嚴(yán)喜鸞，肖 竦，曾哲靈,3,*

(1.南昌大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，江西 南昌 330031；2.貴陽醫(yī)學(xué)院化學(xué)教研室，貴州 貴陽 550004；3.南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047)

基于羅丹明B磺酸鈉脂質(zhì)體生物傳感器檢測(cè)免疫球蛋白

嚴(yán)喜鸞1，肖 竦2，曾哲靈1,3,*

(1.南昌大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，江西 南昌 330031；2.貴陽醫(yī)學(xué)院化學(xué)教研室，貴州 貴陽 550004；3.南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047)

目的：基于羅丹明B磺酸鈉負(fù)載的熒光脂質(zhì)體構(gòu)建生物傳感器，實(shí)現(xiàn)對(duì)人免疫球蛋白(hIgG)的高靈敏分析檢測(cè)。方法：以磁性微球作為分離和富集載體，采用薄膜水化法將熒光物質(zhì)羅丹明B磺酸鈉鹽(SRB)包裹在脂質(zhì)體的內(nèi)水相中，結(jié)合免疫夾心反應(yīng)模式，構(gòu)建基于熒光脂質(zhì)體的人免疫球蛋白生物傳感器；免疫反應(yīng)結(jié)束后，加入無水乙醇破脂質(zhì)體膜，從而瞬間釋放出脂質(zhì)囊內(nèi)的大量SRB分子，實(shí)現(xiàn)對(duì)hIgG抗原的高靈敏度熒光分析。考察SRB脂質(zhì)體在10d內(nèi)的穩(wěn)定性，優(yōu)化磁性微球和生物素化抗體用量等條件。結(jié)果：熒光脂質(zhì)體穩(wěn)定性較好，hIgG的測(cè)定線性范圍為1～200ng/mL，最低檢出質(zhì)量濃度為1ng/mL(即6.25pmol/L)。結(jié)論：該方法無需標(biāo)記、快速、簡(jiǎn)便、靈敏，為免疫球蛋白的高靈敏度檢測(cè)提供了一種新途徑。

脂質(zhì)體；磁性微球；免疫球蛋白；生物傳感器；熒光分析

脂質(zhì)體是由磷脂雙分子層構(gòu)成的具有內(nèi)水相核的脂質(zhì)微囊，形狀多為球形，膜壁厚度約為5～7nm，囊的直徑一般在25～500nm之間[1-5]。脂質(zhì)體因制備工藝簡(jiǎn)單，無免疫抑制作用，在非共價(jià)結(jié)合的情況下裝載上萬個(gè)信號(hào)分子，使其穩(wěn)定性增加和非特異性吸附干擾降低。此外，溶解脂質(zhì)體膜時(shí)，可瞬間釋放大量信號(hào)分子，極大提高分析靈敏度。因此，脂質(zhì)體作為放大載體在生物免疫分析中的研究已成為目前熱點(diǎn)之一[6-9]。Zheng Yue等[6]將酶活性物質(zhì)如辣根過氧化物酶包入免疫脂質(zhì)體，當(dāng)免疫脂質(zhì)體與抗原結(jié)合后，通過改變脂質(zhì)體膜通透性釋放出辣根過氧化物酶，與脂質(zhì)體外面的酶底物反應(yīng)而實(shí)現(xiàn)抗原的含量檢測(cè)；Egashira等[7]在將電化學(xué)物質(zhì)釕復(fù)合物包裹在脂質(zhì)體內(nèi)，成功檢測(cè)了真實(shí)樣品中流感病毒感染后紅細(xì)胞凝集素的含量變化。羅丹明B磺酸鈉鹽(sulforhodamine B sodium salt，SRB)是一種以氧蒽酮為母體、水溶性較好的熒光染料，熒光量子產(chǎn)率高、激發(fā)波長(zhǎng)較長(zhǎng)、適用的pH值范圍寬，故在生物分析和DNA測(cè)序中已有廣泛的應(yīng)用[10-11]。

