許瑞波，高穎穎，周圣翔，詹永成，胡喜蘭

(淮海工學(xué)院化工學(xué)院，江蘇 連云港 222005)

醇浸牛蒡根中水溶性多糖的提取及生物活性研究

許瑞波，高穎穎，周圣翔，詹永成，胡喜蘭

(淮海工學(xué)院化工學(xué)院，江蘇 連云港 222005)

研究醇浸牛蒡根多糖的提取工藝及生物活性。以醇浸泡后的牛蒡根為原料，采用水提醇沉法，通過單因素和正交試驗優(yōu)化牛蒡根中水溶性多糖的提取工藝條件。結(jié)果表明：料液比1:25(g/mL)、提取時間2.5h、提取溫度85℃、提取2次時，WPRA提取率為8.43%。WPRA經(jīng)Sevag法脫蛋白后，用紫外光譜、紅外光譜進(jìn)行表征，證明產(chǎn)物可能為含有肽鍵的多糖類物質(zhì)。體外抗氧化性實驗表明，WPRA對DPPH自由基具有一定的清除能力，對超氧陰離子自由基清除能力較弱。抑菌實驗表明WSPA對受試菌株基本沒有抑制作用。

醇浸；牛蒡根；水溶性多糖；提?。豢寡趸钚?；抑菌作用

牛蒡(Arctium lappa L.)又名白肌人參、大力子等，屬菊科牛蒡?qū)僦备刀晟笮筒荼局参铮腿~可作蔬菜，種子和根可入藥，是較好的藥食同源植物[1-3]。牛蒡根為肉質(zhì)直根，味微苦而性黏，富含蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素、膳食纖維等營養(yǎng)成分及菊糖、綠原酸、咖啡酸、黃酮類化合物和揮發(fā)油等活性成分，具有祛風(fēng)熱、消腫痛、抗菌、抗氧化等作用，可用于治療急性乳腺炎、心血管疾病和惡性腫瘤，被《名醫(yī)別錄》、《本草綱目》等收錄[4-8]。

牛蒡?qū)倬湛浦械南√厥卟?，被譽為“蔬菜之王”，原產(chǎn)我國，公元940年前后傳入日本[1-2]。近年來，在江蘇、山東、北京等地被大規(guī)模種植，主要出口日本以及歐洲許多國家。由于牛蒡根具有良好的醫(yī)療保健作用和獨特的綜合營養(yǎng)價值，人們除了直接食用和藥用之外，對其活性成分展開了廣泛的研究[1,4-7,9-10]。研究牛蒡根活性成分時，一般都是先用乙醇浸泡，然后對浸提液進(jìn)一步分離純化，而浸泡后的牛蒡根往往被丟棄。因此，本實驗以乙醇浸泡后的牛蒡根為原料，對其水溶性多糖(water-soluble polysaccharides from root of Arctium lappa L. soaked by alcohol，WPRA)進(jìn)行提取，并對其抗氧化性和抑菌活性進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛蒡根由江蘇徐州市沛縣河口鎮(zhèn)提供。將鮮牛蒡根洗凈、切丁、晾干，再用80%工業(yè)酒精浸泡，浸提2次后，浸提液合并備用，浸泡后牛蒡根置于烘箱中50℃烘干，即得醇浸后牛蒡根丁，簡稱為原料，密封、備用。

1,1-二苯基-2-苦肼基自由基(DPPH) 美國Sigma 公司；VC、Tris、濃鹽酸、鄰苯三酚、營養(yǎng)瓊脂、98%硫酸、95%工業(yè)酒精、正丁醇、氯仿等試劑均為分析純；實驗菌種為大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌。

1.2 儀器與設(shè)備

HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司；DHG-101電熱鼓風(fēng)恒溫干燥箱 鄄城華魯電熱儀器有限公司；RE-5285A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；UV-2550紫外分光光度計 日本島津儀器公司；NEXUS-870型傅里葉紅外光譜儀 美國Nicolet公司。

1.3 方法

1.3.1 WPRA提取工藝

稱取2.0g原料，按照某料液比(g/mL)在某溫度條件下提取一定時間，真空抽濾，收集濾液；當(dāng)考察提取次數(shù)時，在相同條件下，將濾渣再提取1、2次，合并濾液。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將提取液濃縮，加入4倍體積的體積分?jǐn)?shù)95%的工業(yè)酒精，置于冰箱中過夜沉淀。次日，離心得粗WPRA。

