張 馳，邱皓璞，張 筠

(1.東南大學(xué) 生物電子學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210018；2.國(guó)家農(nóng)副產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，南京市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院，江蘇 南京 210028；3.先聲再康江蘇藥業(yè)有限公司，江蘇 南京 210042)

熒光定量PCR檢測(cè)肉制品中鴨源性成分

張 馳1,2，邱皓璞2，張 筠3

(1.東南大學(xué) 生物電子學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210018；2.國(guó)家農(nóng)副產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，南京市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院，江蘇 南京 210028；3.先聲再康江蘇藥業(yè)有限公司，江蘇 南京 210042)

根據(jù)鴨線粒體基因組細(xì)胞色素b基因中的保守序列設(shè)計(jì)鴨特異性引物和TaqMan探針，建立肉制品中鴨源性成分定性和定量檢測(cè)的熒光定量PCR技術(shù)。結(jié)果表明，引物與探針對(duì)于鴨源性成分的特異性良好，檢測(cè)靈敏度達(dá)到1.78pg/反應(yīng)，該方法可對(duì)鴨肌肉組織DNA進(jìn)行準(zhǔn)確定量。使用該技術(shù)對(duì)市售肉制品進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)大量使用鴨肉假冒的牛羊肉制品。本研究建立的鴨源性成分熒光定量PCR檢測(cè)方法，為肉制品質(zhì)量控制提供了有效的技術(shù)手段。

鴨源性成分；熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；肉類摻假；檢測(cè)方法

肉類摻假是我國(guó)食品行業(yè)的突出問題之一。據(jù)媒體報(bào)道，一些不法企業(yè)使用廉價(jià)的鴨肉代替價(jià)格較高的牛肉、羊肉等肉類生產(chǎn)食品進(jìn)行銷售，嚴(yán)重?fù)p害了消費(fèi)者的利益[1]。相比于豬肉，鴨肉的紋理與牛羊肉更為相似，因此使得相應(yīng)的摻假具有更大的隱蔽性。對(duì)食品監(jiān)管部門而言，建立快速有效的食品中鴨源性成分檢驗(yàn)方法，對(duì)此類不法行為的監(jiān)管十分必要。

以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)技術(shù)為基礎(chǔ)的種屬檢測(cè)技術(shù)已是食品中肉類成分鑒別的主流技術(shù)。自從Tartaglia等[2]首先報(bào)道了用PCR 方法檢測(cè)飼料中的牛、羊源性成分至今，大量研究報(bào)道了應(yīng)用PCR 及多重PCR技術(shù)對(duì)食品中不同肉類種屬的鑒別方法[3-9]。近年來，熒光定量PCR技術(shù)的迅速發(fā)展又將種屬鑒定技術(shù)發(fā)展到了新的高度[10-11]。相比于普通PCR，熒光定量PCR具備特異性好、檢測(cè)自動(dòng)化程度高等優(yōu)勢(shì)，并使得DNA模板的定量檢測(cè)成為可能[12-15]。然而，在鴨源性檢測(cè)方面，目前國(guó)內(nèi)僅有張娟等[16]針對(duì)鴨線粒體基因組中的特異性序列，使用PCR擴(kuò)增、電泳檢測(cè)的流程對(duì)食品中的鴨源性成分進(jìn)行檢測(cè)，應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù)建立的快速、靈敏、準(zhǔn)確的食品中鴨源性成分定性、定量檢測(cè)方法未見有報(bào)道。

本研究設(shè)計(jì)了用于肉制品中鴨源性成分鑒定的TaqMan熒光定量PCR引物與探針，擬建立了鴨源性成分的定性、定量檢測(cè)方法，并對(duì)大量市售食品樣本進(jìn)行鴨源性成分的檢測(cè)，以期為肉制品質(zhì)量控制提供一種有效的新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

TIANamp Geromic DNA Kit血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒(離心柱型) 天根生化科技(北京)有限公司；TaqMan real-time PCR預(yù)混液 日本TaKaRa公司；電泳級(jí)瓊脂糖 南京生興生物技術(shù)公司；引物與熒光探針均由南京金斯瑞生物公司合成。

1.2 儀器與設(shè)備

7500 Fast Real-Time PCR儀、Viti 96 Well PCR儀美國(guó)ABI公司；凝膠成像系統(tǒng) 加拿大Bio-Rad公司；紫外分光光度計(jì) 美國(guó)Lambda公司。

1.3 方法

1.3.1 樣本總DNA的提取

使用離心柱式血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒提取50mg肉制品中的總DNA。操作過程遵照試劑盒說明書進(jìn)行。將樣品剪碎后于含蛋白酶K的細(xì)胞裂解液中消化，使用吸附柱對(duì)總DNA進(jìn)行吸附、洗滌和洗脫，得到純化的樣品總DNA溶液。測(cè)定其OD260nm數(shù)值，計(jì)算DNA質(zhì)量濃度。

