葉雨丹，柴春彥*，劉國艷，王藝如

(上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，上海 200240)

光電型傳感法快速檢測食品中大腸桿菌

葉雨丹，柴春彥*，劉國艷，王藝如

(上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，上海 200240)

大腸桿菌可在異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)的誘導(dǎo)下分泌β-半乳糖苷酶，β-半乳糖苷酶特異性的催化氯酚紅-β-D-吡喃半乳糖苷(CPRG)生成氯酚紅(CPR)發(fā)生顯色反應(yīng)，而反應(yīng)顏色的深淺和大腸桿菌的濃度具有一定的對應(yīng)關(guān)系，從而建立檢測大腸桿菌的光電型傳感方法。結(jié)果表明：用光電傳感方法檢測大腸桿菌，最適反應(yīng)時間4h、最適反應(yīng)pH7.5。樣品中細(xì)菌濃度的對數(shù)與反射光信號值之間呈現(xiàn)良好的對應(yīng)關(guān)系(R=－0.98944，P＜0.01)，線性方程為Y=1426.10485－97.23368X，檢測限可達(dá)104CFU/mL?；陬伾磻?yīng)的光電傳感方法檢測大腸桿菌具有快速、簡便、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，具有良好的研發(fā)和應(yīng)用前景。

大腸桿菌；光電型傳感器；β-半乳糖苷酶；光電型試紙條

飲水和食品中大腸桿菌(E.coli)污染的監(jiān)測是目前食品衛(wèi)生安全控制過程中必檢的指標(biāo)[1]。當(dāng)前大腸桿菌的檢測技術(shù)有傳統(tǒng)的細(xì)菌檢測方法如細(xì)菌直接計(jì)數(shù)法、微生物培養(yǎng)法，檢測效果準(zhǔn)確，但是檢測方法操作繁瑣、耗時長；生物學(xué)法如ATP生物發(fā)光法、免疫學(xué)方法、PCR技術(shù)等，特異性強(qiáng)、靈敏度高，但需要專業(yè)人員和專業(yè)設(shè)備，且無法滿足食品中常見大腸桿菌污染菌大批量快速檢測的需要[2-3]。對于食品中大腸桿菌的檢測，首先要滿足方法的可靠性和檢測的靈敏度，如果能夠快速檢測，同時價(jià)格低廉、操作簡便，則更加實(shí)用和易于普及推廣等[4-7]。近年來，國內(nèi)外在研究使用電化學(xué)生物傳感法檢測微生物方面取得了很大的進(jìn)展，本實(shí)驗(yàn)旨在探索一種快速檢測大腸桿菌的光電型生物傳感方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大腸桿菌 實(shí)驗(yàn)室自行分離、鑒定；氯酚紅(CPR)、異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG) 美國Sigma公司；肉湯培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂 上海伊華醫(yī)學(xué)科技有限公司；細(xì)菌凍存液 上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Na2HPO4、NaH2PO4、HCl、NaOH等化學(xué)試劑均為分析純 中國醫(yī)藥集團(tuán)上海試劑公司；實(shí)驗(yàn)用水均為二次蒸餾水。

1.2 儀器與設(shè)備

ELX800酶標(biāo)儀 美國Bio-Tex公司；微型光電型生物傳感儀由本實(shí)驗(yàn)室與上海交通大學(xué)電子與信息學(xué)院袁景淇教授實(shí)驗(yàn)室合作開發(fā)；pHS-3C精密pH計(jì) 上海精密儀器儀表有限公司；玻璃纖維 上海統(tǒng)笙有限公司。

