張 馳，邱皓璞，張 筠

(1.東南大學(xué) 生物電子學(xué)國家重點(diǎn)實驗室，江蘇 南京 210018；2.國家農(nóng)副產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心，南京市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗院，江蘇 南京 210028；3.先聲再康江蘇藥業(yè)有限公司，江蘇 南京 210042)

熒光定量PCR檢測肉制品中鴨源性成分

張 馳1,2，邱皓璞2，張 筠3

(1.東南大學(xué) 生物電子學(xué)國家重點(diǎn)實驗室，江蘇 南京 210018；2.國家農(nóng)副產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心，南京市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗院，江蘇 南京 210028；3.先聲再康江蘇藥業(yè)有限公司，江蘇 南京 210042)

根據(jù)鴨線粒體基因組細(xì)胞色素b基因中的保守序列設(shè)計鴨特異性引物和TaqMan探針，建立肉制品中鴨源性成分定性和定量檢測的熒光定量PCR技術(shù)。結(jié)果表明，引物與探針對于鴨源性成分的特異性良好，檢測靈敏度達(dá)到1.78pg/反應(yīng)，該方法可對鴨肌肉組織DNA進(jìn)行準(zhǔn)確定量。使用該技術(shù)對市售肉制品進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)大量使用鴨肉假冒的牛羊肉制品。本研究建立的鴨源性成分熒光定量PCR檢測方法，為肉制品質(zhì)量控制提供了有效的技術(shù)手段。

鴨源性成分；熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；肉類摻假；檢測方法

肉類摻假是我國食品行業(yè)的突出問題之一。據(jù)媒體報道，一些不法企業(yè)使用廉價的鴨肉代替價格較高的牛肉、羊肉等肉類生產(chǎn)食品進(jìn)行銷售，嚴(yán)重?fù)p害了消費(fèi)者的利益[1]。相比于豬肉，鴨肉的紋理與牛羊肉更為相似，因此使得相應(yīng)的摻假具有更大的隱蔽性。對食品監(jiān)管部門而言，建立快速有效的食品中鴨源性成分檢驗方法，對此類不法行為的監(jiān)管十分必要。

以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)技術(shù)為基礎(chǔ)的種屬檢測技術(shù)已是食品中肉類成分鑒別的主流技術(shù)。自從Tartaglia等[2]首先報道了用PCR 方法檢測飼料中的牛、羊源性成分至今，大量研究報道了應(yīng)用PCR 及多重PCR技術(shù)對食品中不同肉類種屬的鑒別方法[3-9]。近年來，熒光定量PCR技術(shù)的迅速發(fā)展又將種屬鑒定技術(shù)發(fā)展到了新的高度[10-11]。相比于普通PCR，熒光定量PCR具備特異性好、檢測自動化程度高等優(yōu)勢，并使得DNA模板的定量檢測成為可能[12-15]。然而，在鴨源性檢測方面，目前國內(nèi)僅有張娟等[16]針對鴨線粒體基因組中的特異性序列，使用PCR擴(kuò)增、電泳檢測的流程對食品中的鴨源性成分進(jìn)行檢測，應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù)建立的快速、靈敏、準(zhǔn)確的食品中鴨源性成分定性、定量檢測方法未見有報道。

本研究設(shè)計了用于肉制品中鴨源性成分鑒定的TaqMan熒光定量PCR引物與探針，擬建立了鴨源性成分的定性、定量檢測方法，并對大量市售食品樣本進(jìn)行鴨源性成分的檢測，以期為肉制品質(zhì)量控制提供一種有效的新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

TIANamp Geromic DNA Kit血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒(離心柱型) 天根生化科技(北京)有限公司；TaqMan real-time PCR預(yù)混液 日本TaKaRa公司；電泳級瓊脂糖 南京生興生物技術(shù)公司；引物與熒光探針均由南京金斯瑞生物公司合成。

1.2 儀器與設(shè)備

7500 Fast Real-Time PCR儀、Viti 96 Well PCR儀美國ABI公司；凝膠成像系統(tǒng) 加拿大Bio-Rad公司；紫外分光光度計 美國Lambda公司。

1.3 方法

1.3.1 樣本總DNA的提取

使用離心柱式血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒提取50mg肉制品中的總DNA。操作過程遵照試劑盒說明書進(jìn)行。將樣品剪碎后于含蛋白酶K的細(xì)胞裂解液中消化，使用吸附柱對總DNA進(jìn)行吸附、洗滌和洗脫，得到純化的樣品總DNA溶液。測定其OD260nm數(shù)值，計算DNA質(zhì)量濃度。