1.3.2 熒光定量PCR引物與TaqMan探針設(shè)計(jì)

購(gòu)置市售肉鴨2種、麻鴨1種、野鴨1種，根據(jù)GenBank已發(fā)表的鴨(Anas platyrhynchos)線粒體基因組序列(HM010684.1)設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增鴨細(xì)胞色素b基因813bp部分序列(61～873)的通用引物，正向引物序列為5’-ATCAACAACTCCCTAATCGA-3’，反向引物序列為5’-GATTGACCGCAGGATGGCGTAG-3’。分別提取不同品種鴨肉的總DNA作為模板，于PCR儀上對(duì)目標(biāo)序列進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系為20μL，包含PCR Master Mix(2×)10μL、通用引物(10μmol/L)各1μL、模板(10μg/μL)1μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3min；95℃預(yù)性30s、50℃退火30s、72℃延伸1min，30個(gè)循環(huán)；72℃、7min。反應(yīng)產(chǎn)物全部進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，使用膠回收試劑盒對(duì)813bp處的條帶進(jìn)行回收純化并測(cè)序。

分別將各品種鴨肉的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，選擇各個(gè)品種間完全一致的約700bp序列，使用ABI Primer Express軟件設(shè)計(jì)TaqMan熒光定量PCR引物和探針。將設(shè)計(jì)的各組引物所擴(kuò)增的目標(biāo)序列分別與牛、豬、綿羊、山羊等常見畜肉以及雞、鵝、鴿等常見禽肉已發(fā)表的細(xì)胞色素b同源序列進(jìn)行比較，選取目標(biāo)序列的關(guān)鍵位點(diǎn)(引物近3’端結(jié)合位點(diǎn)、探針近5’端結(jié)合位點(diǎn))在鴨和各對(duì)照物種間均存在3個(gè)以上不同堿基的一組引物與探針作為鴨源性檢測(cè)的特異性引物和探針(圖1)。正向引物D1序列為5’-GGCCTCCTACTGGCTATGCA-3’，反向引物D2序列為5’-GAGTCAGCCATATTGGACGTTT-3’，探針序列DP為5’-FAM-CACCGCAGACACATCCCTTGCTTTCTTAMRA-3’，擴(kuò)增片段大小為90bp。

圖1 鴨源性檢測(cè)引物與探針設(shè)計(jì)Fig.1 Design of duck-specific primers and probe

1.3.3 引物與探針的特異性

為驗(yàn)證引物與探針對(duì)于鴨源性成分的特異性，將上述2種肉鴨、1種麻鴨與1種野鴨樣本的總DNA作為陽(yáng)性對(duì)照，將牛、豬、綿羊、山羊等常見畜肉以及雞、鵝、鴿等常見禽肉的總DNA作為陰性對(duì)照，所有DNA模板均使用雙蒸水稀釋為10μg/mL。熒光定量PCR反應(yīng)體系為20μL，包含反應(yīng)預(yù)混液10μL、模板DNA 1μL、引物各1μL、探針1μL、ROX染料0.4μL、滅菌雙蒸水5.6μL。使用ABI 7500熒光定量PCR儀進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s；95℃變性3s、60℃退火＋延伸30s，40個(gè)循環(huán)。使用ROX染料對(duì)熒光數(shù)值進(jìn)行校正。根據(jù)各反應(yīng)體系的Ct值考察引物與探針對(duì)于不同DNA模板的特異性。

1.3.4 檢測(cè)靈敏度與定量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線

將提取自肉鴨的DNA 10倍梯度稀釋后，應(yīng)用本研究設(shè)計(jì)的鴨源性引物與探針進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，以Ct值為35時(shí)的模板濃度作為方法的檢測(cè)限。根據(jù)各梯度的擴(kuò)增曲線，建立Ct值-模板DNA質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，用于鴨源性成分的定量檢測(cè)。

1.3.5 鴨源性成分定量的盲樣檢測(cè)

采用盲樣測(cè)試的方式，使用本研究設(shè)計(jì)的引物與探針對(duì)5份已知質(zhì)量濃度的不同鴨組織總DNA樣本進(jìn)行鴨源性成分的熒光定量PCR檢測(cè)。將反應(yīng)Ct值代入定量標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出模板DNA質(zhì)量濃度，并與樣本實(shí)際質(zhì)量濃度進(jìn)行對(duì)比，驗(yàn)證定量方法的準(zhǔn)確性。

1.3.6 市售肉制品摻假的檢測(cè)

