狄 蕊，霍軍生*，魏 峰，黃 建，孫 靜

(1.黃山學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，安徽 黃山 245041；2.中國疾病預(yù)防控制中心營養(yǎng)與食品安全所，北京 100050)

高效液相色譜法檢測醬油中NaFeEDTA

狄 蕊1，霍軍生2,*，魏 峰1，黃 建2，孫 靜2

(1.黃山學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，安徽 黃山 245041；2.中國疾病預(yù)防控制中心營養(yǎng)與食品安全所，北京 100050)

采用四丁基氫氧化銨為離子對試劑，以C18色譜柱為固定相，建立檢測醬油中乙二胺四乙酸鐵鈉(NaFeEDTA)的高效液相色譜法。結(jié)果表明：當NaFeEDTA的添加量為2.00g/L時，在10種不同品牌醬油中的回收率為94.1%～101.5%，平均回收率為97.7%，測量結(jié)果與國標方法沒有顯著差異(P＞0.05)。本方法具有通用性好的優(yōu)點，可用于鐵強化醬油中NaFeEDTA的檢測。

醬油；乙二胺四乙酸鐵鈉；四丁基氫氧化銨；C18色譜柱

絡(luò)合型營養(yǎng)強化劑NaFeEDTA生物利用率較高[1-3]，而且對食物的感官影響小[4-5]。其在我國1999年被批準為鐵營養(yǎng)強化劑；2002年被批準在醬油中使用[6-7]。食品中NaFeEDTA的檢測研究，對食品生產(chǎn)質(zhì)量控制和強化食品的推廣、市場監(jiān)督等都具有重要的意義。

食品中鐵元素的檢測方法如原子吸收法[8]、原子發(fā)射光譜法[9]、質(zhì)譜法[10]、溶出伏安法[11]等，無法對NaFeEDTA和焦磷酸鐵、硫酸亞鐵等各種鐵強化劑進行區(qū)分，因此不能用于對NaFeEDTA的直接檢測。NaFeEDTA是Fe3+與EDTA所形成絡(luò)合物的鈉鹽，在中性和弱酸性溶液中通常以Na+和FeEDTA-形式存在[12]。魏峰等[13]于2006年建立了醬油中NaFeEDTA的高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)檢測方法，該方法已經(jīng)被GB/T 21234—2007《鐵強化醬油中乙二胺四乙酸鐵鈉的測定》[14]所采納，該標準的發(fā)布極大地規(guī)范和方便了NaFeEDTA的檢測。但該方法在使用過程中存在一些問題。比如，該方法使用C8色譜柱作為固定相，而一般的檢測機構(gòu)和食品檢測方法通常使用的是C18色譜柱，這樣需另行購買色譜柱。此外，在原來的方法文獻中沒有對所用的離子對試劑的種類進行考察。針對上述問題以及國家標準修訂的需要，本實驗將以C18色譜柱為固定相，對分離醬油中NaFeEDTA的色譜條件和干擾因素進行研究，以期建立更加通用的NaFeEDTA檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

10種品牌醬油 市售。

NaFeEDTA試劑、40%四丁基氫氧化銨溶液 美國Sigma公司；甲醇為色譜純；鹽酸、NaOH為優(yōu)級純；甲酸、四丁基溴化銨、十六烷基三甲基溴化銨均為分析純；實驗用水為超純水(18.2MΩ?cm)。

200型高效液相色譜分析儀(配有DAD紫外檢測器)美國安捷倫科技公司；PHS-3C精密酸度計 上海精密科學(xué)儀器公司。

1.2 方法

1.2.1 溶液配制

準確稱取NaFeEDTA試劑200mg，用水溶解、移至100mL容量瓶，定容，制成質(zhì)量濃度為2000mg/L的標準儲備液，備用。

吸取標準儲備液2.50mL置于50mL容量瓶中，用75%甲醇溶液定容；再分別吸取該溶液1.0～10.0mL分別置于50mL容量瓶中，用水定容，搖勻，制得質(zhì)量濃度為2～20mg/L的標準系列溶液，避光保存。

