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        基于羅丹明B磺酸鈉脂質(zhì)體生物傳感器檢測(cè)免疫球蛋白

        2013-03-06 02:31:50嚴(yán)喜鸞曾哲靈
        食品科學(xué) 2013年18期
        關(guān)鍵詞:檢測(cè)

        嚴(yán)喜鸞,肖 竦,曾哲靈,3,*

        (1.南昌大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院,江西 南昌 330031;2.貴陽醫(yī)學(xué)院化學(xué)教研室,貴州 貴陽 550004;3.南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江西 南昌 330047)

        基于羅丹明B磺酸鈉脂質(zhì)體生物傳感器檢測(cè)免疫球蛋白

        嚴(yán)喜鸞1,肖 竦2,曾哲靈1,3,*

        (1.南昌大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院,江西 南昌 330031;2.貴陽醫(yī)學(xué)院化學(xué)教研室,貴州 貴陽 550004;3.南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江西 南昌 330047)

        目的:基于羅丹明B磺酸鈉負(fù)載的熒光脂質(zhì)體構(gòu)建生物傳感器,實(shí)現(xiàn)對(duì)人免疫球蛋白(hIgG)的高靈敏分析檢測(cè)。方法:以磁性微球作為分離和富集載體,采用薄膜水化法將熒光物質(zhì)羅丹明B磺酸鈉鹽(SRB)包裹在脂質(zhì)體的內(nèi)水相中,結(jié)合免疫夾心反應(yīng)模式,構(gòu)建基于熒光脂質(zhì)體的人免疫球蛋白生物傳感器;免疫反應(yīng)結(jié)束后,加入無水乙醇破脂質(zhì)體膜,從而瞬間釋放出脂質(zhì)囊內(nèi)的大量SRB分子,實(shí)現(xiàn)對(duì)hIgG抗原的高靈敏度熒光分析。考察SRB脂質(zhì)體在10d內(nèi)的穩(wěn)定性,優(yōu)化磁性微球和生物素化抗體用量等條件。結(jié)果:熒光脂質(zhì)體穩(wěn)定性較好,hIgG的測(cè)定線性范圍為1~200ng/mL,最低檢出質(zhì)量濃度為1ng/mL(即6.25pmol/L)。結(jié)論:該方法無需標(biāo)記、快速、簡(jiǎn)便、靈敏,為免疫球蛋白的高靈敏度檢測(cè)提供了一種新途徑。

        脂質(zhì)體;磁性微球;免疫球蛋白;生物傳感器;熒光分析

        脂質(zhì)體是由磷脂雙分子層構(gòu)成的具有內(nèi)水相核的脂質(zhì)微囊,形狀多為球形,膜壁厚度約為5~7nm,囊的直徑一般在25~500nm之間[1-5]。脂質(zhì)體因制備工藝簡(jiǎn)單,無免疫抑制作用,在非共價(jià)結(jié)合的情況下裝載上萬個(gè)信號(hào)分子,使其穩(wěn)定性增加和非特異性吸附干擾降低。此外,溶解脂質(zhì)體膜時(shí),可瞬間釋放大量信號(hào)分子,極大提高分析靈敏度。因此,脂質(zhì)體作為放大載體在生物免疫分析中的研究已成為目前熱點(diǎn)之一[6-9]。Zheng Yue等[6]將酶活性物質(zhì)如辣根過氧化物酶包入免疫脂質(zhì)體,當(dāng)免疫脂質(zhì)體與抗原結(jié)合后,通過改變脂質(zhì)體膜通透性釋放出辣根過氧化物酶,與脂質(zhì)體外面的酶底物反應(yīng)而實(shí)現(xiàn)抗原的含量檢測(cè);Egashira等[7]在將電化學(xué)物質(zhì)釕復(fù)合物包裹在脂質(zhì)體內(nèi),成功檢測(cè)了真實(shí)樣品中流感病毒感染后紅細(xì)胞凝集素的含量變化。羅丹明B磺酸鈉鹽(sulforhodamine B sodium salt,SRB)是一種以氧蒽酮為母體、水溶性較好的熒光染料,熒光量子產(chǎn)率高、激發(fā)波長(zhǎng)較長(zhǎng)、適用的pH值范圍寬,故在生物分析和DNA測(cè)序中已有廣泛的應(yīng)用[10-11]。