1.3.2 熒光定量PCR引物與TaqMan探針設(shè)計

購置市售肉鴨2種、麻鴨1種、野鴨1種，根據(jù)GenBank已發(fā)表的鴨(Anas platyrhynchos)線粒體基因組序列(HM010684.1)設(shè)計用于擴(kuò)增鴨細(xì)胞色素b基因813bp部分序列(61～873)的通用引物，正向引物序列為5’-ATCAACAACTCCCTAATCGA-3’，反向引物序列為5’-GATTGACCGCAGGATGGCGTAG-3’。分別提取不同品種鴨肉的總DNA作為模板，于PCR儀上對目標(biāo)序列進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系為20μL，包含PCR Master Mix(2×)10μL、通用引物(10μmol/L)各1μL、模板(10μg/μL)1μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3min；95℃預(yù)性30s、50℃退火30s、72℃延伸1min，30個循環(huán)；72℃、7min。反應(yīng)產(chǎn)物全部進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，使用膠回收試劑盒對813bp處的條帶進(jìn)行回收純化并測序。

分別將各品種鴨肉的測序結(jié)果進(jìn)行比對，選擇各個品種間完全一致的約700bp序列，使用ABI Primer Express軟件設(shè)計TaqMan熒光定量PCR引物和探針。將設(shè)計的各組引物所擴(kuò)增的目標(biāo)序列分別與牛、豬、綿羊、山羊等常見畜肉以及雞、鵝、鴿等常見禽肉已發(fā)表的細(xì)胞色素b同源序列進(jìn)行比較，選取目標(biāo)序列的關(guān)鍵位點(diǎn)(引物近3’端結(jié)合位點(diǎn)、探針近5’端結(jié)合位點(diǎn))在鴨和各對照物種間均存在3個以上不同堿基的一組引物與探針作為鴨源性檢測的特異性引物和探針(圖1)。正向引物D1序列為5’-GGCCTCCTACTGGCTATGCA-3’，反向引物D2序列為5’-GAGTCAGCCATATTGGACGTTT-3’，探針序列DP為5’-FAM-CACCGCAGACACATCCCTTGCTTTCTTAMRA-3’，擴(kuò)增片段大小為90bp。

圖1 鴨源性檢測引物與探針設(shè)計Fig.1 Design of duck-specific primers and probe

1.3.3 引物與探針的特異性

為驗證引物與探針對于鴨源性成分的特異性，將上述2種肉鴨、1種麻鴨與1種野鴨樣本的總DNA作為陽性對照，將牛、豬、綿羊、山羊等常見畜肉以及雞、鵝、鴿等常見禽肉的總DNA作為陰性對照，所有DNA模板均使用雙蒸水稀釋為10μg/mL。熒光定量PCR反應(yīng)體系為20μL，包含反應(yīng)預(yù)混液10μL、模板DNA 1μL、引物各1μL、探針1μL、ROX染料0.4μL、滅菌雙蒸水5.6μL。使用ABI 7500熒光定量PCR儀進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s；95℃變性3s、60℃退火＋延伸30s，40個循環(huán)。使用ROX染料對熒光數(shù)值進(jìn)行校正。根據(jù)各反應(yīng)體系的Ct值考察引物與探針對于不同DNA模板的特異性。

1.3.4 檢測靈敏度與定量檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線

將提取自肉鴨的DNA 10倍梯度稀釋后，應(yīng)用本研究設(shè)計的鴨源性引物與探針進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，以Ct值為35時的模板濃度作為方法的檢測限。根據(jù)各梯度的擴(kuò)增曲線，建立Ct值-模板DNA質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，用于鴨源性成分的定量檢測。

1.3.5 鴨源性成分定量的盲樣檢測

采用盲樣測試的方式，使用本研究設(shè)計的引物與探針對5份已知質(zhì)量濃度的不同鴨組織總DNA樣本進(jìn)行鴨源性成分的熒光定量PCR檢測。將反應(yīng)Ct值代入定量標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出模板DNA質(zhì)量濃度，并與樣本實際質(zhì)量濃度進(jìn)行對比，驗證定量方法的準(zhǔn)確性。