采用Sevag法進(jìn)行脫蛋白處理，即將粗WPRA用適量蒸餾水溶解，加入多糖液體積1/5量的Sevag試劑(氯仿與正丁醇的體積比為4:1)，充分振蕩30min，靜置分層，重復(fù)多次。用紫外光譜檢測蛋白質(zhì)、核酸的脫除情況。然后，再用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將脫蛋白后多糖液濃縮，加入4倍體積的體積分?jǐn)?shù)95%的工業(yè)酒精，置于冰箱中過夜沉淀。次日離心，分別用丙酮、乙酸乙酯洗滌固體產(chǎn)物3次，干燥后即得純化WPRA。

1.3.2 多糖含量測定及提取率計算

以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，采用苯酚-硫酸法測定多糖含量[11]。參考文獻(xiàn)[11]制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程：A =1.5411C＋0.0378，r = 0.9996。其中A為吸光度，C為多糖質(zhì)量濃度/(mg/mL)。

多糖提取率按照式(1)計算：

1.3.3 單因素試驗

原料在75℃水浴中提取3h，提取1次，考察料液比(1:15、1:25、1:35、1:45、1:55)對WPRA提取率的影響；料液比為1:25，提取3h，提取1次，考察提取溫度(60、70、80、90、100℃)對WPRA提取率的影響；料液比為1:25，在80℃水浴中提取，提取1次，考察提取時間(1、2、3、4、5h)對WPRA提取率的影響。

1.3.4 正交試驗設(shè)計優(yōu)化WPRA提取工藝

以WPRA的提取率為考察指標(biāo)，在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，選用標(biāo)準(zhǔn)的L9(34)正交試驗表進(jìn)行正交試驗設(shè)計，從而優(yōu)化從醇浸后牛蒡根中提取水溶性多糖的工藝條件。

1.3.5 體外抗氧化活性的測定

1.3.5.1 清除DPPH自由基的測定[12]

以VC為標(biāo)準(zhǔn)對照物。在10mL具塞試管中加入2mL含1.00mg/mL DPPH的乙醇溶液，分別加入樣品液或VC溶液(質(zhì)量濃度為1mg/mL)0、10、20、50、100、200、400、800、1000μL，用蒸餾水定容至5mL，搖勻。置于37℃水浴鍋中，避光反應(yīng)20min后立即測定514nm波長處吸光度。以50%乙醇為參比，空白對照以50%乙醇代替樣品。計算WPRA及VC對DPPH自由基的清除率見式(2)。

式中：A0為空白對照吸光度；Ai為加樣品液后的吸光度；Aj為樣品液本底的吸光度。

1.3.5.2 清除超氧陰離子自由基(O2－?)活性的測定

采用鄰苯三酚自氧化法[13-14]，以VC為標(biāo)準(zhǔn)對照物。在10mL具塞試管中，加入50mmol/L pH8.2的Tris-HCl緩沖液4.5mL，再加入2mL不同質(zhì)量濃度的樣品液或VC溶液。搖勻后在25℃水浴鍋中預(yù)熱20min，再加入經(jīng)25℃水浴鍋預(yù)熱的鄰苯三酚-鹽酸溶液(3mmol/L)1mL，混勻后，于25℃水浴中反應(yīng)4min，時間要準(zhǔn)確。最后加入1mL 10mmol/L的HCl溶液終止反應(yīng)。以Tris-HCl緩沖液為參比，空白對照以蒸餾水代替樣品。測定325nm波長處的吸光度，計算WPRA及VC對O2－?的清除率，見式(3)。

式中：A0為空白對照吸光度；Ai為加樣品溶液后的吸光度；Aj為樣品液本底的吸光度。

1.3.6 抑菌活性實驗

取34g營養(yǎng)瓊脂，加1L蒸餾水，溶解后置于高壓滅菌鍋內(nèi)，120℃滅菌30min。冷卻至50～60℃制成平板，取0.1mL活化菌液(含菌數(shù)約為108/mL)，在平板上涂抹均勻，等距離均勻、垂直放置5個牛津杯。在牛津杯中加入0.1mL樣品液(質(zhì)量濃度分別為5、2.5、1.25mg/mL和0.625mg/mL)，蓋好平皿，置于37℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h[15]。取出后，測量每個牛津杯周圍所產(chǎn)生的透明抑菌圈直徑(mm)。

2 結(jié)果與分析

2.1 WPRA提取的單因素試驗

2.1.1 料液比對WPRA提取率的影響

從圖1可以看出，隨著料液比的減小，多糖提取率迅速增加，料液比為1:25時達(dá)到最大值，再減小料液比，提取率又緩慢降低并趨于平穩(wěn)，說明料液比在1:25左右時，有利于提取WPRA。

圖1 料液比對WPRA提取率的影響Fig.1 Effect of solid/solvent ratio on the extraction yield of watersoluble polysaccharides

2.1.2 提取溫度對WPRA提取率的影響

圖2 2 提取溫度對WPRA提取率的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on the extraction yield of watersoluble polysaccharides