磁性微球是指微米級(jí)的超順磁性顆粒。在生物分離中，針對(duì)要進(jìn)行分離的物質(zhì)如底物、抗體、蛋白質(zhì)、特殊細(xì)胞等的特征，可對(duì)磁性微球進(jìn)行功能性修飾，使之能很快結(jié)合在分離物質(zhì)的表面，在外加磁場(chǎng)中有較強(qiáng)的磁響應(yīng)，能被磁場(chǎng)吸引從而達(dá)到分離的目的；當(dāng)除去外加磁場(chǎng)后，又可以均勻地分散在溶液中。故磁性微球在食品生物分析領(lǐng)域中具有極大的應(yīng)用潛力[12-14]。

大量研究證明，口服外源性免疫球蛋白具有預(yù)防腸道疾病，調(diào)節(jié)免疫等功效，還可醫(yī)治因腸道致病菌或因病毒引起的腹瀉等癥。因此，對(duì)免疫球蛋白進(jìn)行開發(fā)應(yīng)用于食品中受到科技工作者的普遍重視，近年來已成功開發(fā)出多種口服免疫球蛋白的功能性食品添加劑，這對(duì)于改善中老年及免疫力低下人群的健康具有重要意義。另外，有研究表明免疫球蛋白對(duì)齲齒有預(yù)防和治療的作用，且已用于牙膏、口香糖等產(chǎn)品的生產(chǎn)中。由于免疫球蛋白含量所占比重較少，質(zhì)量問題也隨之產(chǎn)生，故產(chǎn)品中免疫球蛋白含量的高靈敏檢測(cè)一直是亟待解決的問題。本實(shí)驗(yàn)利用微米級(jí)的磁性微球作為分離和富集載體，以包裹SRB的熒光脂質(zhì)體作為檢測(cè)標(biāo)記物，采用酶聯(lián)免疫反應(yīng)模式針對(duì)免疫球蛋白中主要成分hIgG建立一種高靈敏度的熒光免疫分析技術(shù)，以期實(shí)現(xiàn)對(duì)hIgG的高靈敏度檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

DSPE-PEG2000-Biotin 美國(guó)Avanti公司；Sepharose CL-4B交聯(lián)瓊脂糖凝膠(分析純) 瑞典Pharmacia公司；氫化大豆卵磷脂 德國(guó)Degussa公司；二硬脂酰磷脂酰甘油 德國(guó)Lipoid公司；山羊抗人抗體修飾磁性微球(1.6μm，5mg/mL) 德國(guó)Qiagen公司；羅丹明B磺酸鈉鹽、生物素化羊抗人抗體(1mg/mL)、hIgG、鏈霉親和素(1mg/mL) 美國(guó)Sigma公司；牛血清白蛋白 上海愛紫特公司；Sephadex G-50葡聚糖凝膠(分析純) 中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司；實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q高純水。

1.2 儀器與設(shè)備

F-300型熒光分析儀 日本日立公司；NicompTM380ZLS型納米粒度及Zeta電位分析儀 美國(guó)PSS Nicomp公司；脂質(zhì)體擠壓器 美國(guó)Avanti公司；R系列旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海申生科技有限公司；HZ-9211K恒溫振蕩器中國(guó)太倉市科教器材廠；Milli-Q基礎(chǔ)型純化水裝置 美國(guó)Millipore公司；磁座分離器 美國(guó)Invitrogen公司；CM120型透射電鏡 荷蘭Philips公司。

