劉婷婷，姚 佳，張飛俊，王大為*

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118)

響應(yīng)面優(yōu)化海藻酸鈉回收馬鈴薯淀粉生產(chǎn)廢水中蛋白質(zhì)的工藝

劉婷婷，姚 佳，張飛俊，王大為*

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118)

采用海藻酸鈉作為絮凝劑回收馬鈴薯淀粉廢水中的蛋白質(zhì)，并對(duì)其氨基酸組成進(jìn)行分析。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與響應(yīng)面分析方法，選取海藻酸鈉添加量、pH值、絮凝溫度、攪拌時(shí)間4個(gè)因素，以馬鈴薯蛋白質(zhì)回收率作為響應(yīng)值，優(yōu)化海藻酸鈉回收馬鈴薯淀粉廢水中蛋白質(zhì)的工藝參數(shù)。結(jié)果表明：海藻酸鈉回收馬鈴薯蛋白質(zhì)的最佳工藝參數(shù)為海藻酸鈉添加量0.97g/L、絮凝溫度35℃、攪拌時(shí)間35min、pH3.6，此條件下馬鈴薯蛋白質(zhì)回收率為70.93%；氨基酸分析結(jié)果表明：回收的馬鈴薯蛋白質(zhì)總氨基酸含量為69.43%，其中必需氨基酸含量為28.00%，占總氨基酸含量的40.33%，色氨酸為第一限制性氨基酸。

海藻酸鈉；馬鈴薯淀粉；廢水；蛋白質(zhì)

馬鈴薯是世界上僅次于小麥、水稻和玉米的第4大糧食作物，我國(guó)馬鈴薯種植面積已達(dá)到670萬(wàn)公頃，約占世界總面積的25%，成為馬鈴薯生產(chǎn)第一大國(guó)[1-2]。我國(guó)馬鈴薯加工制品主要是淀粉類產(chǎn)品，加工過(guò)程中首先要分離出馬鈴薯淀粉，平均每生產(chǎn)1t馬鈴薯淀粉，需排放5t左右生產(chǎn)廢水，廢水中主要的成分是蛋白質(zhì)，直接排放不但會(huì)造成資源浪費(fèi)，還會(huì)帶來(lái)環(huán)境污染問(wèn)題[3-5]。馬鈴薯蛋白質(zhì)是一種全價(jià)蛋白，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值優(yōu)于大多數(shù)植物蛋白質(zhì)，與牛奶蛋白和雞蛋蛋白相當(dāng)，功效比值(protein efficiency ratio，PER)達(dá)到2.3[6-7]，馬鈴薯蛋白質(zhì)中2/3為球蛋白[8]，其氨基酸組成均衡，含有人體所需的8種必需氨基酸[9]，特別是賴氨酸含量較高，可以彌補(bǔ)谷物蛋白賴氨酸的缺乏。因此，回收馬鈴薯淀粉生產(chǎn)廢水中的蛋白質(zhì)，使其變廢為寶，不僅可以解決馬鈴薯淀粉生產(chǎn)廢水直接排放的污染問(wèn)題，還可提高馬鈴薯的附加值，減少食物資源的浪費(fèi)。

回收馬鈴薯淀粉生產(chǎn)廢水中蛋白質(zhì)的方法有泡沫分離法、膜分離法、加熱絮凝法、絮凝劑法以及綜合處理法等[10-13]。但利用海藻酸鈉作為絮凝劑回收馬鈴薯淀粉生產(chǎn)廢水中蛋白質(zhì)的研究少見報(bào)道。海藻酸鈉是一種天然高分子化合物類型的絮凝劑，其來(lái)源廣泛，價(jià)格低廉，無(wú)毒無(wú)害，可供食用[14-16]。本研究以海藻酸鈉作為絮凝劑回收廢水中蛋白質(zhì)，采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與響應(yīng)面分析方法優(yōu)化海藻酸鈉回收馬鈴薯蛋白質(zhì)的工藝參數(shù)，為馬鈴薯淀粉廢水的處理及其蛋白的回收利用提供科學(xué)依據(jù)與參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮馬鈴薯 市售。

海藻酸鈉(食品級(jí)) 青島明月海藻集團(tuán)有限公司；牛血清蛋白(分析純)、三羥基甲基氨基甲烷(分析純)、甘氨酸(分析純) 上?；菔郎噭┯邢薰?；考馬斯亮藍(lán)R-250(分析純) 北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司；硫酸、硫酸銅、三羥基甲基氨基甲烷、過(guò)硫酸銨、β-巰基乙醇等均為市售分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