從圖2可以看出，隨著提取溫度的升高，多糖提取率先迅速增加，后快速減少，在80℃時提取效果最好，說明提取溫度在80℃左右時，WPRA的提取效果最好。

2.1.3 提取時間對WPRA提取率的影響

圖3 提取時間對WPRA提取率的影響Fig.3 Effect of extraction time on the extraction yield of water-soluble polysaccharides

從圖3可以看出，隨著提取時間的延長，多糖提取率先迅速增加，提取2h時提取率最高，再延長時間，提取率反而降低，說明提取時間為2h左右時，有利于WPRA的提取。

2.2 正交試驗優(yōu)化

參考多糖提取的相關(guān)文獻(xiàn)[16-17]發(fā)現(xiàn)，在提取次數(shù)的水平設(shè)計時，一般都是選擇1、2、3次，因為大部分情況下，當(dāng)提取次數(shù)超過3次時，多糖的提取率增加的幅度很小，甚至有下降的趨勢，所以本實驗在正交試驗中提取次數(shù)的水平選為1、2、3次。試驗設(shè)計及結(jié)果見表1，方差分析見表2。

表1 提取WPRA的正交試驗設(shè)計及結(jié)果Tabbllee 11 Orthogonal array design and results for the optimization of polysaccharide extraction

表2 正交試驗結(jié)果的方差分析表Table2 Analysis of variance for the experimental results of orthogonal array design

由表2可知，在實驗研究范圍內(nèi)，提取時間、提取溫度、料液比和提取次數(shù)對醇浸牛蒡根中水溶性多糖的提取率均沒有顯著性影響。由表1可知，各因素對WPRA提取率影響的大小次序為A＞B＞D＞C，提取WPRA的最佳工藝參數(shù)為A3B3C2D2，即料液比1:25、在85℃水浴中提取2.5 h、提取2次。在最佳工藝條件下進(jìn)行提取WPRA的驗證實驗，3組平行，提取率分別為8.41%、8.61%和8.27%，平均提取率為8.43%。說明該工藝穩(wěn)定性和重復(fù)性良好。

2.3 WPRA脫蛋白前、后紫外光譜表征

圖4 WPRA的紫外吸收光譜圖Fig.4 UV-vis spectra of crude and deprotenized polysaccharides

從圖4可以看出，粗WPRA在250～350nm波長范圍內(nèi)有一個明顯的吸收帶，而脫蛋白之后，該吸收帶明顯減弱，說明用Sevag法可以去除粗產(chǎn)物中部分的蛋白質(zhì)與核酸。但是，該處弱吸收帶的存在說明經(jīng)過脫蛋白處理后的WPRA中仍然含有多肽鍵的蛋白質(zhì)或多肽，而且處理6次與12次相比，吸收帶強度變化很小，推測用該工藝提取的多糖很可能是多糖復(fù)合物，即多糖與多肽或蛋白質(zhì)以共價鍵結(jié)合的形式存在，其具體組成有待進(jìn)一步研究。

2.4 WPRA的紅外光譜表征

紅外光譜采用KBr壓片法：WPRA與KBr按照1:100(m/m)比例混合研磨，測量其在450～4000cm-1波數(shù)范圍內(nèi)的譜圖，結(jié)果見圖5。從圖5可以看出，WPRA具有一般多糖的特征吸收峰(3362、2928、2878、1632、1575、1451、1330、1219、1141、1026、984、938、874、818、648、597cm-1和464cm-1)。其中，3362cm-1附近強寬譜帶可能是締合羥基O—H的伸縮振動引起的；2928、2878cm-1處的峰為C—H非對稱伸縮振動產(chǎn)生的，1451cm-1峰是C—H變形振動引起的[18]；1632cm-1峰為仲酰胺羰基C—O伸縮振動峰，597cm-1的峰為仲酰胺羰基面外彎曲振動峰，1575cm-1附近的強峰是仲酰胺C—N—H彎曲振動引起的，1330cm-1處的峰為仲酰胺C—N伸縮振動與N—H彎曲振動的混合峰[19]，上述分析說明該多糖中含有大量的酰胺鍵，且為仲酰胺，從而確定其含有多肽或蛋白質(zhì)。在1026cm-1附近的強寬吸收帶可歸屬為糖環(huán)骨架振動和羥基振動，由于雜合了糖環(huán)上C—O—C醚鍵的C—O伸縮振動，使吸收峰變寬，該處吸收譜帶是糖類的特征吸收峰[18]；938cm-1處的峰是呋喃糖環(huán)的對稱伸縮振動引起的，874cm-1和818cm-1的峰歸屬為呋喃糖分子中—CH2的橫向振動和C—H鍵的變角振動[1]。綜上分析可知，本實驗提取的WPRA為呋喃型多糖，結(jié)合紫外光譜可以判斷該多糖可能是以共價鍵與多肽或蛋白質(zhì)連接的糖復(fù)合物。