1.3 方法

1.3.1 SRB脂質(zhì)體的制備

精密稱取物質(zhì)的量比為10:1的氫化大豆磷脂與膽固醇置于50mL 茄形瓶中，加入2mL氯仿，另加入少量的二硬脂酰磷脂酰甘油的甲醇液，超聲溶解，置于茄形瓶；60℃條件下經(jīng)減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)使之在瓶?jī)?nèi)壁上形成均勻的透明脂膜，氮?dú)獯蹈?，真空干?h；加入SRB的磷酸鹽緩沖液(PBS，pH7.2)，60℃條件下恒溫旋轉(zhuǎn)，使脂膜完全脫落，60℃條件下超聲水化分散；分別通過0.45μm微孔濾膜3次和0.2μm微孔濾膜11次進(jìn)行整粒；經(jīng)Sephadex G-50柱除去磷脂碎片和游離的SRB分子，得到粒徑為200nm左右的小單室脂質(zhì)體；將脂質(zhì)體和生物素化功能材料(DSPE-PEG2000-Biotin)在37℃條件下孵育12h，制備成生物素化SRB脂質(zhì)體；4℃條件下保存，備用。

1.3.2 SRB脂質(zhì)體粒徑和Zeta電位的考察

取少量制備好的SRB脂質(zhì)體溶液，高純水稀釋200倍，轉(zhuǎn)移至測(cè)量杯(1cm×1cm，4cm)，用粒度電位分析儀進(jìn)行粒徑測(cè)定。Zeta電位測(cè)定：SRB脂質(zhì)體溶液用高純水稀釋200倍, 用粒度電位分析儀測(cè)定其Zeta電位。測(cè)定參數(shù)為He-Ne激光；測(cè)定角度90°；溫度23℃；黏度0.996cP；折光系數(shù)1.333。

1.3.3 SRB脂質(zhì)體穩(wěn)定性的考察

取制備好的SRB脂質(zhì)體少量，平均分成10管，置于24℃條件下保存，每天取1管，通過Sephadex G-50柱去除泄漏的游離SRB小分子(過柱前加入空白脂質(zhì)體，使Sephadex G-50柱預(yù)飽和以消除填柱材料對(duì)脂質(zhì)體吸附造成的誤差)，用熒光法測(cè)定考察其泄漏程度。

1.3.4 SRB脂質(zhì)體生物傳感器的制備

將一定量的生物素化SRB脂質(zhì)體與鏈霉親和素(1mg/mL，1:500稀釋倍數(shù))混合于PBS液中，置25℃的恒溫振蕩器中反應(yīng)30min，為消除填柱材料對(duì)脂質(zhì)體的影響，在過柱前加入空白脂質(zhì)體，經(jīng)Sepharose CL-4B柱去除游離的鏈霉親和素分子，收集連接有鏈霉親和素的SRB脂質(zhì)體。

取360μg磁性微球置小管中，100μL的PBS吐溫洗滌液進(jìn)行3次洗滌，磁座分離，吸去上清液；再加入100μL含有10%牛血清白蛋白的PBS液；在37℃條件下進(jìn)行封閉反應(yīng)30min；重復(fù)磁座洗滌，平均分成6管，吸去上清液，分別將不同質(zhì)量濃度的hIgG(0、1、10、50、100、200ng/mL)PBS液100μL加入，37℃中反應(yīng)1h，重復(fù)洗滌，加入生物素化抗體在37℃條件下反應(yīng)1h，經(jīng)洗滌后，將連接有鏈霉親和素的SRB脂質(zhì)體PBS液(每管100μL)加入，24℃條件下進(jìn)行酶聯(lián)免疫反應(yīng)1h，使SRB脂質(zhì)體連接在磁性微球上，用200μL的PBS液對(duì)磁性微球進(jìn)行3次洗滌，磁座分離，吸去上清液，即制備好SRB脂質(zhì)體生物傳感器。

1.3.5 熒光檢測(cè)