1.3.6 市售肉制品摻假的檢測

購置市售羊肉串32份、預(yù)制生牛排5份、預(yù)制冷鮮牛柳6份，提取其總DNA并調(diào)整其質(zhì)量濃度至10μg/mL，使用熒光定量PCR法測定其鴨源性成分。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物與探針的特異性驗證

使用4種不同來源的鴨肉DNA作為陽性對照、4種畜肉和3種禽肉作為陰性對照，驗證鴨源性檢測引物與探針的特異性。以10ng DNA作為模板進(jìn)行6次重復(fù)實驗，4種鴨肉樣本均出現(xiàn)顯著擴(kuò)增，6次平行反應(yīng)的Ct值分別為21.325±0.124(肉鴨1)、21.605±0.086(肉鴨2)、21.477±0.173(肉鴨3)、21.922±0.158(肉鴨4)，各陰性對照的反應(yīng)Ct值均大于40，表明方法針對鴨源性成分的特異性良好。

2.2 檢測靈敏度與定量標(biāo)準(zhǔn)曲線

使用10倍梯度稀釋的肉鴨肌肉組織總DNA作為模板進(jìn)行鴨源性成分的熒光定量PCR檢測，各梯度反應(yīng)體系中的模板量(m)分別為580、58、5.8、0.58、0.058、0.0058ng。反應(yīng)的擴(kuò)增曲線見圖2，絕對定量標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Ct=-3.603lgm＋25.09，r2=0.998，擴(kuò)增效率為89.469%。

鑒于國內(nèi)外熒光定量PCR檢測技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)均將Ct值為35時的模板量作為方法的檢測限，根據(jù)本研究的標(biāo)準(zhǔn)曲線，Ct值為35時的模板量為1.78pg，表明方法的定性檢測靈敏度達(dá)到pg級。

圖2 梯度擴(kuò)增曲線Fig.2 Amplification plot and standard curve

2.3 盲樣的定量檢測

利用標(biāo)準(zhǔn)曲線，對5份已知質(zhì)量濃度的不同鴨組織總DNA進(jìn)行盲樣定量檢測。各樣品DNA的實際質(zhì)量濃度和檢測結(jié)果見表1。鴨肌肉組織的定量結(jié)果與實際質(zhì)量濃度較接近，可用于對鴨肉DNA的準(zhǔn)確定量；當(dāng)對鴨肝、鴨心、鴨腸等鴨內(nèi)臟組織DNA進(jìn)行定量時，由于組織細(xì)胞中線粒體數(shù)量多于肌肉組織，故導(dǎo)致定量檢測結(jié)果偏大。

表1 不同鴨組織樣品的盲樣定量檢測Table1 Blind detection of different duck tissues

2.4 市售肉制品的鴨源性檢測

使用本研究建立的熒光定量PCR方法對市售樣品中鴨源性檢測，結(jié)果見表2。羊肉串和預(yù)制冷鮮牛柳均出現(xiàn)大量鴨源性陽性結(jié)果，表明市場上使用鴨肉假冒牛羊肉制品的現(xiàn)象已非常嚴(yán)重。

表2 市售肉制品的鴨源性檢測Table2 Detection of duck ingredients in meat products

3 討論與結(jié)論

自從“假牛肉”事件曝光以來，肉制品摻假已成為公眾關(guān)注的熱點(diǎn)問題。作為對肉類摻假進(jìn)行監(jiān)管的有效手段，基于PCR和熒光定量PCR的豬、牛等動物源性檢測技術(shù)已日益成熟，并逐步進(jìn)入國內(nèi)外檢測技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)[18-19]。然而，由于使用鴨肉假冒牛羊肉違法行為被揭露的時間不長，因此國內(nèi)目前仍未有使用熒光定量PCR技術(shù)進(jìn)行鴨源性成分定性和定量檢測的報道。本研究基于鴨線粒體基因組序列設(shè)計特異性引物和熒光探針，建立了肉制品中鴨源性成分檢測的TaqMan熒光定量PCR技術(shù)。經(jīng)驗證，方法的特異性良好，檢測靈敏度達(dá)到1.78pg/反應(yīng)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線可對鴨肉DNA進(jìn)行定量檢測。應(yīng)用本研究方法對市售羊肉串、預(yù)制牛肉片等進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)大量使用鴨肉進(jìn)行肉類摻假的行為。