        磁性微球是指微米級(jí)的超順磁性顆粒。在生物分離中,針對(duì)要進(jìn)行分離的物質(zhì)如底物、抗體、蛋白質(zhì)、特殊細(xì)胞等的特征,可對(duì)磁性微球進(jìn)行功能性修飾,使之能很快結(jié)合在分離物質(zhì)的表面,在外加磁場(chǎng)中有較強(qiáng)的磁響應(yīng),能被磁場(chǎng)吸引從而達(dá)到分離的目的;當(dāng)除去外加磁場(chǎng)后,又可以均勻地分散在溶液中。故磁性微球在食品生物分析領(lǐng)域中具有極大的應(yīng)用潛力[12-14]。

        大量研究證明,口服外源性免疫球蛋白具有預(yù)防腸道疾病,調(diào)節(jié)免疫等功效,還可醫(yī)治因腸道致病菌或因病毒引起的腹瀉等癥。因此,對(duì)免疫球蛋白進(jìn)行開發(fā)應(yīng)用于食品中受到科技工作者的普遍重視,近年來已成功開發(fā)出多種口服免疫球蛋白的功能性食品添加劑,這對(duì)于改善中老年及免疫力低下人群的健康具有重要意義。另外,有研究表明免疫球蛋白對(duì)齲齒有預(yù)防和治療的作用,且已用于牙膏、口香糖等產(chǎn)品的生產(chǎn)中。由于免疫球蛋白含量所占比重較少,質(zhì)量問題也隨之產(chǎn)生,故產(chǎn)品中免疫球蛋白含量的高靈敏檢測(cè)一直是亟待解決的問題。本實(shí)驗(yàn)利用微米級(jí)的磁性微球作為分離和富集載體,以包裹SRB的熒光脂質(zhì)體作為檢測(cè)標(biāo)記物,采用酶聯(lián)免疫反應(yīng)模式針對(duì)免疫球蛋白中主要成分hIgG建立一種高靈敏度的熒光免疫分析技術(shù),以期實(shí)現(xiàn)對(duì)hIgG的高靈敏度檢測(cè)。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        DSPE-PEG2000-Biotin 美國(guó)Avanti公司;Sepharose CL-4B交聯(lián)瓊脂糖凝膠(分析純) 瑞典Pharmacia公司;氫化大豆卵磷脂 德國(guó)Degussa公司;二硬脂酰磷脂酰甘油 德國(guó)Lipoid公司;山羊抗人抗體修飾磁性微球(1.6μm,5mg/mL) 德國(guó)Qiagen公司;羅丹明B磺酸鈉鹽、生物素化羊抗人抗體(1mg/mL)、hIgG、鏈霉親和素(1mg/mL) 美國(guó)Sigma公司;牛血清白蛋白 上海愛紫特公司;Sephadex G-50葡聚糖凝膠(分析純) 中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?;瘜W(xué)試劑公司;實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q高純水。

        1.2 儀器與設(shè)備

        F-300型熒光分析儀 日本日立公司;NicompTM380ZLS型納米粒度及Zeta電位分析儀 美國(guó)PSS Nicomp公司;脂質(zhì)體擠壓器 美國(guó)Avanti公司;R系列旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海申生科技有限公司;HZ-9211K恒溫振蕩器中國(guó)太倉市科教器材廠;Milli-Q基礎(chǔ)型純化水裝置 美國(guó)Millipore公司;磁座分離器 美國(guó)Invitrogen公司;CM120型透射電鏡 荷蘭Philips公司。