1.2.2 樣品處理

吸取醬油樣品2.5mL置于50mL容量瓶，用75%甲醇溶液定容，搖勻。將該溶液避光靜置50min后，過濾，吸取續(xù)濾液5.00mL置于50mL的容量瓶中，用水定容[10]，色譜進樣前用0.45μm濾膜過濾。

1.2.3 色譜條件

色譜柱：Agilent Zorbax XDB-C18色譜柱(250mm×4.6mm，5μm)。

流動相溶液：移取TBAOH溶液3.0mL于燒杯中，加水200mL，用甲酸調(diào)pH值至3.0后，移至1000mL容量瓶，加120mL甲醇，用水稀釋至刻度，搖勻。

流動相流速：1.00mL/min；柱溫：25℃；紫外檢測波長：254nm；進樣量：20μL；樣品色譜分析時間：15min。

2 結(jié)果與分析

2.1 離子對試劑的選擇

用液相色譜分析陰離子時，常用季銨鹽作為離子對試劑[15-16]，其與固定相的吸附能力和與組分陰離子的結(jié)合能力都會對分離產(chǎn)生影響。在實驗中采用C18色譜柱作為固定相，在相同質(zhì)量濃度和pH值條件下比較了十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)、四丁基溴化銨(TBAB)和四丁基氫氧化銨(TBAOH)對FeEDTA-的分離效果。結(jié)果，在pH值為3.0的甲酸緩沖液中使用1.3g/L的CTAB作離子對試劑時，F(xiàn)eEDTA-的色譜峰較寬(保留時間為6.5min時，峰寬為0.8min)，理論塔板數(shù)僅為1060，分離效果差；而且FeEDTA-的出峰時間不穩(wěn)定，隨著流動相沖洗色譜柱時間的延長，F(xiàn)eEDTA-的出峰時間也逐漸延長，出現(xiàn)這種現(xiàn)象可能是因為CTAB在固定相上的吸附平衡需要較長時間才能達到，CTAB在固定相上的質(zhì)量濃度逐漸增加，從而引起組分的保留時間延長。因此無法用CTAB作為離子對試劑。

離子對色譜法中流動相的離子強度，會對組分的保留值產(chǎn)生巨大影響。流動相中離子強度增加，陰離子增多會與組分產(chǎn)生競爭，從而減小FeEDTA-的保留值。在流動相pH值為3.0的條件下以質(zhì)量濃度為1.2g/L的TBAOH為離子對試劑，用甲酸調(diào)節(jié)pH值至3.0，F(xiàn)eEDTA-的保留時間為9.1min；而在相同條件下以TBAB作為離子對試劑，F(xiàn)eEDTA-的保留時間僅為5.7min。這應(yīng)該是由于使用TBAB的流動相的離子強度大引起的。醬油中的有機酸等雜質(zhì)，保留時間較短，如果使用TBAB，雜質(zhì)可能會對FeEDTA-產(chǎn)生干擾，因此本實驗選用TBAOH作為離子對試劑。

圖1 流動相中TBAOH含量對保留時間的影響Fig.1 Effect of TBAOH content on the retention time of NaFeEDTA

流動相中TBAOH的質(zhì)量濃度對組分的保留時間有顯著影響。如圖1所示，以pH3.0含12%甲醇的甲酸緩沖溶液作為流動相時，隨著離子對試劑質(zhì)量濃度的增加，組分的保留時間縮短，這與Lucena等[17]的報道基本一致。當離子對試劑的質(zhì)量濃度增大時，離子強度也相應(yīng)增大，流動相中陰離子對樣品陰離子與離子對試劑結(jié)合的競爭作用增強，因此組分的保留時間縮短。