在引物與探針的設(shè)計中，引物的近3’端堿基以及探針自5’端至中間位置的堿基是影響方法特異性的關(guān)鍵堿基。一般認(rèn)為，當(dāng)模板DNA在上述位置有3個以上的堿基與引物和探針不能匹配時，熒光定量PCR無特異性擴(kuò)增。本研究選取了鴨線粒體基因組中的一段保守序列設(shè)計引物與探針，在上述影響引物與探針特異性的關(guān)鍵結(jié)合位點(diǎn)中，其他常見肉類物種與鴨均存在多個差異堿基，從而確保其對于鴨的特異性。實驗證實，以常見畜肉和禽肉作為模板均無擴(kuò)增，表明本研究設(shè)計的鴨源性引物與探針特異性良好。

與張娟等[16]使用PCR擴(kuò)增、電泳檢測的流程對食品中的鴨源性成分的檢測方法相比，本研究建立的熒光定量PCR方法在確保特異性的前提下，將檢測靈敏度提高了1～2個數(shù)量級；同時，利用熒光定量PCR儀的Fast模式可將檢測時間縮短至40min，大大優(yōu)于張娟等方法的3～4h，且不需使用溴化乙啶等有毒試劑，具有快速、靈敏、安全等多方面的優(yōu)勢。

肉類鑒別的靶基因主要包括3類：線粒體基因組DNA、細(xì)胞基因組中的重復(fù)序列和單拷貝序列[2]。其中，線粒體在細(xì)胞中拷貝數(shù)多、食品加工過程中不易完全破壞，以之為靶點(diǎn)的檢測方法靈敏度高，是肉類定性鑒別的首選。然而，Ballin[19]、何瑋玲[20]等認(rèn)為不同組織中線粒體數(shù)量的區(qū)別可能導(dǎo)致定量結(jié)果的偏差。本研究對不同基于鴨肌肉組織DNA質(zhì)量與反應(yīng)Ct值建立了標(biāo)準(zhǔn)曲線，對不同鴨組織提取的DNA進(jìn)行定量。結(jié)果表明，該方法對于未知肌肉組織的定量結(jié)果較準(zhǔn)確；對于心臟和肝臟等組織，由于線粒體數(shù)量多于肌肉組織導(dǎo)致定量結(jié)果偏大。然而，對于不同組織的定量結(jié)果均在實際值的3倍以內(nèi)，因此該定量方法對于檢測模板DNA中鴨源性成分的大致含量、從而判斷食品中鴨源性成分是主成分還是來自于污染仍然具有一定的實際意義。

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A Quantitative Fluorescent PCR Method for Detection of Duck-Derived Ingredients in Meat Products

ZHANG Chi1,2，QIU Hao-pu2，ZHANG Yun3
(1. State Key Laboratory of Bioelectronics, Southeast University, Nanjing 210018, China；2. National Supervision & Testing Centre for Agricultural & Sideline Product Quality, Nanjing Institute of Supervision & Testing on Product Quality, Nanjing 210028, China；3. Jiangsu Xianshengzaikang Pharmaceutical Ltd., Nanjing 210042, China)

Identification of animal species will provide a useful approach for supervision of meat adulteration. Yet in China, little research has been reported on using real-time PCR method to detect duck-derived ingredients in foods. A set of duck-specific primers and TaqMan probe were designed based on the conserved sequences of duck cyt-b gene, and a RT-PCR method was established for qualitative and quantitative detection of duck-derived components in meat products. The primers and probe were highly specific for duck DNA, and the limit of detection was 1.78 pg per reaction. The further quantitative assay revealed that this method was accurate in quantitative determination of DNA from duck skeletal muscle. Finally, commercial meat products were measured, and a number of meat adulterations with duck substituting beef or mutton were detected. In summary, this RT-PCR proved to be a reliable approach in identification of duck ingredients, which could benefit quality control of meat production in China.

duck ingredients；real-time PCR；meat adulteration；detection method

TS207.3

A

1002-6630(2013)18-0154-04

10.7506/spkx1002-6630-201318031

2012-08-21

“十二五”國家科技支撐計劃項目(2011BAK21B05)；國家質(zhì)檢總局科技計劃項目(2010QK178)

張馳(1978—)，男，高級工程師，博士，研究方向為食品生物化學(xué)與分子生物學(xué)。E-mail：zhangchi@njzj.gov.cn