        1.3 方法

        1.3.1 SRB脂質(zhì)體的制備

        精密稱取物質(zhì)的量比為10:1的氫化大豆磷脂與膽固醇置于50mL 茄形瓶中,加入2mL氯仿,另加入少量的二硬脂酰磷脂酰甘油的甲醇液,超聲溶解,置于茄形瓶;60℃條件下經(jīng)減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)使之在瓶?jī)?nèi)壁上形成均勻的透明脂膜,氮?dú)獯蹈?,真空干?h;加入SRB的磷酸鹽緩沖液(PBS,pH7.2),60℃條件下恒溫旋轉(zhuǎn),使脂膜完全脫落,60℃條件下超聲水化分散;分別通過0.45μm微孔濾膜3次和0.2μm微孔濾膜11次進(jìn)行整粒;經(jīng)Sephadex G-50柱除去磷脂碎片和游離的SRB分子,得到粒徑為200nm左右的小單室脂質(zhì)體;將脂質(zhì)體和生物素化功能材料(DSPE-PEG2000-Biotin)在37℃條件下孵育12h,制備成生物素化SRB脂質(zhì)體;4℃條件下保存,備用。

        1.3.2 SRB脂質(zhì)體粒徑和Zeta電位的考察

        取少量制備好的SRB脂質(zhì)體溶液,高純水稀釋200倍,轉(zhuǎn)移至測(cè)量杯(1cm×1cm,4cm),用粒度電位分析儀進(jìn)行粒徑測(cè)定。Zeta電位測(cè)定:SRB脂質(zhì)體溶液用高純水稀釋200倍, 用粒度電位分析儀測(cè)定其Zeta電位。測(cè)定參數(shù)為He-Ne激光;測(cè)定角度90°;溫度23℃;黏度0.996cP;折光系數(shù)1.333。

        1.3.3 SRB脂質(zhì)體穩(wěn)定性的考察

        取制備好的SRB脂質(zhì)體少量,平均分成10管,置于24℃條件下保存,每天取1管,通過Sephadex G-50柱去除泄漏的游離SRB小分子(過柱前加入空白脂質(zhì)體,使Sephadex G-50柱預(yù)飽和以消除填柱材料對(duì)脂質(zhì)體吸附造成的誤差),用熒光法測(cè)定考察其泄漏程度。

        1.3.4 SRB脂質(zhì)體生物傳感器的制備

        將一定量的生物素化SRB脂質(zhì)體與鏈霉親和素(1mg/mL,1:500稀釋倍數(shù))混合于PBS液中,置25℃的恒溫振蕩器中反應(yīng)30min,為消除填柱材料對(duì)脂質(zhì)體的影響,在過柱前加入空白脂質(zhì)體,經(jīng)Sepharose CL-4B柱去除游離的鏈霉親和素分子,收集連接有鏈霉親和素的SRB脂質(zhì)體。

        取360μg磁性微球置小管中,100μL的PBS吐溫洗滌液進(jìn)行3次洗滌,磁座分離,吸去上清液;再加入100μL含有10%牛血清白蛋白的PBS液;在37℃條件下進(jìn)行封閉反應(yīng)30min;重復(fù)磁座洗滌,平均分成6管,吸去上清液,分別將不同質(zhì)量濃度的hIgG(0、1、10、50、100、200ng/mL)PBS液100μL加入,37℃中反應(yīng)1h,重復(fù)洗滌,加入生物素化抗體在37℃條件下反應(yīng)1h,經(jīng)洗滌后,將連接有鏈霉親和素的SRB脂質(zhì)體PBS液(每管100μL)加入,24℃條件下進(jìn)行酶聯(lián)免疫反應(yīng)1h,使SRB脂質(zhì)體連接在磁性微球上,用200μL的PBS液對(duì)磁性微球進(jìn)行3次洗滌,磁座分離,吸去上清液,即制備好SRB脂質(zhì)體生物傳感器。

        1.3.5 熒光檢測(cè)