2.2 甲醇含量的選擇

本實驗以緩沖鹽溶液-甲醇混合體系作為流動相，實驗發(fā)現(xiàn)甲醇含量在10%～14%時，均可取得比較滿意的分離效果。如果甲醇含量小于10%，則被測組分的保留時間將大于10min，且醬油中某些雜質(zhì)的保留時間將大于20min，分析時間過長。而增加甲醇的比例，流動相的洗脫強度增加，被測組分和雜質(zhì)的保留時間減少。這樣不僅可以縮短分析時間，還可以改善組分的峰形，但甲醇濃度過大，會因被測組分與前面的雜質(zhì)峰的分離度減小，引起組分出峰時間處的基線噪音波動增大。因此本實驗最終選擇甲醇含量12%的流動相。

2.3 流動相pH值的選擇

在中性條件下，有部分FeEDTA-在流動相中發(fā)生水解反應(yīng)以陰離子FeEDTAOH2-的形式存在[18]，引起組分的保留性質(zhì)發(fā)生變化。因此，NaFeEDTA的分離需要在酸性條件下進行。醬油樣品中的一些氨基酸，可能會對NaFeEDTA的測定產(chǎn)生干擾。而在pH值小于其等電點時，氨基酸和多肽以陽離子形式存在，幾乎不被固定相保留。而FeEDTA-因為離子對試劑的存在，保留時間延長。流動相pH值降低會使氨基酸的干擾減小。從圖2可以看出，某品牌老抽醬油樣品在pH3.0時保留時間5min以后的雜質(zhì)色譜峰比pH4.0、pH5.0時少得多。因此本實驗最終確定流動相的pH值為3.0。

圖2 老抽醬油在不同pH值時的色譜圖Fig.2 Chromatograms of dark soy sauce of different pH values

2.4 固定相的選擇

圖3 NaFeEDTAA在CC8和CC1188固定相上的色譜圖Fig.3 Chromatograms of NaFeEDTA on C8and C18columns

圖3 為NaFeEDTA在C8和C18固定相上的色譜圖。十八烷基鍵合硅膠即C18固定相，比C8的碳鏈更長，極性較C8的極性小，但二者的保留性質(zhì)比較相似，一般能用C8分析的物質(zhì)，在C18上也能分離。而采用離子對色譜時，固定相的差異會影響與離子對試劑的吸附能力，從而影響組分的保留值。本研究采用上述優(yōu)化的流動相條件，比較了150mm和250mm兩種C18色譜柱(5μm)，發(fā)現(xiàn)FeEDTA-在150mm色譜柱上的保留時間較短，與前面出峰的大量干擾物的保留時間相近；減少流動相的離子強度和離子對試劑質(zhì)量濃度后，分離效果仍然較差。使用250mm C18色譜柱，在優(yōu)化的流動相條件下對NaFeEDTA的有效塔板數(shù)為1438，理論塔板數(shù)為2235；而在相同儀器上采用C8色譜柱的國標方法的有效塔板數(shù)為1936，理論塔板數(shù)為2666。從此可以看出采用C8柱可以獲得最佳的分離效果，但采用C18色譜柱也可以進行分離。

2.5 干擾實驗

圖4為添加了NaFeEDTA的(添加量2.00g/L)某品牌原汁醬油以C18柱為固定相在優(yōu)化條件下的色譜圖。苯甲酸鈉、山梨酸鉀為食品中常用的防腐劑，GB 2760—2011《食品添加劑使用標準》規(guī)定[19]，兩者在醬油中的添加量應(yīng)小于1.0g/L。而醬油中常見的有機酸有甲酸、乙酸、檸檬酸等[20]。這些物質(zhì)若以陰離子形式存在可能會對NaFeEDTA的分離產(chǎn)生干擾，本研究在錦珍醬油和草菇老抽醬油中分別加入苯甲酸鈉、山梨酸鉀、檸檬酸三鈉(添加量為1.0g/L)，分別使用國標方法(C8柱)和本實驗的優(yōu)化方法(C18柱)進行色譜分析。結(jié)果這兩種方法在色譜圖中NaFeEDTA的出峰時間處，均沒有發(fā)現(xiàn)干擾峰，對市售10種未添加NaFeEDTA的醬油進行色譜檢測，結(jié)果兩種方法在FeEDTA-的保留時間處也均沒有干擾峰。因此可判斷使用C8柱和C18柱，醬油中的常見雜質(zhì)，均不會產(chǎn)生干擾。

