19(2):129-131.

離體和小動(dòng)物在體實(shí)驗(yàn)[1-2]顯示，通過基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法增加肌漿網(wǎng)Ca2+-ATP酶(sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase,SERCA2a)的表達(dá)能夠改善衰竭心肌的收縮和舒張功能。我們的前期研究也顯示，在慢性心力衰竭犬心肌過表達(dá)SERCA2a可明顯改善心功能[3]。而慢性心力衰竭存在神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的過度激活，迄今尚未見SERCA2a過表達(dá)對(duì)神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)影響的報(bào)道。本研究擬探討過表達(dá)SERCA2a對(duì)神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

攜帶增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)基因和攜帶SERCA2a基因的重組腺相關(guān)病毒購自北京本元正陽基因技術(shù)股份有限公司，病毒滴度為1×1012v.g./ml。比格犬由解放軍總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 模型的制備和基因轉(zhuǎn)導(dǎo)

16只犬隨機(jī)分為對(duì)照組、心力衰竭(HF)組、EGFP組和SERCA2a組，每組4只。后三組以快速右心室持續(xù)起搏的方法構(gòu)建慢性心力衰竭犬模型。常規(guī)麻醉開胸后暴露心臟，剪開心包，縫制心包吊床，選擇前降支和心室左緣之間的左室前壁為注射區(qū)域。行網(wǎng)格狀注射，每個(gè)注射點(diǎn)之間相隔約1 cm，注射深度5 mm，每次注射0.1 ml，分別注射PBS溶液、重組腺相關(guān)病毒(Recombinant Adeno Associated Virus,rAAV) 1-EGFP、rAAV1-SERCA2a各1 ml，具體方法參照文獻(xiàn)[3]。

1.3 心功能檢查

于基因轉(zhuǎn)導(dǎo)30 d停止起搏30 min后，在動(dòng)物清醒狀態(tài)下行超聲心動(dòng)圖檢查評(píng)價(jià)心臟收縮功能[4]。

1.4 血液學(xué)檢查

1.4.1 樣品的收集 于基因轉(zhuǎn)導(dǎo)30 d時(shí)，清晨空腹從股靜脈抽取靜脈血，進(jìn)行不同的處理后將得到的血清或血漿，置于-80℃凍存待測(cè)。

1.4.2 樣品的處理

1.4.2.1 血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ) ①酶抑制劑的配制：按取5 ml靜脈血計(jì)，每管加0.30 mol/L EDTA-Na250 μl、0.34 mol/L 8-羥基喹啉50 μl、0.32 mol/L二巰基丙醇25 μl。②抽取靜脈血后，迅速注入放在冰水浴中冷卻的酶抑制劑抗凝管中，搖勻；即刻再放回冰水浴中冷卻，待離心時(shí)取出。4℃，1000 r/ min離心5 min，分離血漿。此操作在15 min內(nèi)完成。

1.4.2.2 心房利鈉肽(atrial natriuretic peptide,ANP)和內(nèi)皮素-1(endothelin-1,ET-1) ①酶抑制劑的配制：按取4 ml靜脈血計(jì)，每管加10%EDTA-Na230 μl、抑肽酶40 μl。②抽取靜脈血后，注入酶抑制劑抗凝管中，搖勻。4℃，3000 r/min離心10 min，分離血漿。

1.4.2.3 腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白介素-6(IL-6) 取靜脈血4 ml，注入試管中，室溫靜置凝固后，分離血清。

1.4.3 樣品的檢測(cè) 所有樣品交由解放軍總醫(yī)院科技開發(fā)中心放免研究所測(cè)定。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，組間變量比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)。顯著性水平α＝0.05。

2 結(jié)果

2.1 超聲心動(dòng)圖

與對(duì)照組相比，HF組、EGFP組犬左心房(LA)、左室舒張末內(nèi)徑(LVDd)均增大(P＜0.05)；SERCA2a組LA仍明顯增大(P＜0.01)，與HF組、EGFP組相比無顯著性差異(P＞0.05)；但LVDd較HF組、EGFP組有縮小的趨勢(shì)，但無顯著性差異(P＞0.05)。HF組、EGFP組每搏量(SV)、左室射血分?jǐn)?shù)(EF)及縮短分?jǐn)?shù)(FS)較對(duì)照組明顯降低(P＜0.01)；SERCA2a組SV、EF及FS與對(duì)照組比較無顯著性差異(P＞0.05)，SV、FS較HF組、EGFP組好轉(zhuǎn)(P＜0.05)，EF較EGFP組好轉(zhuǎn)(P＜0.05)，平均值較EGFP組分別增加94.83%、52.93%和68.6%。見表1。

2.2 犬神經(jīng)內(nèi)分泌指標(biāo)

HF組和EGFP組的所有神經(jīng)內(nèi)分泌因子較對(duì)照組均增高(P＜0.05)；而SERCA2a組與對(duì)照組相比無顯著性差異(P＞0.05)，除IL-6與HF組無顯著性差異(P＞0.05)外，其他神經(jīng)內(nèi)分泌因子較HF組、EGFP組降低(P＜0.05)。見表2。

表1 各組犬超聲心動(dòng)圖指標(biāo)的比較

表2 各組犬神經(jīng)內(nèi)分泌因子的比較

3 討論

神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的激活是慢性充血性心力衰竭時(shí)機(jī)體的一種代償機(jī)制?，F(xiàn)已證明心力衰竭患者表現(xiàn)為交感神經(jīng)系統(tǒng)(SNS)、腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAS)、心鈉素(ANP)及血管加壓素的激活。長(zhǎng)期神經(jīng)內(nèi)分泌活性增高不僅抑制心功能、加重血流動(dòng)力學(xué)紊亂，還直接損害心肌、激發(fā)心肌細(xì)胞肥厚、促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡、心肌重構(gòu)和心肌纖維化，其相互作用，形成惡性循環(huán)。