        SRB在乙醇中為強(qiáng)熒光物質(zhì),在一定濃度時(shí),熒光強(qiáng)度與SRB濃度呈正比:

        If=Kc

        式中:If為熒光強(qiáng)度;K為發(fā)光系數(shù);c為SRB濃度/(nmol/L)。

        測(cè)定一系列濃度的SRB乙醇液熒光強(qiáng)度,每管中加入同樣量的空白脂質(zhì)體(假設(shè)磷脂材料在制備過程中沒有損失)以消除影響,SRB濃度范圍為0.425~16.163nmol/L,以熒光強(qiáng)度F為縱坐標(biāo)對(duì)SRB濃度S做標(biāo)準(zhǔn)曲線,得線性回歸方程F=33.855S+6.7501,R2=0.9995,測(cè)量條件:λEX=554nm;λEM=569nm;狹縫10nm。

        取制備好的SRB脂質(zhì)體生物傳感器,用無水乙醇溶解,脂質(zhì)體破膜釋放出來內(nèi)水相中大量的SRB分子,包封在脂質(zhì)體的內(nèi)水相中大量SRB分子故而釋放出來,通過磁座分離棄去磁性微球,收集富含釋放出SRB分子的上清液,重復(fù)3次,合并定容在1mL,用熒光分析儀進(jìn)行檢測(cè)?;赟RB脂質(zhì)體的熒光免疫檢測(cè)hIgG原理圖見圖1。

        圖1 基于SRB脂質(zhì)體的熒光免疫檢測(cè)hIgG原理圖Fig.1 Schematic representation of fluorescence detection of hIgG based on SRB liposomes

        2 結(jié)果與分析

        2.1 SRB脂質(zhì)體表征

        在透射電鏡下觀察經(jīng)1%磷鎢酸染色的SRB脂質(zhì)體,可見其脂質(zhì)雙分子層規(guī)整、均一、連續(xù),呈橢圓形或圓形球體(圖2)。取高純水稀釋200倍的SRB脂質(zhì)體溶液,用粒度電位分析儀進(jìn)行粒徑測(cè)定和Zeta電位測(cè)定,平行測(cè)定6次,SRB脂質(zhì)體的平均粒徑為(201.4±12.1)nm,Zeta電位為(-12.4±2.9)mV,結(jié)果表明,SRB脂質(zhì)體粒徑分布均一性較好(圖3)。

        圖2 透射電鏡下SRB脂質(zhì)體的形態(tài)結(jié)構(gòu)Fig.2 Morphology of SRB-encapsulating liposomes examined by transmission electron microscope (TEM)

        圖3 SRB脂質(zhì)體的粒徑分布圖Fig.3 Size distribution by intensity of SRB-encapsulating liposomes

        2.2 SRB脂質(zhì)體穩(wěn)定性分析由表1可知,SRB脂質(zhì)體在前3d無明顯泄漏,7d內(nèi)

        表1 SRB脂質(zhì)體穩(wěn)定性分析Table1 Stability analysis of SRB-encapsulating lipsomes

        SRB的泄漏率不到5%,說明該脂質(zhì)體穩(wěn)定性好,這為酶聯(lián)免疫實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性提供了保障。

        2.3 免疫反應(yīng)條件的優(yōu)化

        圖4 山羊抗人抗體修飾的磁性微球用量對(duì)熒光強(qiáng)度的影響Fig.4 Fluorescence intensity versus the amount of MB modified anti-IgG antibody

        首先考察山羊抗人抗體修飾的磁性微球用量,選擇其用量分別為15、30、45、60μg和75μg進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)。由圖4可知,在減去未加抗原的相應(yīng)空白值后,60μg的磁性微球的熒光響應(yīng)值比其他用量的熒光響應(yīng)值高,故選擇60μg作為最佳的磁性微球用量。

        圖5 生物素化抗體的用量對(duì)熒光強(qiáng)度的影響Fig.5 Fluorescence intensity versus the amount of biotin-labeled anti-IgG antibody