MJ-60BE01B型組織搗碎機(jī) 美的生活電器有限公司；GB1302電子精密天平、SPN402F電子天平 梅特勒-托利多儀器有限公司；CT15RT型高速冷凍離心機(jī)上海天美科學(xué)儀器有限公司；IT-09A-5恒溫磁力攪拌器上海一恒科技有限公司；PHS-3BW型電腦數(shù)顯酸度計(jì)上海理達(dá)儀器廠；TV-1901紫外-可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；L-8800全自動(dòng)氨基酸分析儀 日本Hitachi公司。

1.3 方法

1.3.1 模擬馬鈴薯淀粉生產(chǎn)廢水的制備

將馬鈴薯洗凈，切塊，按馬鈴薯與水2∶1(質(zhì)量比)的比例加水，同時(shí)加入NaHSO3(0.1g/kg)，在組織搗碎機(jī)中搗碎成漿，靜置15min后，用濾袋過(guò)濾，除去馬鈴薯渣，濾液在4000r/min轉(zhuǎn)速離心10min，上清液即為模擬馬鈴薯生產(chǎn)淀粉廢水[17]。

1.3.2 海藻酸鈉回收馬鈴薯淀粉廢水中蛋白質(zhì)

準(zhǔn)確量取100mL馬鈴薯淀粉廢水于250mL的燒杯中，加入海藻酸鈉并調(diào)節(jié)pH值，用磁力攪拌器以300r/min的速度攪拌一定時(shí)間后，在4500r/min轉(zhuǎn)速離心15min，離心沉淀所得即回收的馬鈴薯蛋白質(zhì)。

1.3.3 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

廢水中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定：采用雙縮脲法[18]測(cè)定；回收馬鈴薯蛋白質(zhì)含量的測(cè)定：采用GB/T 5009.5—2003《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》方法測(cè)定。

1.3.4 馬鈴薯蛋白質(zhì)回收率計(jì)算

式中：m1為馬鈴薯淀粉生產(chǎn)廢水中蛋白質(zhì)質(zhì)量/g；m2為回收馬鈴薯蛋白質(zhì)后廢水中蛋白質(zhì)質(zhì)量/g。

1.3.5 單因素試驗(yàn)

1.3.5.1 海藻酸鈉添加量對(duì)馬鈴薯蛋白質(zhì)回收率的影響

以馬鈴薯蛋白質(zhì)回收率作為考核指標(biāo)，在絮凝溫度35℃、攪拌時(shí)間30min、pH3.5的條件下，研究海藻酸鈉添加量0.3、0.5、0.7、0.9、1.1g/L對(duì)馬鈴薯蛋白質(zhì)回收率的影響。

1.3.5.2 絮凝溫度對(duì)馬鈴薯蛋白質(zhì)回收率的影響

以馬鈴薯蛋白質(zhì)回收率作為考核指標(biāo)，在海藻酸鈉添加量0.9g/L、攪拌時(shí)間30min、pH3.5的條件下，研究絮凝溫度25、30、35、40、45、50℃對(duì)馬鈴薯蛋白質(zhì)回收率的影響。

1.3.5.3 攪拌時(shí)間對(duì)馬鈴薯蛋白質(zhì)回收率的影響

以馬鈴薯蛋白質(zhì)回收率作為考核指標(biāo)，在海藻酸鈉添加量0.9g/L、絮凝溫度35℃、pH3.5的條件下，研究攪拌時(shí)間10、20、30、40、50min對(duì)馬鈴薯蛋白質(zhì)回收率的影響。

1.3.5.4 pH值對(duì)馬鈴薯蛋白質(zhì)回收率的影響

以馬鈴薯蛋白質(zhì)回收率作為考核指標(biāo)，在海藻酸鈉添加量0.9g/L、絮凝溫度35℃、攪拌時(shí)間30min的條件下，研究pH2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0對(duì)馬鈴薯蛋白質(zhì)回收率的影響。

1.3.6 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素的基礎(chǔ)上，以海藻酸鈉添加量、絮凝溫度、攪拌時(shí)間、pH值為試驗(yàn)因素，以馬鈴薯蛋白質(zhì)回收率為響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。采用Design Expert 8.0.6統(tǒng)計(jì)軟件，進(jìn)行Box-Behnken設(shè)計(jì)及響應(yīng)面分析試驗(yàn)。試驗(yàn)因素水平見表1。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)因素及水平表Table1 Factors and levels used in Box-Behnken design