1.3 方法

1.3.1 光電型傳感方法檢測食品中大腸桿菌的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理

大腸桿菌本身含有多種酶，在外界條件誘導(dǎo)下能分泌一些酶[8-9]。大腸桿菌在IPTG的誘導(dǎo)下可以分泌β-半乳糖苷酶，是較為典型的大腸桿菌誘導(dǎo)酶。β-半乳糖苷酶作用于氯酚紅-β-D-吡喃半乳糖苷(chlorophenol red-β-D-galactopyranoside，CPRG)發(fā)生氧化還原反應(yīng)，使黃色的CPRG生成紅色的氯酚紅(chlorophenol red，CPR)，是明顯的顏色反應(yīng)[10-14]，該反應(yīng)顏色變化的深淺與大腸桿菌的濃度之間呈明顯的相關(guān)性。根據(jù)此反應(yīng)原理，參考相關(guān)文獻(xiàn)并結(jié)合本實(shí)驗(yàn)的實(shí)際情況，使用本實(shí)驗(yàn)室自行研制的光電檢測儀，測定不同濃度的大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)液對應(yīng)的光反射強(qiáng)度值的大小，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并優(yōu)化反應(yīng)條件，建立檢測大腸桿菌濃度的光電型生物傳感方法。

1.3.2 光電型傳感器的檢測

1.3.2.1 檢測大腸桿菌試紙條的組裝

試紙條組裝如圖1所示。

圖1 快速檢測大腸桿菌的試紙條設(shè)計(jì)圖Fig.1 The design of test strip for E. coli detection

1.3.2.2 檢測過程

精確稱取CPRG 0.01g，用pH7.5的PB緩沖液10mL將其溶解，將已被誘導(dǎo)產(chǎn)生半乳糖苷酶的大腸桿菌樣品滴入96孔酶標(biāo)板中，加入配制好的CPRG溶液，反應(yīng)4h，將顯色后的混合液3滴滴在試紙條上，放入光電傳感器的檢測窗口，測定并記錄顯示數(shù)據(jù)。

1.3.3 大腸桿菌的篩選與培養(yǎng)

1.3.3.1 無菌培養(yǎng)基的制備

取營養(yǎng)肉湯22g、蒸餾水1000mL，于121℃溫度條件滅菌15min。

1.3.3.2 大腸桿菌的篩選與培養(yǎng)[15]

用無菌注射器吸取豆腐浸出液1mL接種到20mL無菌培養(yǎng)基，37℃搖床培養(yǎng)12h，利用麥康凱培養(yǎng)基篩選，挑取粉紅色菌落，接種于20mL無菌培養(yǎng)基，37℃增菌培養(yǎng)。

1.3.4 大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

將大腸桿菌菌懸液用0.01mol/L B-R緩沖液(pH6)配成濃度梯度為104～109CFU/mL，然后進(jìn)行半乳糖苷酶的誘導(dǎo)：首先取5mL營養(yǎng)肉湯制作的菌懸液，加入400μL濃度10mmol/L的IPTG溶液，37℃水浴培養(yǎng)45min誘導(dǎo)β-半乳糖苷酶，然后終止反應(yīng)10min。4000r/min離心10min，收集大腸桿菌，加入100μL PB制成懸浮液作為待測液[16-19]。將100μL待測液加入96孔酶板中，再加入等量CPRG溶液，混合均勻后于室溫條件下反應(yīng)。4h后出現(xiàn)顯色反應(yīng)，滴加兩滴待測液至試紙條上，將試紙條置于測試孔檢測后記錄光電傳感器顯示的吸光強(qiáng)度。根據(jù)不同濃度大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)液所對應(yīng)的不同光反射強(qiáng)度，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，用Origin 6.0求出回歸方程。

1.3.5 反應(yīng)條件的優(yōu)化

1.3.5.1 最適反應(yīng)時間的確定

配制細(xì)菌群落數(shù)為105、106、107CFU/mL的大腸桿菌進(jìn)行半乳糖苷酶的誘導(dǎo)，用光電型傳感器進(jìn)行顯色反應(yīng)的檢測，每組做5個平行，結(jié)果取平均值。當(dāng)光反射強(qiáng)度隨著時間發(fā)生變化時，反射強(qiáng)度達(dá)到最小時說明反應(yīng)進(jìn)行充分，隨后反射光信號基本不變，以此確定反應(yīng)最適時間。

1.3.5.2 最適反應(yīng)pH值的確定

用酸堿緩沖液，即1mol/L的HCl-NaOH溶液將產(chǎn)生半乳糖苷酶的大腸桿菌誘導(dǎo)待測液的pH值分別調(diào)節(jié)為4、5、6、7、7.5、8、9、10，分別滴入檢測試紙條，用光電型傳感器進(jìn)行顯色反應(yīng)的檢測，每個pH值做5個平行，結(jié)果取平均值。當(dāng)光反射強(qiáng)度隨著pH值的變化而發(fā)生變化時，光反射強(qiáng)度達(dá)到最小時說明對應(yīng)的pH值為反應(yīng)最適pH值。

