袁廷偉，孫芳玲，王曉峰，艾厚喜，王文，龔大春

莫諾苷對局灶性腦缺血再灌注大鼠凝血四項的影響①

袁廷偉1,2，孫芳玲2，王曉峰2，艾厚喜2，王文2，龔大春1

目的 研究莫諾苷對局灶性腦缺血再灌注大鼠纖維蛋白原(Fib)、凝血酶原時間(PT)、活化部分凝血活酶時間(APTT)和凝血酶時間(TT)的影響。方法用線栓法制備大鼠局灶性腦缺血再灌注模型，造模后，分別給予莫諾苷低劑量(30 mg/kg)、中劑量(90 mg/kg)、高劑量(270 mg/kg)連續(xù)灌胃7 d，阿司匹林(ASA)為陽性對照藥。使用試劑盒分別檢測Fib、PT、APTT、TT指標(biāo)的變化。結(jié)果與假手術(shù)組相比，模型組Fib含量顯著增加(P＜0.001)，PT、APTT、TT顯著縮短(P＜0.001)；與模型組相比，莫諾苷能明顯降低Fib含量(P＜0.01)，延長PT、APTT、TT(P＜0.05)。結(jié)論莫諾苷具有對抗局灶性腦缺血再灌注大鼠凝血功能的作用。

莫諾苷；凝血；缺血/再灌注；大鼠

[本文著錄格式]袁廷偉，孫芳玲，王曉峰，等.莫諾苷對局灶性腦缺血再灌注大鼠凝血四項的影響[J].中國康復(fù)理論與實踐, 2013,19(2):104-106.

腦卒中具有高發(fā)病率、高致殘率的特點。中國每年新發(fā)腦卒中患者約200萬人，其中70%～80%的腦卒中患者因為殘疾不能獨立生活[1]。缺血性腦卒中占腦卒中的80%以上，是由于腦部主要血管短期內(nèi)出現(xiàn)狹窄或閉塞而導(dǎo)致局部或全腦缺血、缺氧、甚至梗死的一種疾病。缺血性腦卒中具有高死亡率、高復(fù)發(fā)率和高致殘率的特點，嚴(yán)重威脅中老年人的健康和生活質(zhì)量，并且近年來呈現(xiàn)上升和低齡化的發(fā)病趨勢。腦缺血后腦微血管發(fā)生管徑變細(xì)、灌注壓力降低等血管病變，引起血流動力學(xué)異常。高黏度的血液在此情況下易導(dǎo)致腦組織灌注不足、缺氧和代謝障礙，同時引起腦組織血管壁的物理損傷以及血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，容易形成血栓。凝血四項包括纖維蛋白原(fibrinogen, Fib)含量、凝血酶原時間(prothrombin time,PT)、活化部分凝血活酶時間(activated partial thromboplastin time,APTT)和凝血酶時間(thrombin time,TT)，是判斷凝血系統(tǒng)病理變化和指導(dǎo)臨床用藥的重要指標(biāo)。莫諾苷是本實驗室從中藥山茱萸中提取、分離得到的單體化合物。前期研究表明，莫諾苷對局灶性腦缺血再灌注模型大鼠有神經(jīng)保護作用[2]。本文旨在探討莫諾苷對局灶性腦缺血模型大鼠凝血四項的影響，為進一步研究莫諾苷腦保護作用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物

莫諾苷：由首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院藥物研究室從山茱萸中提取制備，為淡黃色粉末，高效液相色譜分析顯示純度為98.5%，蒸餾水溶解成所需濃度藥液備用。阿司匹林(acetyl salicylic acid,ASA)：SIGMA公司產(chǎn)品，蒸餾水溶解備用，以0.1 mol/L NaHCO3調(diào)pH至7.0左右，再加蒸餾水稀釋到所需濃度。

1.2 試劑及儀器

Fib含量測定試劑盒、PT測定試劑盒、TT測定試劑盒和APTT測定試劑盒均為上海太陽生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。Microfuge低溫離心機：美國Beckman公司。

1.3 動物及模型制備

SPF級雄性Sprague-Dawley大鼠，體重260～280 g，平均(260±10)g，由解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供，合格證號：SCXK(軍)2007-004。

1.3.1 模型制備 參照Longa等[3]所介紹的大腦中動脈線栓模型(middle cerebral artery occlusion,MCAO)制備，并稍加改進。大鼠術(shù)前禁食12 h。10%水合氯醛(400 mg/kg)腹腔注射麻醉后，頸正中線切口，沿胸鎖乳突肌分離肌肉和筋膜，暴露右側(cè)頸總動脈。分離右側(cè)頸外動脈和頸內(nèi)動脈。于近心端結(jié)扎頸總動脈，且在頸總動脈分岔處結(jié)扎頸外動脈。動脈夾夾閉頸內(nèi)動脈，在近心端距頸總動脈分岔約4 mm處用眼科剪剪一斜行細(xì)小動脈切口，將直徑0.28 mm的栓線從頸總動脈插入頸內(nèi)動脈約18 mm，此時栓線已進入大腦中動脈，到達大腦前動脈起始部，造成大腦中動脈供血相關(guān)區(qū)的梗死灶。栓塞30 min后緩慢拔出栓線，實現(xiàn)再灌注。假手術(shù)組大鼠除插入栓線深度為10 mm外，其余操作與模型手術(shù)組相同。