1.3.7 SDS-PAGE測(cè)定回收馬鈴薯蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量

采用SDS-PAGE法[18]對(duì)馬鈴薯蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量進(jìn)行測(cè)定，配制15%分離膠和5%濃縮膠，采用穩(wěn)定電壓操作，濃縮膠電壓80V，分離膠電壓120V。電泳結(jié)束后，采用考馬斯亮藍(lán)R-250對(duì)其染色。以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)繪制相對(duì)遷移率的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算出回收馬鈴薯蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量。

1.3.8 回收馬鈴薯蛋白質(zhì)的氨基酸組分分析

16種氨基酸測(cè)定：按照GB/T 5009.124—2003《食品中氨基酸的測(cè)定》方法測(cè)定；色氨酸含量測(cè)定：按照GB/T 7650—1987《谷物不溶性膳食纖維測(cè)定》方法測(cè)定。

4.5 嚴(yán)格無(wú)菌操作 神經(jīng)移位手術(shù)無(wú)菌技術(shù)的要求比一般手術(shù)更為嚴(yán)格。因?yàn)橐话憬M織比神經(jīng)組織對(duì)感染的防御能力強(qiáng)［3］。一旦手術(shù)感染，將對(duì)患者帶來(lái)嚴(yán)重后果。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 海藻酸鈉添加量對(duì)馬鈴薯蛋白質(zhì)回收率的影響

圖1 海藻酸鈉添加量對(duì)馬鈴薯蛋白質(zhì)回收率的影響Fig.1 Effect of sodium alginate concentration on the recovery rate of protein

由圖1可知，隨著海藻酸鈉添加量的增加，馬鈴薯蛋白質(zhì)回收率逐漸增大，當(dāng)海藻酸鈉添加量為0.9g/L時(shí)，其回收率達(dá)到最大值，當(dāng)海藻酸鈉添加量繼續(xù)增加時(shí)，其回收率有所下降。絮凝效果一般隨絮凝劑的添加量增加而增強(qiáng)，海藻酸鈉與蛋白質(zhì)產(chǎn)生相互作用，使蛋白質(zhì)沉淀下來(lái)，提高了蛋白質(zhì)的回收率，但絮凝劑添加過(guò)量時(shí)，會(huì)使已經(jīng)形成的絮體重新變成穩(wěn)定的膠體[16]，影響絮凝效果。因此，海藻酸鈉添加量以0.9g/L為宜。

2.1.2 絮凝溫度對(duì)馬鈴薯蛋白質(zhì)回收率的影響

圖2 絮凝溫度對(duì)馬鈴薯蛋白質(zhì)回收率的影響Fig.2 Effect of flocculation temperature on the recovery rate of protein

由圖2可知，隨著絮凝溫度的升高，馬鈴薯蛋白質(zhì)回收率達(dá)到最高值后開始下降。溫度為35℃時(shí)，其回收率達(dá)到最大值。絮凝溫度過(guò)低或過(guò)高都會(huì)影響回收效果，當(dāng)絮凝溫度過(guò)低時(shí)，絮凝體的黏度下降，破壞海藻酸鈉已經(jīng)形成的膠團(tuán)，增加了水體對(duì)絮凝體的剪切作用，使絮凝體變得細(xì)小，不容易分離。絮凝的溫度過(guò)高時(shí)，雖然可以加快化學(xué)反應(yīng)速度，但也會(huì)形成細(xì)小的絮凝體，影響分離效果。因此，絮凝溫度以35℃為宜。

2.1.3 攪拌時(shí)間對(duì)馬鈴薯蛋白質(zhì)回收率的影響

圖3 攪拌時(shí)間對(duì)馬鈴薯蛋白質(zhì)回收率的影響Fig.3 Effect of stirring time on the recovery rate of protein

2.1.4 pH值對(duì)馬鈴薯蛋白質(zhì)回收率的影響

圖4 pH值對(duì)馬鈴薯蛋白質(zhì)回收率的影響Fig.4 Effect of pH on the recovery rate of protein

由圖4可知，pH值對(duì)馬鈴薯蛋白質(zhì)回收率有較為顯著的影響。隨著pH值的增大，廢水的黏度不斷增大[19]，廢水中蛋白質(zhì)所帶電荷的性質(zhì)和數(shù)量發(fā)生改變，使海藻酸鈉與蛋白質(zhì)之間發(fā)生相互作用[20]，馬鈴薯蛋白質(zhì)回收率迅速增大。但pH值繼續(xù)增大時(shí)，其回收率反而下降。當(dāng)pH值為3.5時(shí)，絮凝效果較好，絮凝作用完全。選擇合適的pH值，不但影響絮凝效果，而且可節(jié)省大量的絮凝劑，從而降低了成本。因此，以pH3.5為宜。