SRB在乙醇中為強(qiáng)熒光物質(zhì)，在一定濃度時(shí)，熒光強(qiáng)度與SRB濃度呈正比：

If＝Kc

式中：If為熒光強(qiáng)度；K為發(fā)光系數(shù)；c為SRB濃度/(nmol/L)。

測(cè)定一系列濃度的SRB乙醇液熒光強(qiáng)度，每管中加入同樣量的空白脂質(zhì)體(假設(shè)磷脂材料在制備過程中沒有損失)以消除影響，SRB濃度范圍為0.425～16.163nmol/L，以熒光強(qiáng)度F為縱坐標(biāo)對(duì)SRB濃度S做標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程F=33.855S＋6.7501，R2=0.9995，測(cè)量條件：λEX=554nm；λEM=569nm；狹縫10nm。

取制備好的SRB脂質(zhì)體生物傳感器，用無水乙醇溶解，脂質(zhì)體破膜釋放出來內(nèi)水相中大量的SRB分子，包封在脂質(zhì)體的內(nèi)水相中大量SRB分子故而釋放出來，通過磁座分離棄去磁性微球，收集富含釋放出SRB分子的上清液，重復(fù)3次，合并定容在1mL，用熒光分析儀進(jìn)行檢測(cè)?；赟RB脂質(zhì)體的熒光免疫檢測(cè)hIgG原理圖見圖1。

圖1 基于SRB脂質(zhì)體的熒光免疫檢測(cè)hIgG原理圖Fig.1 Schematic representation of fluorescence detection of hIgG based on SRB liposomes

2 結(jié)果與分析

2.1 SRB脂質(zhì)體表征

在透射電鏡下觀察經(jīng)1%磷鎢酸染色的SRB脂質(zhì)體，可見其脂質(zhì)雙分子層規(guī)整、均一、連續(xù)，呈橢圓形或圓形球體(圖2)。取高純水稀釋200倍的SRB脂質(zhì)體溶液，用粒度電位分析儀進(jìn)行粒徑測(cè)定和Zeta電位測(cè)定，平行測(cè)定6次，SRB脂質(zhì)體的平均粒徑為(201.4±12.1)nm，Zeta電位為(－12.4±2.9)mV，結(jié)果表明，SRB脂質(zhì)體粒徑分布均一性較好(圖3)。

圖2 透射電鏡下SRB脂質(zhì)體的形態(tài)結(jié)構(gòu)Fig.2 Morphology of SRB-encapsulating liposomes examined by transmission electron microscope (TEM)

圖3 SRB脂質(zhì)體的粒徑分布圖Fig.3 Size distribution by intensity of SRB-encapsulating liposomes

2.2 SRB脂質(zhì)體穩(wěn)定性分析由表1可知，SRB脂質(zhì)體在前3d無明顯泄漏，7d內(nèi)

表1 SRB脂質(zhì)體穩(wěn)定性分析Table1 Stability analysis of SRB-encapsulating lipsomes

SRB的泄漏率不到5%，說明該脂質(zhì)體穩(wěn)定性好，這為酶聯(lián)免疫實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性提供了保障。

2.3 免疫反應(yīng)條件的優(yōu)化

圖4 山羊抗人抗體修飾的磁性微球用量對(duì)熒光強(qiáng)度的影響Fig.4 Fluorescence intensity versus the amount of MB modified anti-IgG antibody

首先考察山羊抗人抗體修飾的磁性微球用量，選擇其用量分別為15、30、45、60μg和75μg進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)。由圖4可知，在減去未加抗原的相應(yīng)空白值后，60μg的磁性微球的熒光響應(yīng)值比其他用量的熒光響應(yīng)值高，故選擇60μg作為最佳的磁性微球用量。

圖5 生物素化抗體的用量對(duì)熒光強(qiáng)度的影響Fig.5 Fluorescence intensity versus the amount of biotin-labeled anti-IgG antibody