        其次,詳細(xì)考察生物素化抗體的用量(0.02、0.05、0.1、0.2、0.4μg)對(duì)熒光信強(qiáng)度的影響,如圖5所示。開始隨生物素化抗體用量的增加,熒光強(qiáng)度也隨之增加,當(dāng)用量為0.1~0.2μg時(shí),熒光信號(hào)增長(zhǎng)趨勢(shì)較緩,但超過0.2μg時(shí)熒光強(qiáng)度反而下降,這可能是過多的抗體不利于與脂質(zhì)體上鏈霉親和素的反應(yīng),從而導(dǎo)致熒光強(qiáng)度的降低。故選擇0.2μg的生物素化抗體用量進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

        此外,對(duì)兩步有關(guān)生物素與鏈霉親和素結(jié)合反應(yīng)的時(shí)間進(jìn)行了考察。生物素化SRB脂質(zhì)體與鏈霉親和素反應(yīng)時(shí)間分別為30、45、60、90min,將所得的4個(gè)熒光強(qiáng)度進(jìn)行比較,無明顯差別;當(dāng)結(jié)合了鏈霉親和素的脂質(zhì)體與已連接在磁性微球上的生物素化抗體進(jìn)行反應(yīng),60min時(shí)得到的信號(hào)響應(yīng)值最大,所以這兩步結(jié)合反應(yīng)的時(shí)間分別選定為30min和60min。同時(shí)也對(duì)鏈霉親和素用量(1mg/mL,100μL)進(jìn)行考察,其稀釋度在1:200~1:500之間的改變對(duì)測(cè)定結(jié)果均無明顯差別,但當(dāng)稀釋度在1:1000時(shí),熒光響應(yīng)值開始下降,故選擇稀釋度為1:500的鏈霉親和素用量進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

        2.4 線性與精密度

        在選定的條件下,按圖1的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行目標(biāo)物hIgG的熒光檢測(cè)。結(jié)果目標(biāo)物hIgG的質(zhì)量濃度在1~200ng/mL范圍內(nèi),熒光強(qiáng)度呈線性增加(y=1.432x+21.454,R2=0.9952),當(dāng)hIgG的質(zhì)量濃度超過200ng/mL,熒光信號(hào)呈S線態(tài)勢(shì),偏離工作曲線,且較高質(zhì)量濃度的hIgG難以獲得檢測(cè)線性關(guān)系,原因可能是當(dāng)檢測(cè)物hIgG的質(zhì)量濃度較大時(shí),其所連接的SRB脂質(zhì)體量也多,從而釋放過多SRB分子產(chǎn)生熒光猝滅,線性關(guān)系受到破壞。用同一批制備的脂質(zhì)體進(jìn)行實(shí)驗(yàn),重復(fù)測(cè)定6次,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.26%。

        2.5 人血清中hIgG的檢測(cè)

        取正常人血清用PBS(pH7.2)稀釋一定的倍數(shù)(約 1×105倍),進(jìn)行hIgG的含量檢測(cè),測(cè)量結(jié)果均在人血清中hIgG含量的正常范圍內(nèi)(8~14g/L),用標(biāo)準(zhǔn)加入法測(cè)定其回收率。結(jié)果表明,本方法在實(shí)際樣品的檢測(cè)中具有一定的可行性(表2)。

        表2 人血清中hIgG的檢測(cè)結(jié)果Table2 Determination results of hIgG in human serum using the proposed immunosensor

        表3 IgG的最低分析檢測(cè)值比較Table3 Comparison of the immunoassay methods developed for IgG

        3 結(jié)論與討論

        本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了基于磁性微球載體上的脂質(zhì)體熒光免疫傳感器,在繼承傳統(tǒng)免疫傳感器的的基礎(chǔ)上,應(yīng)用脂質(zhì)體能包埋大量信號(hào)物質(zhì)SRB熒光分子的特性,通過磁性微球預(yù)先將未與抗體(或抗原)結(jié)合的脂質(zhì)體分離,再采用化學(xué)試劑無水乙醇溶胞法溶解脂質(zhì)體,避免了非特異性吸附的干擾,極大提高了熒光測(cè)定hIgG的靈敏度。