2.2 響應(yīng)面分析

2.2.1 模型的建立及顯著性檢驗(yàn)

Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見表2，利用Design Expert 8.0.6軟件對(duì)表2試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，得到馬鈴薯蛋白質(zhì)回收率(Y)對(duì)海藻酸鈉添加量(A)、絮凝溫度(B)、絮凝時(shí)間(C)、pH值(D)4個(gè)因素的二次多項(xiàng)式回歸模型為：

Y=69.00＋5.49A-1.86B＋5.06C＋2.40D＋1.52AB-3.11AC-1.09AD＋1.80BC＋1.13BD＋1.56CD-5.35A2-7.19B2-4.76C2-5.60D2

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table2 Box-Behnken design and results

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)方差分析Table3 Analysis of variance for the fitted response surface model

由表3可以看出，模型P=0.0001＜0.01，表明回歸模型達(dá)到顯著水平，失擬項(xiàng)P=0.0863＞0.05，表明模型失擬項(xiàng)不顯著。模型的R2=98.89%，表明該模型與實(shí)際擬合較好，可以用此模型來(lái)分析和預(yù)測(cè)海藻酸鈉絮凝馬鈴薯淀粉廢水中蛋白質(zhì)工藝參數(shù)。方差分析結(jié)果顯示，A、B、C、D、AC、BC、A2、B2、C2、D2達(dá)到極顯著水平，AB、CD達(dá)到顯著水平，各因素對(duì)馬鈴薯蛋白質(zhì)回收率的影響次序?yàn)椋汉Ｔ逅徕c添加量＞攪拌時(shí)間＞pH值＞絮凝溫度。

2.2.2 各因素的交互作用對(duì)馬鈴薯蛋白質(zhì)回收率的影響

根據(jù)回歸方程繪出響應(yīng)面及等高線圖，如圖5所示?？梢灾庇^的看出各因素及其交互作用對(duì)馬鈴薯蛋白質(zhì)回收率的影響。等高線的形狀可反映出交互效應(yīng)的強(qiáng)弱。橢圓形表示兩因素交互作用顯著，而圓形則與之相反。

圖5 兩因素交互作用的響應(yīng)曲面及等高線圖Fig.5 Response surface and contour plots showing the interaction effects of process parameters on the recovery rate of protein

通過(guò)Design Expert軟件分析得到，利用海藻酸鈉作為絮凝劑回收馬鈴薯蛋白質(zhì)的最佳工藝參數(shù)為海藻酸鈉添加量0.97g/L、絮凝溫度34.91℃、攪拌時(shí)間34.52min、pH3.62，此時(shí)馬鈴薯蛋白質(zhì)回收率為71.42%?？紤]到實(shí)際生產(chǎn)及可操作性，將最優(yōu)工藝參數(shù)定為：海藻酸鈉添加量0.97g/L、絮凝溫度35℃、攪拌時(shí)間35min、pH3.6。

2.2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

為了驗(yàn)證預(yù)測(cè)結(jié)果，按優(yōu)化工藝參數(shù)進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)，重復(fù)3次，測(cè)定結(jié)果取平均值，得到馬鈴薯蛋白質(zhì)回收率為70.93%，與預(yù)測(cè)值基本相符，表明響應(yīng)面法得到的絮凝工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠，具有實(shí)用價(jià)值。與鹽溶酸沉法[3]、酸熱法[21]、堿提酸沉法[17]等方法相比，本研究方法回收馬鈴薯蛋白質(zhì)收率較為理想。

2.2.4 回收馬鈴薯蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定結(jié)果

由圖6標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的遷移距離，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的相對(duì)遷移率Rf，繪制標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)相對(duì)遷移率Rf與其分子質(zhì)量對(duì)數(shù)lg(Mw)的關(guān)系，即標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程為：y=-1.6867x＋2.143，R2=0.9817。由圖6可以看出，1泳道中出現(xiàn)6條主帶，計(jì)算出馬鈴薯蛋白質(zhì)分子質(zhì)量分別為42.66、38.43、23.08、22.02、18.55、16.48kD。除6條主帶外，還有分子質(zhì)量在76.91、66.01、57.99、9.94kD的淺帶。