1.3.5.3 準(zhǔn)確性的測定

使用光電型傳感器檢測已知含有大腸桿菌的50個陽性樣品與不含大腸桿菌的50個陰性樣品，按照公式(1)計(jì)算該方法的準(zhǔn)確率。

1.3.5.4 回收率的測定

配制細(xì)菌群落數(shù)為105CFU/mL的大腸桿菌溶液，在光電型傳感器上進(jìn)行檢測，平行10次，記錄光反射信號強(qiáng)度并計(jì)算用光電傳感法測得的大腸桿菌濃度，按照公式(2)計(jì)算該方法檢測大腸桿菌濃度的回收率。

1.3.6 光電傳感方法與傳統(tǒng)平板法檢測大腸桿菌效果的對比

平板劃線法是一種菌種的分離純化技術(shù)，可以把混雜在一起的微生物或同一微生物群體中的不同細(xì)胞用接種環(huán)在平板培養(yǎng)基表面通過分區(qū)劃線稀釋而得到較多獨(dú)立分布的單個細(xì)胞，是一種傳統(tǒng)測定細(xì)菌個數(shù)的方法。選取市場上銷售的豆腐樣品，取其浸出液，121℃滅菌15min，吸取人為稀釋的102CFU/mL大腸桿菌菌懸液接種至滅菌的豆腐浸出液中進(jìn)行增菌培養(yǎng)，做5個平行樣本，每隔0.5h進(jìn)行檢測，并對平板劃線法和光電型生物傳感器法的檢測效果進(jìn)行比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 光電試紙條的制備

圖2 光電型試紙條實(shí)物圖Fig.2 The photoelectric test strip

由于大腸桿菌含量越高，誘導(dǎo)出的β-半乳糖苷酶越多，催化反應(yīng)越完全，產(chǎn)生紅色的CPR越多。隨著樣品中大腸桿菌濃度的不斷增減，顏色由黃色到紫紅色變化(圖2表示淺灰色至深黑色)。

2.2 最適反應(yīng)時間的確定

圖3 反應(yīng)時間對光反射強(qiáng)度的影響Fig.3 The curve of strip light reflection intensity versus time after color reaction of different concentrations of E. coli

由圖3可知，當(dāng)光反射強(qiáng)度達(dá)到最低點(diǎn)時反應(yīng)充分，隨后曲線趨于平穩(wěn)。同時可以看出向試紙條滴加不同濃度的大腸桿菌溶液后，顯色反應(yīng)的速度隨著大腸桿菌濃度的增加有所加快。在反應(yīng)4h之后，反應(yīng)基本完成，因此選取4h為最佳反應(yīng)時間。

2.3 最適反應(yīng)pH值的確定

圖4 反應(yīng)pH值對光反射強(qiáng)度的影響Fig.4 The curve of strip light reflection intensity versus time after color reaction at different pH levels

由圖4可以看出，當(dāng)用pH7.5的緩沖液配制大腸桿菌溶液時，所得到的光反射率最小，說明在此pH值條件下反應(yīng)最為充分，當(dāng)反應(yīng)pH值偏小或偏大時，都會對酶的催化活性產(chǎn)生影響。β-半乳糖苷酶在pH7.5，即在中性略堿性條件有最強(qiáng)催化能力，可以得到較理想的顯色效果，因此選取pH7.5為最適反應(yīng)pH值。

2.4 光電型傳感器檢測大腸桿菌的標(biāo)準(zhǔn)曲線

隨著大腸桿菌濃度的增加，顯色試紙條的反射率逐漸降低。而且光反射率與相應(yīng)細(xì)菌濃度的對數(shù)呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系，回歸方程為Y=1426.10485－97.23368X，R=－0.98944(P＜0.01)，檢測限為104CFU/mL。