圖4 添加NaFeEDTA的原汁醬油色譜圖Fig.4 Chromatogram of original soy sauce with spiked NaFeEDTA

2.6 標準曲線

以質(zhì)量濃度(mg/L)為橫坐標，峰面積(mAU)為縱坐標繪制標準曲線，得回歸方程為A=2.48×104C。NaFeEDTA標準溶液質(zhì)量濃度在2～20mg/L范圍內(nèi)，標準曲線相關(guān)系數(shù)為0.9998，線性關(guān)系良好。與國標法相比，相同質(zhì)量濃度NaFeEDTA標準溶液的峰面積基本一致，靈敏度相同。NaFeEDTA溶液的最低檢測限為0.4mg/L(RSN=3)。

2.7 樣品測定

表1 不同品牌醬油中NaFeEDTA的回收率測定結(jié)果Table1 Recovery rates of NaFeEDTA in different soy sauce products

不同醬油的成分存在較大差異，本實驗在市場上購買了10種不同品牌未添加NaFeEDTA的醬油，將一定量NaFeEDTA試劑加入其中，攪拌溶解后制成鐵強化醬油，采用本方法和國標方法分別進行回收率測定，結(jié)果見表1。采用本方法測試的不同品牌的醬油的回收率在94.1%～101.5%之間，平均回收率為97.7%，標準偏差為2.04%。本方法在實驗條件下對同一樣品重復(fù)測定(n=6)的峰面積相對標準偏差為0.93%。采用國標方法的回收率為95.1%～104.7%，平均回收率為98.2%，相對標準偏差為3.3%。兩種方法的測量結(jié)果沒有顯著差異(P＞0.05)，說明兩種方法皆可用于醬油中NaFeEDTA的測定。

3 結(jié) 論

本實驗利用高效液相色譜考察了色譜條件對鐵強化醬油樣品中NaFeEDTA測定的影響。結(jié)果表明，利用TBAOH作為離子對試劑，采用C18色譜柱，可以得到滿意的分離效果。NaFeEDTA標準曲線在2～20mg/L范圍內(nèi)相關(guān)系數(shù)為0.9998。NaFeEDTA溶液的檢出限為0.4mg/L(RSN=3)。對同一樣品重復(fù)測定(n=6)的相對標準偏差為0.93%。本方法通用性好，樣品測定平均回收率為97.7%，與現(xiàn)行國標方法檢測結(jié)果一致，可以用于對鐵強化醬油中NaFeEDTA的測定。

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Determination of NaFeEDTA in Soy Sauce by HPLC

DI Rui1，HUO Jun-sheng2,*，WEI Feng1，HUANG Jian2，SUN Jing2
(1. College of Chemistry and Chemical Engineering, Huangshan University, Huangshan 245041, China；2. Institute of Nutrition and Food Safety, Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing 100050, China)

An HPLC method was developed for the determination of sodium iron ethylenediaminetetraacetate (NaFeEDTA) in soy sauce on a C18column with tetrabutylammonium hydroxide as ion-pair reagent in the mobile phase. In 10 different kinds of soy sauce, at the spiked level of 2.00 g/L, the recovery rates of NaFeEDTA were in the range of 94.1%–101.5%, with an average of 97.7%. The measurement results had no significant difference with those obtained by the national standard method (P ＞ 0.05). This method with good versatility can be used for the determination of NaFeEDTA in soy sauce.

soy sauce；NaFeEDTA；tetrabutylammonium hydroxide；C18column

O657.7

A

1002-6630(2013)18-0150-04

10.7506/spkx1002-6630-201318030

2012-08-27

國家“863”計劃項目(2010AA023004)；黃山學(xué)院科學(xué)研究項目(2006xkjq009)

狄蕊(1979—)，女，講師，碩士，研究方向為分析化學(xué)。E-mail：keania@126.com

*通信作者：霍軍生(1963—)，男，研究員，博士，研究方向為食品營養(yǎng)。E-mail：jhuang@263.net