圖6 馬鈴薯蛋白質(zhì)SDS-PAGE電泳圖譜Fig.6 SDS-PAGE of the recovered protein

2.2.5 回收馬鈴薯蛋白質(zhì)氨基酸組成

圖7 馬鈴薯蛋白質(zhì)16種氨基酸圖譜Fig.7 Chromatogram of sixteen amino acids in the recovered protein

圖8 色氨酸標(biāo)準(zhǔn)圖譜及馬鈴薯蛋白質(zhì)圖譜Fig.8 Chromatograms of tryptophan standard and the recovered protein

由圖7、8和表4可知，采用海藻酸鈉回收馬鈴薯淀粉廢水中蛋白質(zhì)的含量為72.08%。馬鈴薯蛋白質(zhì)中分離出17種氨基酸，其必需氨基酸含量為28.00%，非必需氨基酸含量為41.43%，其中，必需氨基酸中色氨酸含量較低，色氨酸為馬鈴薯蛋白粉的第一限制性氨基酸。馬鈴薯蛋白質(zhì)必需氨基酸含量占總氨基酸含量的40.33%，必需氨基酸與非必需氨基酸含量的比值為0.68，其分別高于WHO/FAO標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的40%和0.6，大豆蛋白38.5%和0.56[21]，除此之外，馬鈴薯蛋白質(zhì)還含有較高的賴氨酸，賴氨酸是谷物蛋白質(zhì)第一限制性氨基酸，馬鈴薯蛋白可彌補(bǔ)谷物蛋白的缺陷。

表4 馬鈴薯蛋白質(zhì)氨基酸組分Table4 Amino acid composition of the recovered protein

3 結(jié) 論

采用Box-Behnken設(shè)計(jì)，建立海藻酸鈉回收馬鈴薯蛋白質(zhì)工藝參數(shù)的二次多項(xiàng)式數(shù)學(xué)模型，經(jīng)檢驗(yàn)該模型是合理的，能夠較好的預(yù)測(cè)馬鈴薯蛋白質(zhì)的回收率。在利用海藻酸鈉回收馬鈴薯蛋白質(zhì)的過(guò)程中，各因素對(duì)馬鈴薯蛋白質(zhì)回收率影響主次順序依次為海藻酸鈉添加量＞攪拌時(shí)間＞pH值＞絮凝溫度，所得最佳工藝參數(shù)為海藻酸鈉添加量0.97g/L、絮凝溫度35℃、攪拌時(shí)間35min、pH3.6，馬鈴薯蛋白質(zhì)回收率為70.93%。利用氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定海藻酸鈉回收馬鈴薯蛋白質(zhì)的氨基酸組分，實(shí)驗(yàn)證明，回收的馬鈴薯蛋白質(zhì)總氨基酸含量為69.43%，必需氨基酸含量為28.00%，占總氨基酸含量的40.33%，優(yōu)于大豆蛋白，其第一限制性氨基酸為色氨酸，此外，馬鈴薯蛋白質(zhì)賴氨酸含量較高，可以彌補(bǔ)谷物蛋白賴氨酸缺乏。

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Application of Response Surface Methodology to Optimize Extraction of Protein from Potato Starch Wastewater by Sodium Alginate

LIU Ting-ting，YAO Jia，ZHANG Fei-jun，WANG Da-wei*
(College of Food Science and Engineering, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China)

Sodium alginate was used as a natural polymer flocculant to recover protein from potato starch wastewater. In addition, the amino acid composition of the recovered protein was analyzed. Box-Behnken design coupled with response surface analysis was used to optimize four variables for recovering protein including sodium alginate dosage, pH, temperature and stirring time. The optimal process conditions of the variables were found to be stirring with 0.97 g/L sodium alginate at pH 3.6 for 35 min at 35 ℃, resulting in a protein recovery of 70.93%. The total amino acid content of the recovered protein was 69.43% and the ratio of essential amino acids to total amino acids was 40.33%. Tryptophane was the first limiting amino acid.

sodium alginate；potato starch；wastewater；protein

X703

A

1002-6630(2013)18-0075-07

10.7506/spkx1002-6630-201318016

2013-04-01

長(zhǎng)春市科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(長(zhǎng)科技合2011191)；吉林省科技成果轉(zhuǎn)化補(bǔ)助項(xiàng)目(20115016)

劉婷婷(1984—)，女，講師，博士，研究方向?yàn)榧Z食、油脂與植物蛋白工程。E-mail：ltt1984@163.com

*通信作者：王大為(1960—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)榧Z食、油脂與植物蛋白工程及功能食品。E-mail：xcpyfzx@163.com