1.3.2 模型成功評價標(biāo)準(zhǔn) 參照Longa法[3]的5級評分法對實驗動物的神經(jīng)行為學(xué)進行評分。0分：無神經(jīng)系統(tǒng)損傷癥狀；1分：不能完全伸展對側(cè)前爪；2分：向左側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分：向?qū)?cè)傾斜；4分：不能自發(fā)行走，意識喪失。1～3分為造模成功。

1.3.3 分組及給藥 隨機將動物分為6組，每組6只：假手術(shù)組、模型組、ASA組(10 mg/kg)、莫諾苷低、中、高劑量組(30 mg/kg，90 mg/kg，270 mg/kg)。采用灌胃給藥途徑，每天1次，連續(xù)給藥7 d。假手術(shù)組和模型組給予蒸餾水灌胃。

1.4 大鼠凝血四項的測定

1.4.1 血漿Fib含量測定 取末次給藥后完成神經(jīng)行為學(xué)評分的大鼠，用10%水合氯醛(400 mg/kg)腹腔注射麻醉，腹主動脈采血，收集于3.8%枸櫞酸鈉抗凝管中，3000 r/min離心10 min，取上清血漿按Fib含量測定試劑盒說明書進行測定。具體為：取待測血漿200 μl，37℃預(yù)溫3 min，加入凝血酶溶液100μl，測定凝固時間(s)。以不同濃度Fib定值血漿含量(mg/ml)為橫坐標(biāo)，以相應(yīng)的凝固時間(s)為縱坐標(biāo)，在雙對數(shù)坐標(biāo)系上做標(biāo)準(zhǔn)曲線，待測樣本Fib含量可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上直接讀出，記錄Fib含量(mg/ml)。

1.4.2 血漿PT測定 血漿制備同上，取上清血漿按PT測定試劑盒說明書進行測定。取待測血漿100μl，37℃預(yù)溫3 min，加入37℃預(yù)溫PT試劑200μl，記錄凝固時間(s)，即為PT值。

1.4.3 血漿APTT測定 血漿制備同上，取上清血漿按TT測定試劑盒說明書進行測定。取待測血漿100μl，加入APTT試劑100μl，37℃預(yù)溫5 min；加入37℃預(yù)溫0.025 mol/L CaCl2溶液100μl，記錄凝固時間(s)，即為APTT值。

1.4.4 血漿TT測定 血漿制備同上，取上清血漿按TT測定試劑盒說明書進行測定。取待測血漿200μl，37℃預(yù)溫3 min，加入TT試劑100μl，記錄凝固時間(s)，即為TT值。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行統(tǒng)計處理，結(jié)果以(±s)表示。檢驗方差齊性后用單因素方差分析(one-way analysis of variance,ANOVA)比較組間差異，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠血漿Fib含量顯著升高(P＜0.001)，PT、APPT、TT顯著縮短(P＜0.001)；與模型組相比，莫諾苷3個劑量組的PT、APTT均顯著延長(P＜0.001)，莫諾苷中劑量組和高劑量組Fib含量明顯降低(P＜0.01，P＜0.001)，莫諾苷中劑量組和高劑量組的TT延長(P＜0.05，P＜0.001)。見表1。

3 討論

缺血性腦卒中是腦血管疾病中最常見的高致殘率的疾病，主要發(fā)病人群為中老年人。伴隨著中國老齡人口高峰的到來，積極研究腦卒中的病理生理機制及尋找有效的預(yù)防治療手段具有重要的社會意義和經(jīng)濟價值。

表1 莫諾苷對各組大鼠Fib、PT、APTT、TT的影響

血液流變異常與缺血性腦病具有密切的聯(lián)系[4]。有研究認(rèn)為，血液流變和凝血功能的異常所導(dǎo)致的高黏血癥和高凝血癥是心腦血管疾病的主要病因之一[5]。在缺血性腦病時，機體所處的病理狀態(tài)會進一步加速血液流變狀態(tài)的惡化，引起惡性循環(huán)[6]。臨床上通過監(jiān)測血液流變學(xué)的變化來預(yù)測缺血性腦卒中的進展，以及判斷藥物治療的效果。因此，觀察血液流變學(xué)的變化對深入了解缺血性腦血管病的病理狀態(tài)以及對疾病的診斷、治療和臨床監(jiān)護有一定的參考價值[7]。

血漿Fib是促進血小板聚集最主要的血液蛋白，引起血液黏度和血液流變學(xué)改變；APTT和PT主要反映內(nèi)源性和外源性凝血系統(tǒng)狀況；而TT主要反映Fib轉(zhuǎn)為纖維蛋白的時間。凝血四項能有效反映患者的凝血功能。近年來，肝素、香豆素、希美加群等抗凝藥物在臨床以及基礎(chǔ)研究中取得了一定的發(fā)展[8]。但抗凝藥研究尚未解決的根本問題是如何使抗凝藥物能夠區(qū)別有害的病理性血栓與生理形成的、起恢復(fù)和保持血管完整性作用的止血血栓。