        實(shí)驗(yàn)結(jié)果能在相對(duì)較大的檢測(cè)范圍得到較低的檢測(cè)質(zhì)量濃度,靈敏度較好。在該實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),磷脂材料用量對(duì)SRB熒光檢測(cè)結(jié)果沒有明顯影響;負(fù)載于脂質(zhì)體內(nèi)SRB的加入濃度為30mmol/L,接近其在磷酸鹽緩沖液的飽和濃度,相對(duì)于濃度20mmol/L與10mmol/L的SRB脂質(zhì)體的免疫檢測(cè)結(jié)果較佳,最低檢測(cè)質(zhì)量濃度可達(dá)1ng/mL;對(duì)于破膜劑而言,無水乙醇比Triton X-100具有更加良好的熒光檢測(cè)SRB結(jié)果;使用一周前制備好SRB脂質(zhì)體進(jìn)行實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明也能檢測(cè)到質(zhì)量濃度為1ng/mL的hIgG,而且熒光強(qiáng)度與hIgG質(zhì)量濃度呈良好線性關(guān)系。隨著今后脂質(zhì)體結(jié)合新手段的研發(fā)以及新型信號(hào)物質(zhì)的研制,脂質(zhì)體作為放大的免疫傳感器將更為廣泛地應(yīng)用于環(huán)境和食品中痕量物質(zhì)的監(jiān)測(cè)。

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        Detection of Human IgG with Biosensor Based on SRB-Encapsulated Liposomes

        YAN Xi-luan1,XIAO Song2,ZENG Zhe-ling1,3,*
        (1. School of Environment and Chemical Engineering, Nanchang University, Nanchang 330031, China;2. Chemistry Teaching and Research Section, Guiyang Medical College, Guiyang 550004, China;3. State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

        Purpose: To fabricate a biosensor based on sulforhodamine B sodium salt (SRB)-encapsulating liposomes for highly sensitive detection of human IgG (hIgG). Methods: An immunoliposome encapsulating SRB was prepared and used to develop a fluorescent biosensor by the film dispersion method. Magnetic beads (MB) were employed as the immobilization and separation carrier. By enzyme-linked immunospecific assay (ELISA) method, MB modified anti-IgG antibodies were linked to SRB-encapsulating liposomes, which instantaneously released a great quantity of SRB molecules upon alcohol addition, resulting in highly sensitive fluorescent detection of hIgG. SRB-encapsulating liposomes had good stability in 10 days. The optimized condition was as follows: 60 μg of MB modified anti-IgG antibody and 0.2 μg of biotin-labeled anti-IgG antibody Results: The lowest detectable concentration of hIgG was 1 ng/mL (6.25 pmol/L), and the linear range was 1 to 200 ng/mL. Conclusions: This lable-free protocol can provide a rapid, simple and sensitive approach to detecting IgG.

        liposomes;magnetic beads;immunoglobulin;biosensor;fluorescent analysis

        Q511

        A

        1002-6630(2013)18-0141-05

        10.7506/spkx1002-6630-201318028

        2012-09-05

        國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目(81102289);江西省教育廳青年科學(xué)基金項(xiàng)目(GJJ10053);貴州省科技廳計(jì)劃發(fā)展資助項(xiàng)目(黔J20122026);江西省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(20132BAB205106)

        嚴(yán)喜鸞(1975—),女,講師,博士,研究方向?yàn)樯锩庖叻治?。E-mail:15970427701@163.com

        *通信作者:曾哲靈(1965—),男,教授,博士,研究方向?yàn)槭澄镔Y源開發(fā)利用與生物質(zhì)轉(zhuǎn)化。E-mail:zengzheling@126.com

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