2.5 準(zhǔn)確率及回收率的檢測結(jié)果

用本實(shí)驗(yàn)建立的檢測大腸桿菌的光電型傳感方法檢測50個陽性樣品和50個陰性樣品，結(jié)果有46個陽性樣品檢測結(jié)果為陽性，50個陰性樣品檢測為陰性，其準(zhǔn)確率達(dá)到了96%。當(dāng)大腸桿菌濃度較低時，也可通過增菌的方式來提高檢測的準(zhǔn)確性，大約增菌3h即可達(dá)到檢測標(biāo)準(zhǔn)。另外，用光電型傳感器檢測已知濃度的大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)樣品，經(jīng)統(tǒng)計(jì)其回收率為91.4%。

2.6 光電傳感方法與傳統(tǒng)平板法檢測大腸桿菌效果的對比

表1 生物傳感法與平板計(jì)數(shù)法對人為增菌處理的豆腐樣品的檢測結(jié)果對比Table1 Comparison of the results obtained by biosensor method and plate count method for artificially enriched

從表1可以看出，在增菌3h后，可以根據(jù)樣品在傳感器檢測時反射光強(qiáng)度與標(biāo)準(zhǔn)曲線相應(yīng)的強(qiáng)度對應(yīng)的細(xì)菌含量值對比，從而較為準(zhǔn)確地檢測到大腸桿菌含量。并且利用生物傳感法與平板計(jì)數(shù)法無顯著性差異(P＞0.05)，但是時間卻大大短于平板計(jì)數(shù)法所需的48h[20-21]。因此，與傳統(tǒng)的平板法相比，光電傳感法具有更快速、簡便，檢測費(fèi)用更低等優(yōu)點(diǎn)。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)探索了一種檢測大腸桿菌的新方法，即使用光電型傳感器對大腸桿菌進(jìn)行檢測。該法的最適反應(yīng)時間4h、最適反應(yīng)pH7.5，準(zhǔn)確率和回收率都達(dá)到了90%以上。當(dāng)大腸桿菌濃度較低時，可通過增菌的方式來提高檢測的準(zhǔn)確性，大約增菌3h 即可達(dá)到檢測標(biāo)準(zhǔn)，優(yōu)于傳統(tǒng)劃平板的48h 。樣品中細(xì)菌濃度的對數(shù)與光反射強(qiáng)度之間呈現(xiàn)良好的對應(yīng)關(guān)系(R=－0.98944，P＜0.01)，線性方程為Y=1426.10485－97.23368X，檢測限可達(dá)104CFU/mL。該方法簡便易行，為大腸桿菌的檢測提供了一種新途徑。

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Development of Photoelectric Sensor for Detection of E. coli

YE Yu-dan，CHAI Chun-yan*，LIU Guo-yan，WANG Yi-ru
(School of Agriculture and Biology, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200240, China)

E. coli secretes β-galactosidase under the induction of isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG). The β-galacosidase catalyzes chlorophenol ReD-β-D-galactopyranoside (CPRG) to form chlorophenol red (CPR) along with a color reaction. Based on the significant correlation between intensity of the color change from the reaction and the concentration of E. coli, a photoelectric sensor for detecting E. coli was developed. The results showed that the optimal pH for the reaction system was 7.5 and the optimal time for enzymatic reaction was 4 h. The logarithm value of bacterial concentration in samples presented a significant correlation with the reflected light signal value (R = －0.98944, P ＜ 0.01), the linear equation was Y = 1426.10485 － 97.23368X. The detection limit was 104CFU/mL. The photoelectric sensor based on color reaction can provide a quick, simple and cheap way to detect E. coli in food samples and therefore deserves further development and application.

E.coli；photoelectronic sensor；β-galactosidase；photoelectric test strip

O657.1

A

1002-6630(2013)18-0185-04

10.7506/spkx1002-6630-201318037

2012-07-28

國家科學(xué)技術(shù)部和上海市科委共同資助的“世博專項(xiàng)”項(xiàng)目(06dz05825)；上海獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目(0890259)

葉雨丹(1988—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称钒踩珯z測與控制。E-mail：yoyoleaf@sina.com

*通信作者：柴春彥(1969—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称钒踩珯z測與控制。E-mail：cychai88@sjtu.edu.cn