購(gòu)置市售羊肉串32份、預(yù)制生牛排5份、預(yù)制冷鮮牛柳6份，提取其總DNA并調(diào)整其質(zhì)量濃度至10μg/mL，使用熒光定量PCR法測(cè)定其鴨源性成分。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物與探針的特異性驗(yàn)證

使用4種不同來源的鴨肉DNA作為陽(yáng)性對(duì)照、4種畜肉和3種禽肉作為陰性對(duì)照，驗(yàn)證鴨源性檢測(cè)引物與探針的特異性。以10ng DNA作為模板進(jìn)行6次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，4種鴨肉樣本均出現(xiàn)顯著擴(kuò)增，6次平行反應(yīng)的Ct值分別為21.325±0.124(肉鴨1)、21.605±0.086(肉鴨2)、21.477±0.173(肉鴨3)、21.922±0.158(肉鴨4)，各陰性對(duì)照的反應(yīng)Ct值均大于40，表明方法針對(duì)鴨源性成分的特異性良好。

2.2 檢測(cè)靈敏度與定量標(biāo)準(zhǔn)曲線

使用10倍梯度稀釋的肉鴨肌肉組織總DNA作為模板進(jìn)行鴨源性成分的熒光定量PCR檢測(cè)，各梯度反應(yīng)體系中的模板量(m)分別為580、58、5.8、0.58、0.058、0.0058ng。反應(yīng)的擴(kuò)增曲線見圖2，絕對(duì)定量標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Ct=-3.603lgm＋25.09，r2=0.998，擴(kuò)增效率為89.469%。

鑒于國(guó)內(nèi)外熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)均將Ct值為35時(shí)的模板量作為方法的檢測(cè)限，根據(jù)本研究的標(biāo)準(zhǔn)曲線，Ct值為35時(shí)的模板量為1.78pg，表明方法的定性檢測(cè)靈敏度達(dá)到pg級(jí)。

圖2 梯度擴(kuò)增曲線Fig.2 Amplification plot and standard curve

2.3 盲樣的定量檢測(cè)

利用標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)5份已知質(zhì)量濃度的不同鴨組織總DNA進(jìn)行盲樣定量檢測(cè)。各樣品DNA的實(shí)際質(zhì)量濃度和檢測(cè)結(jié)果見表1。鴨肌肉組織的定量結(jié)果與實(shí)際質(zhì)量濃度較接近，可用于對(duì)鴨肉DNA的準(zhǔn)確定量；當(dāng)對(duì)鴨肝、鴨心、鴨腸等鴨內(nèi)臟組織DNA進(jìn)行定量時(shí)，由于組織細(xì)胞中線粒體數(shù)量多于肌肉組織，故導(dǎo)致定量檢測(cè)結(jié)果偏大。

表1 不同鴨組織樣品的盲樣定量檢測(cè)Table1 Blind detection of different duck tissues

2.4 市售肉制品的鴨源性檢測(cè)

使用本研究建立的熒光定量PCR方法對(duì)市售樣品中鴨源性檢測(cè)，結(jié)果見表2。羊肉串和預(yù)制冷鮮牛柳均出現(xiàn)大量鴨源性陽(yáng)性結(jié)果，表明市場(chǎng)上使用鴨肉假冒牛羊肉制品的現(xiàn)象已非常嚴(yán)重。

表2 市售肉制品的鴨源性檢測(cè)Table2 Detection of duck ingredients in meat products

3 討論與結(jié)論

自從“假牛肉”事件曝光以來，肉制品摻假已成為公眾關(guān)注的熱點(diǎn)問題。作為對(duì)肉類摻假進(jìn)行監(jiān)管的有效手段，基于PCR和熒光定量PCR的豬、牛等動(dòng)物源性檢測(cè)技術(shù)已日益成熟，并逐步進(jìn)入國(guó)內(nèi)外檢測(cè)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)[18-19]。然而，由于使用鴨肉假冒牛羊肉違法行為被揭露的時(shí)間不長(zhǎng)，因此國(guó)內(nèi)目前仍未有使用熒光定量PCR技術(shù)進(jìn)行鴨源性成分定性和定量檢測(cè)的報(bào)道。本研究基于鴨線粒體基因組序列設(shè)計(jì)特異性引物和熒光探針，建立了肉制品中鴨源性成分檢測(cè)的TaqMan熒光定量PCR技術(shù)。經(jīng)驗(yàn)證，方法的特異性良好，檢測(cè)靈敏度達(dá)到1.78pg/反應(yīng)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線可對(duì)鴨肉DNA進(jìn)行定量檢測(cè)。應(yīng)用本研究方法對(duì)市售羊肉串、預(yù)制牛肉片等進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)大量使用鴨肉進(jìn)行肉類摻假的行為。