其次，詳細(xì)考察生物素化抗體的用量(0.02、0.05、0.1、0.2、0.4μg)對(duì)熒光信強(qiáng)度的影響，如圖5所示。開始隨生物素化抗體用量的增加，熒光強(qiáng)度也隨之增加，當(dāng)用量為0.1～0.2μg時(shí)，熒光信號(hào)增長(zhǎng)趨勢(shì)較緩，但超過0.2μg時(shí)熒光強(qiáng)度反而下降，這可能是過多的抗體不利于與脂質(zhì)體上鏈霉親和素的反應(yīng)，從而導(dǎo)致熒光強(qiáng)度的降低。故選擇0.2μg的生物素化抗體用量進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

此外，對(duì)兩步有關(guān)生物素與鏈霉親和素結(jié)合反應(yīng)的時(shí)間進(jìn)行了考察。生物素化SRB脂質(zhì)體與鏈霉親和素反應(yīng)時(shí)間分別為30、45、60、90min，將所得的4個(gè)熒光強(qiáng)度進(jìn)行比較，無明顯差別；當(dāng)結(jié)合了鏈霉親和素的脂質(zhì)體與已連接在磁性微球上的生物素化抗體進(jìn)行反應(yīng)，60min時(shí)得到的信號(hào)響應(yīng)值最大，所以這兩步結(jié)合反應(yīng)的時(shí)間分別選定為30min和60min。同時(shí)也對(duì)鏈霉親和素用量(1mg/mL，100μL)進(jìn)行考察，其稀釋度在1:200～1:500之間的改變對(duì)測(cè)定結(jié)果均無明顯差別，但當(dāng)稀釋度在1:1000時(shí)，熒光響應(yīng)值開始下降，故選擇稀釋度為1:500的鏈霉親和素用量進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.4 線性與精密度

在選定的條件下，按圖1的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行目標(biāo)物hIgG的熒光檢測(cè)。結(jié)果目標(biāo)物hIgG的質(zhì)量濃度在1～200ng/mL范圍內(nèi)，熒光強(qiáng)度呈線性增加(y=1.432x＋21.454，R2＝0.9952)，當(dāng)hIgG的質(zhì)量濃度超過200ng/mL，熒光信號(hào)呈S線態(tài)勢(shì)，偏離工作曲線，且較高質(zhì)量濃度的hIgG難以獲得檢測(cè)線性關(guān)系，原因可能是當(dāng)檢測(cè)物hIgG的質(zhì)量濃度較大時(shí)，其所連接的SRB脂質(zhì)體量也多，從而釋放過多SRB分子產(chǎn)生熒光猝滅，線性關(guān)系受到破壞。用同一批制備的脂質(zhì)體進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，重復(fù)測(cè)定6次，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.26%。

2.5 人血清中hIgG的檢測(cè)

取正常人血清用PBS(pH7.2)稀釋一定的倍數(shù)(約 1×105倍)，進(jìn)行hIgG的含量檢測(cè)，測(cè)量結(jié)果均在人血清中hIgG含量的正常范圍內(nèi)(8～14g/L)，用標(biāo)準(zhǔn)加入法測(cè)定其回收率。結(jié)果表明，本方法在實(shí)際樣品的檢測(cè)中具有一定的可行性(表2)。

表2 人血清中hIgG的檢測(cè)結(jié)果Table2 Determination results of hIgG in human serum using the proposed immunosensor

表3 IgG的最低分析檢測(cè)值比較Table3 Comparison of the immunoassay methods developed for IgG