圖5 WPRA的紅外光譜圖Fig.5 Infrared spectra of crude and deprotenized polysaccharides

2.5 抗氧化活性

2.5.1 WPRA對DPPH自由基的清除作用

由圖6可知，在實驗研究范圍內(nèi)，清除率與樣品質(zhì)量濃度之間存在一定的量效關(guān)系(實驗過程中為了方便操作，采取量取不同體積相同質(zhì)量濃度的樣品，然后再通過定容來達(dá)到最終不同樣品質(zhì)量濃度的目的。所以實際上，仍然是質(zhì)量濃度對清除率的關(guān)系)。WPRA清除DPPH自由基的EC50=394μg/mL，而VC的EC50=4μg/mL，說明WPRA清除DPPH自由基的能力不如VC，其EC50約為VC的1%。

圖6 WPRA和VC對DPPH自由基的清除作用Fig.6 Scavenging capacity of WPRA and VC to DPPH radical

2.5.2 WPRA對O2－?的清除作用

圖7 WPRA和VCC對OO2??的清除作用Fig.7 Scavenging capacity of WPRA and VC to superoxide anion radical

由圖7可知，隨著VC質(zhì)量濃度的增加，清除O2－?的能力增強，其EC50=70μg/mL。而隨著WPRA質(zhì)量濃度的增加，清除O2－?的能力先增強，當(dāng)其質(zhì)量濃度為0.05mg/mL時清除率達(dá)到最大，為23.18%；再增加質(zhì)量濃度，清除率又迅速下降，說明醇浸后牛蒡中的多糖可以清除O2－?，但是清除能力很弱，而且遠(yuǎn)弱于VC。

2.6 抑菌活性實驗

抑菌實驗發(fā)現(xiàn)，在牛津杯外徑處幾乎沒有透明抑菌圈產(chǎn)生，說明醇浸后牛蒡根中提取出來的水溶性多糖對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌幾乎沒有抑制作用。

3 結(jié) 論

通過單因素和正交試驗確定了從醇浸牛蒡根中提取水溶性多糖的最佳工藝條件，即料液比1:25、在85℃水浴中提取2.5h、提取2次，提取率為8.43%。產(chǎn)品經(jīng)紫外、紅外光譜表征，證明為含有肽鍵的糖復(fù)合物。

生物活性實驗表明WPRA對DPPH自由基具有一定的清除作用，對清除能力很弱，對3種受試菌株沒有表現(xiàn)出抑制作用。分析原因，可能是80%酒精浸泡牛蒡根的時候，把大部分醇溶性多糖、多酚、黃酮類化合物等活性成分萃取出來；同時證明，醇浸后牛蒡根中的水溶性多糖的抗氧化活性及抑菌活性較差。

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Extraction and Bioactivities of Water-Soluble Polysaccharides from Ethanol-Soaked Roots of Burdock (Arctium lappa L.)

XU Rui-bo，GAO Ying-ying，ZHOU Sheng-xiang，ZHAN Yong-cheng，HU Xi-lan
(School of Chemical Engineering, Huaihai Institute of Technology, Lianyungang 222005, China)

After having been soaked in 80% ethanol, burdock roots were used for the extraction of water-soluble polysaccharides by water extraction and ethanol precipitation. The optimal extraction conditions, as established by one-factor-at-a-time and orthogonal array designs, were 1:25 (g/mL), 2.5 h and 85 ℃ for solid/solvent ratio, time and temperature, respectively, and the extraction was repeated twice. Under the optimized conditions, the yield of water-soluble polysaccharides from burdock roots was 8.43%. The crude polysaccharides were deproteinized by Sevag’s method and characterized by UV and infrared spectroscopy. The purified products might be polysaccharides bound with peptide bonds. In vitro antioxidant assays suggested that the polysaccharides had marked DPPH free radical scavenging activity, but weak superoxide anion radical scavenging activity. In addition, they had no inhibitory effects on E. coli, S.aureus or B.subtilis.

ethanol-soaked roots of burdock (Arctium lappa L.)；water-soluble polysaccharides；extraction；antioxidant activity；antibacterial effect

R284.2

A

1002-6630(2013)18-0082-05

10.7506/spkx1002-6630-201318017

2012-09-25

連云港市科技攻關(guān)項目(CG1132)；淮海工學(xué)院博士科研啟動項目(KQ10130)

許瑞波(1972—)，女，副教授，博士，研究方向為天然產(chǎn)物提取及配位化學(xué)。E-mail：xuruibo9125@163.com