細(xì)胞因子是由各種免疫細(xì)胞和某些非免疫細(xì)胞經(jīng)刺激而產(chǎn)生的一類小分子多肽，作為細(xì)胞間信號(hào)傳遞系統(tǒng)，這些細(xì)胞因子多以旁分泌或自分泌形式，通過與靶細(xì)胞表面特異性細(xì)胞因子受體結(jié)合而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。許多研究表明，細(xì)胞因子活化與心力衰竭的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。與慢性心力衰竭有關(guān)的細(xì)胞因子主要有TNF-α、IL-6等。這些細(xì)胞因子作用于心臟，可以促進(jìn)心肌重塑、加重心肌損傷[5-6]。Wu等的研究也證實(shí)，炎性細(xì)胞因子通過下調(diào)SERCA2a基因表達(dá)、減少舒張期鈣攝取而引起舒張功能不全[7]。本研究發(fā)現(xiàn)HF組和EGFP組的AngⅡ與ANP、TNF-α、IL-6高于對(duì)照組，表明上述神經(jīng)內(nèi)分泌因子的過度激活共同參與心力衰竭的發(fā)生、發(fā)展。

有實(shí)驗(yàn)證明，心肌轉(zhuǎn)基因過表達(dá)SERCA2a可以顯著改善心臟的舒縮功能。本研究利用超聲心動(dòng)圖檢測(cè)心力衰竭犬過表達(dá)SERCA2a的結(jié)果也顯示，SERCA2a組犬的SV、EF及FS較HF組、EGFP組好轉(zhuǎn)(P＜0.05)，平均值較EGFP組分別增加94.83%、52.93%和68.6%，而與對(duì)照組相比無顯著性差異。同時(shí)SERCA2a組中，AngⅡ與ANP、TNF-α、IL-6等神經(jīng)內(nèi)分泌指標(biāo)較HF組和EGFP組降低，與對(duì)照組相比無顯著性差異，表明過表達(dá)SERCA2a改善心肌收縮功能后，室壁應(yīng)力降低，神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的惡性循環(huán)被阻斷，從而可阻止或逆轉(zhuǎn)心肌重塑。具體機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。

SERCA2a在心肌過表達(dá)阻斷了全身神經(jīng)內(nèi)分泌和細(xì)胞因子的惡性循環(huán)，使其血清含量顯著降低，從而使得心臟收縮功能得到進(jìn)一步改善。

[1]del Monte F,Harding SE,Schmidt U,et al.Restoration of contractile function in isolated cardiomyocytes from failing human hearts by gene transfer of SERCA2a[J].Circulation,1999,100 (23):2308-2311.

[2]Muller OJ,Lange M,Rattunde H,et al.Transgenic rat hearts over expressing SERCA2a show improved contractility under baseline conditions and pressure overload[J].Cardiovasc Res, 2003,59(2):380-389.

[3]付治卿,李小鷹,魯曉春,等.心肌肌漿網(wǎng)Ca2+-ATP酶基因轉(zhuǎn)導(dǎo)改善慢性心力衰竭犬心功能的研究[J].中國(guó)病理生理雜志, 2008,24(6):1047-1050.

[4]付治卿,李小鷹,劉濤,等.超聲心動(dòng)圖在評(píng)估犬慢性心力衰竭模型中的作用[J].心臟雜志,2007,19(5):528-530.

[5]Li W,Olshansky B.Inflammatory cytokines and nitric oxide in heart failure and potential modulation by vagus nerve stimulation[J].Heart Fail Rev,2011,16(2):137-145.

[6]Tamariz L,Hare JM.Inflammatory cytokines in heart failure: roles in aetiology and utility as biomarkers[J].Eur Heart J, 2010,31(7):768-770.

[7]Wu CK,Lee JK,Chiang FT,et al.Plasma levels of tumor necrosis factor-α and interleukin-6 are associated with diastolic heart failure through downregulation of sarcoplasmic reticulum Ca2+ATPase[J].Crit Care Med,2011,39(5):984-992.

Effect of Sarcoplasmic Reticulum Ca2+-ATPase Overexpression on Neuroendocrine System in Chronic Heart Failure Beagles

FU Zhi-qing,LI Xiao-ying,LU Xiao-chun,et al.First Department of Geriatric Cardiology,Chinese PLA General Hospital,Beijing 100853,China

ObjectiveTo explore the effect of sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase(SERCA2a)overexpression on neuroendocrine system in chronic heart failure beagles.MethodsThe cardiac contraction function of chronic heart failure beagles were assessed by echocardiography before and after SERCA2a gene transduction.Radiation immune method was used to test the serum level of neuroendocrine factors such as AngiotensinⅡ,atrial natriuretic peptide,endothelin-1 and TNF-α,IL-6.ResultsThe cardiac contraction function of chronic heart failure beagles improved greatly(P＜0.05),and the serum levels of neuroendocrine factors significantly reduced after SERCA2a overexpression(P＜0.05).ConclusionThe vicious circle of neuroendocrine system may be blocked partially by SERCA2a overexpression.

chronic heart failure;sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase;overexpression;neuroendocrine system

R541.6

A

1006-9771(2013)02-0129-03

2012-07-20

2012-08-29)

解放軍總醫(yī)院南樓心血管一科，北京市100853。作者簡(jiǎn)介：付治卿(1977-)，女，山西壽陽縣人，博士，主治醫(yī)師，主要研究方向：慢性心力衰竭的治療。通訊作者：李小鷹。

10.3969/j.issn.1006-9771.2013.02.008