在引物與探針的設(shè)計(jì)中，引物的近3’端堿基以及探針自5’端至中間位置的堿基是影響方法特異性的關(guān)鍵堿基。一般認(rèn)為，當(dāng)模板DNA在上述位置有3個(gè)以上的堿基與引物和探針不能匹配時(shí)，熒光定量PCR無特異性擴(kuò)增。本研究選取了鴨線粒體基因組中的一段保守序列設(shè)計(jì)引物與探針，在上述影響引物與探針特異性的關(guān)鍵結(jié)合位點(diǎn)中，其他常見肉類物種與鴨均存在多個(gè)差異堿基，從而確保其對(duì)于鴨的特異性。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，以常見畜肉和禽肉作為模板均無擴(kuò)增，表明本研究設(shè)計(jì)的鴨源性引物與探針特異性良好。

與張娟等[16]使用PCR擴(kuò)增、電泳檢測(cè)的流程對(duì)食品中的鴨源性成分的檢測(cè)方法相比，本研究建立的熒光定量PCR方法在確保特異性的前提下，將檢測(cè)靈敏度提高了1～2個(gè)數(shù)量級(jí)；同時(shí)，利用熒光定量PCR儀的Fast模式可將檢測(cè)時(shí)間縮短至40min，大大優(yōu)于張娟等方法的3～4h，且不需使用溴化乙啶等有毒試劑，具有快速、靈敏、安全等多方面的優(yōu)勢(shì)。

肉類鑒別的靶基因主要包括3類：線粒體基因組DNA、細(xì)胞基因組中的重復(fù)序列和單拷貝序列[2]。其中，線粒體在細(xì)胞中拷貝數(shù)多、食品加工過程中不易完全破壞，以之為靶點(diǎn)的檢測(cè)方法靈敏度高，是肉類定性鑒別的首選。然而，Ballin[19]、何瑋玲[20]等認(rèn)為不同組織中線粒體數(shù)量的區(qū)別可能導(dǎo)致定量結(jié)果的偏差。本研究對(duì)不同基于鴨肌肉組織DNA質(zhì)量與反應(yīng)Ct值建立了標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)不同鴨組織提取的DNA進(jìn)行定量。結(jié)果表明，該方法對(duì)于未知肌肉組織的定量結(jié)果較準(zhǔn)確；對(duì)于心臟和肝臟等組織，由于線粒體數(shù)量多于肌肉組織導(dǎo)致定量結(jié)果偏大。然而，對(duì)于不同組織的定量結(jié)果均在實(shí)際值的3倍以內(nèi)，因此該定量方法對(duì)于檢測(cè)模板DNA中鴨源性成分的大致含量、從而判斷食品中鴨源性成分是主成分還是來自于污染仍然具有一定的實(shí)際意義。

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A Quantitative Fluorescent PCR Method for Detection of Duck-Derived Ingredients in Meat Products

ZHANG Chi1,2，QIU Hao-pu2，ZHANG Yun3
(1. State Key Laboratory of Bioelectronics, Southeast University, Nanjing 210018, China；2. National Supervision & Testing Centre for Agricultural & Sideline Product Quality, Nanjing Institute of Supervision & Testing on Product Quality, Nanjing 210028, China；3. Jiangsu Xianshengzaikang Pharmaceutical Ltd., Nanjing 210042, China)

Identification of animal species will provide a useful approach for supervision of meat adulteration. Yet in China, little research has been reported on using real-time PCR method to detect duck-derived ingredients in foods. A set of duck-specific primers and TaqMan probe were designed based on the conserved sequences of duck cyt-b gene, and a RT-PCR method was established for qualitative and quantitative detection of duck-derived components in meat products. The primers and probe were highly specific for duck DNA, and the limit of detection was 1.78 pg per reaction. The further quantitative assay revealed that this method was accurate in quantitative determination of DNA from duck skeletal muscle. Finally, commercial meat products were measured, and a number of meat adulterations with duck substituting beef or mutton were detected. In summary, this RT-PCR proved to be a reliable approach in identification of duck ingredients, which could benefit quality control of meat production in China.

duck ingredients；real-time PCR；meat adulteration；detection method

TS207.3

A

1002-6630(2013)18-0154-04

10.7506/spkx1002-6630-201318031

2012-08-21

“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2011BAK21B05)；國(guó)家質(zhì)檢總局科技計(jì)劃項(xiàng)目(2010QK178)

張馳(1978—)，男，高級(jí)工程師，博士，研究方向?yàn)槭称飞锘瘜W(xué)與分子生物學(xué)。E-mail：zhangchi@njzj.gov.cn