本實驗中，我們采用線栓法制作大鼠MCAO模型，較好地模擬了臨床缺血性腦血管病的病理過程。通過模型大鼠凝血四項的檢測發(fā)現(xiàn)，局灶性腦缺血早期凝血功能發(fā)生障礙。而莫諾苷能顯著延長模型大鼠的APTT、PT和TT，表明莫諾苷能同時抑制內(nèi)源性及外源性凝血因子的活性，有抗凝血作用。Fib在血小板凝聚過程中起著重要作用。血小板被激活時，其膜上形成Fib受體，通過Fib的連接作用形成血小板聚集體，最終形成血栓。莫諾苷能顯著降低Fib的含量，抑制血栓的形成，具有很好的抗凝血作用。

本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，莫諾苷具有神經(jīng)保護作用，并能在體外具有抗血栓形成和抗血小板聚集的作用[9]。提示莫諾苷很有可能是具有多作用靶點、新作用機制的治療缺血性腦卒中的有效藥物。但體內(nèi)抗凝機制復(fù)雜，尤其要求藥物能選擇性作用于病理性血栓的形成。因此，莫諾苷抗凝血治療缺血性腦血管病的作用仍需更進一步的研究。

[1]吳兆蘇,姚崇華,趙冬.我國人群腦卒中發(fā)病率、死亡率的流行病學(xué)研究[J].中華流行病學(xué)雜志,2003,24(3):236-239.

[2]Wang W,Xu J,Li L,et al.Neuroprotective effect of morroniside on focal cerebral ischemia in rat[J].Brain Res Bull,2010, 83(5):196-201.

[3]Longa EZ,Weinstein PR,Carlson S,et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniotomy in rats[J].Stroke, 1989,20(1):84-91.

[4]石志革,包仕堯.缺血性腦卒中病人的血液流變學(xué)和血糖水平相關(guān)性研究[J].中國血液流變學(xué)雜志,2004,14(4):470-473.

[5]席玉冰.血液流變學(xué)在心腦血管疾病方面的應(yīng)用價值[J].實用醫(yī)技雜志,2006,18(3):1405-1406.

[6]張鋼,高鈺琪,張璐.缺氧對大鼠血液流變學(xué)特性的影響[J].重慶醫(yī)學(xué),2006,35(17):1574-1576.

[7]尚人才,劉志萍.老年腦血栓患者血液流變及血脂指標(biāo)觀察[J].中國血液流變學(xué)雜志,2000,10(1):61-62.

[8]段云霞,陳小玉,張梓倩,等.缺血性腦卒中治療藥物研究進展[J].中央民族大學(xué)學(xué)報,2012,21(2):65-70.

[9]王曉峰,陳乃宏,王文.莫諾苷對家兔血小板聚集的影響[J].中國康復(fù)理論與實踐,2010,16(11):1029-1030.

Effect of Morroniside on Coagulation in Focal Cerebral Ischemia/Reperfusion in Rats

YUAN Ting-wei,SUN Fang-ling,WANG Xiao-feng,et al.China Three-Gorges University,Yichang 443002,Hubei,China

ObjectiveTo investigate the effects of morroniside on fibrinogen(Fib),prothrombin time(PT),activated partial thromboplastin time(APTT)and thrombin time(TT)in focal cerebral ischemia/reperfusion in rats.MethodsThe animal model was induced with occlusion of middle cerebral artery(MCAO)with suture embolus,and morroniside was then administered intragastrically at the dose of 30,90 and 270 mg/kg for 7 d.Acetyl salicylic acid was taken as positive control drug.The content of Fib,and PT,APTT and TT were measured withrelated kits.ResultsCompared with the sham-operated group,the concentration of Fib significantly increased(P＜0.001)and PT,APTT and TT significantly shortened in the model group(P＜0.001);however,compared with the model group,morroniside significantly decreased Fib content(P＜0.01)and prolonged PT,APTT and TT(P＜0.05).ConclusionMorroniside can antagonize the coagulation function in focal cerebral ischemia/reperfusion in rats.

morroniside;coagulation;ischemia/reperfusion;rats

R743

A

1006-9771(2013)02-0104-03

2012-11-22

2013-01-09)

1.科技部“十二五”重大創(chuàng)新藥專項(No.2012ZX09102-201-016)；2.國家自然科學(xué)基金(No.81173575)；3.國家自然科學(xué)基金(No. 30740053)；4.北京市自然科學(xué)基金(No.7062031)；5.北京市教委科研基地-科技創(chuàng)新平臺(No.111219)；6.北京市衛(wèi)生系統(tǒng)高層次衛(wèi)生技術(shù)人才(No. 2011-3-097)。

1.三峽大學(xué)，湖北宜昌市443002；2.首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院藥物研究室，北京市100053。作者簡介：袁廷偉(1987-)，男，湖北宜昌市人，碩士研究生，主要研究方向：神經(jīng)藥理。通訊作者：龔大春。

10.3969/j.issn.1006-9771.2013.02.002