3 結(jié)論與討論

本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了基于磁性微球載體上的脂質(zhì)體熒光免疫傳感器，在繼承傳統(tǒng)免疫傳感器的的基礎(chǔ)上，應(yīng)用脂質(zhì)體能包埋大量信號(hào)物質(zhì)SRB熒光分子的特性，通過磁性微球預(yù)先將未與抗體(或抗原)結(jié)合的脂質(zhì)體分離，再采用化學(xué)試劑無水乙醇溶胞法溶解脂質(zhì)體，避免了非特異性吸附的干擾，極大提高了熒光測(cè)定hIgG的靈敏度。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果能在相對(duì)較大的檢測(cè)范圍得到較低的檢測(cè)質(zhì)量濃度，靈敏度較好。在該實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，磷脂材料用量對(duì)SRB熒光檢測(cè)結(jié)果沒有明顯影響；負(fù)載于脂質(zhì)體內(nèi)SRB的加入濃度為30mmol/L，接近其在磷酸鹽緩沖液的飽和濃度，相對(duì)于濃度20mmol/L與10mmol/L的SRB脂質(zhì)體的免疫檢測(cè)結(jié)果較佳，最低檢測(cè)質(zhì)量濃度可達(dá)1ng/mL；對(duì)于破膜劑而言，無水乙醇比Triton X-100具有更加良好的熒光檢測(cè)SRB結(jié)果；使用一周前制備好SRB脂質(zhì)體進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明也能檢測(cè)到質(zhì)量濃度為1ng/mL的hIgG，而且熒光強(qiáng)度與hIgG質(zhì)量濃度呈良好線性關(guān)系。隨著今后脂質(zhì)體結(jié)合新手段的研發(fā)以及新型信號(hào)物質(zhì)的研制，脂質(zhì)體作為放大的免疫傳感器將更為廣泛地應(yīng)用于環(huán)境和食品中痕量物質(zhì)的監(jiān)測(cè)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 張靈芝. 脂質(zhì)體制備及其在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用[M]. 北京: 北京醫(yī)科大學(xué)、中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社, 1998: 1-14.

[2] 林親錄, 施兆鵬, 劉湘新, 等. 脂質(zhì)體與膠束體兒茶素對(duì)動(dòng)物血清血脂的影響[J]. 食品科學(xué), 2002, 23(11): 129-133.

[3] 田艷燕, 段相林, 常彥忠. 番茄紅素脂質(zhì)體的制備[J]. 食品科學(xué), 2007, 28(4): 128-132.

[4] 葛蘭, 段相林, 常彥忠 .血紅素鐵脂質(zhì)體的制備[J]. 食品科學(xué), 2009, 30(12): 48-51.

[5] 范明輝, 許時(shí)嬰. 膽固醇對(duì)紅景天苷脂質(zhì)體的制備及物化穩(wěn)定性的影響[J]. 食品科學(xué), 2008, 29(2): 59-63.

[6] ZHENG Yue, CHEN Huan, LIU Xueping, et al. An ultrasensitive chemiluminescence immunosensor for PSA based on the enzyme encapsulated liposome[J]. Talanta, 2008, 77(2): 809-814.

[7] EGASHIRA N, MORITA S, HIFUMI E, et al. Attomole detection of hemagglutinin molecule of influenza virus by combining an electrochemiluminescence sensor with an immunoliposome that encapsulates a Ru complex[J]. Analytical Chemistry, 2008, 80(11): 4020-4025.

[8] ZHAN W, BARD A J. Immunoassay of human C-reactive protein by using Ru(bpy)32+-encapsulated liposomes as labels[J]. Analytical Chemistry, 2007, 79(2): 459-463.

[9] VISWANATHAN S, WU L C, HUANG M R. Electrochemical immunosensor for cholera toxin using liposomes and poly (3,4-ethylenedioxythiophene)-coated carbon nanotubes[J]. Analytical Chemistry, 2006, 78(4): 1115-1121.

[10] VINAYAK R. A convenient, solid-phase coupling of rhodamine dye acids to 5’amino-oligonucleotides[J]. Tetrahedron Letters, 1999, 40(43): 7611-7613.

[11] LI Jun, WANG Keming, TAN Weihong, et al. Quantitative detection of the expression product of tumor suppressor gene ING1 by molecular beacon fluorescence probe[J]. Chemical Journal of Chinese Universities, 2004, 25(3): 421-424.

[12] HAFELI U, SCHUTT W, ELLER J, et al. Scientific and clinical applications of magnetic carriers[M]. New York: Plenum, 1997.

[13] 封麗, 閻瑞香, 馮春雨, 等. 兩種功能化磁性載體固定重組幾丁質(zhì)酶的研究[J]. 食品科學(xué), 2010, 31(3): 173-176.

[14] 趙良忠, 劉靜霆, 任光云, 等. 磁性殼聚糖微球固定化胃蛋白酶的研究[J]. 食品科學(xué), 2008, 29(11): 316-323.

[15] MAK W C, CHEUNG K Y, TRAU D, et al. Electrochemical bioassay utilizing encapsulated electrochemical active microcrystal biolabels[J]. Analytical Chemistry, 2005, 77(9): 2835-2841.

[16] WELLMAN A D, SEPANIAK M J. Magnetically-assisted transport evanescent field fluoroimmunoassay[J]. Analytical Chemistry, 2006, 78(13): 4450-4456.

[17] LING Jian, LI Yuanfang, HUANG Chengzhi. Visual sandwich immunoassay system on the basis of plasmon resonance scattering signals of silver nanoparticles[J]. Analytical Chemistry, 2009, 81(4): 1707-1714.

[18] LI Zhengping, WANG Yucong, LIU Chenghui, et al. Development of chemiluminescence detection of gold nanoparticles in biological conjugates for immunoassay[J]. Analytica Chimica Acta, 2005, 551(1/2): 85-91.

[19] YANG Minghui, WANG Cunchang. Label-free immunosensor based on gold nanoparticle silver enhancement[J]. Analytical Biochemistry, 2009, 385(1): 128-131.

[20] 李玲, 王海燕, 孫東艷, 等. 基于碳納米管的脂質(zhì)體電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器檢測(cè)人免疫球蛋白G[J]. 分析化學(xué), 2010, 38(9): 1329-1332.

Detection of Human IgG with Biosensor Based on SRB-Encapsulated Liposomes

YAN Xi-luan1，XIAO Song2，ZENG Zhe-ling1,3,*
(1. School of Environment and Chemical Engineering, Nanchang University, Nanchang 330031, China；2. Chemistry Teaching and Research Section, Guiyang Medical College, Guiyang 550004, China；3. State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

Purpose: To fabricate a biosensor based on sulforhodamine B sodium salt (SRB)-encapsulating liposomes for highly sensitive detection of human IgG (hIgG). Methods: An immunoliposome encapsulating SRB was prepared and used to develop a fluorescent biosensor by the film dispersion method. Magnetic beads (MB) were employed as the immobilization and separation carrier. By enzyme-linked immunospecific assay (ELISA) method, MB modified anti-IgG antibodies were linked to SRB-encapsulating liposomes, which instantaneously released a great quantity of SRB molecules upon alcohol addition, resulting in highly sensitive fluorescent detection of hIgG. SRB-encapsulating liposomes had good stability in 10 days. The optimized condition was as follows: 60 μg of MB modified anti-IgG antibody and 0.2 μg of biotin-labeled anti-IgG antibody Results: The lowest detectable concentration of hIgG was 1 ng/mL (6.25 pmol/L), and the linear range was 1 to 200 ng/mL. Conclusions: This lable-free protocol can provide a rapid, simple and sensitive approach to detecting IgG.

liposomes；magnetic beads；immunoglobulin；biosensor；fluorescent analysis

Q511

A

1002-6630(2013)18-0141-05

10.7506/spkx1002-6630-201318028

2012-09-05

國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目(81102289)；江西省教育廳青年科學(xué)基金項(xiàng)目(GJJ10053)；貴州省科技廳計(jì)劃發(fā)展資助項(xiàng)目(黔J20122026)；江西省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(20132BAB205106)

嚴(yán)喜鸞(1975—)，女，講師，博士，研究方向?yàn)樯锩庖叻治?。E-mail：15970427701@163.com

*通信作者：曾哲靈(1965—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)槭澄镔Y源開發(fā)利用與生物質(zhì)轉(zhuǎn)化。E-mail：zengzheling@126.com