姚先超，張雪紅，梁玉石，周 紅，林翠梧,*

(1.廣西大學化學化工學院，廣西 南寧 530004；2.廣西民族大學化學化工學院，廣西 南寧 530006；3.廣西民族大學設(shè)備實驗管理處，廣西 南寧 530006)

響應面分析法優(yōu)化微波輔助提取劍麻果膠的工藝

姚先超1,2，張雪紅1，梁玉石3，周 紅1，林翠梧1,*

(1.廣西大學化學化工學院，廣西 南寧 530004；2.廣西民族大學化學化工學院，廣西 南寧 530006；3.廣西民族大學設(shè)備實驗管理處，廣西 南寧 530006)

以劍麻纖維生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的廢渣為原料，采用微波輔助技術(shù)從中提取果膠。首先通過單因素試驗考察選取影響因素和相關(guān)水平，然后采用三因素三水平的響應面法分析設(shè)計優(yōu)化微波功率、提取時間、溶液pH值等因素的組合試驗，對果膠提取條件進行優(yōu)化和顯著性分析，依據(jù)回歸分析確定最佳提取工藝條件為微波功率534W、提取時間9.8min、pH1.3，在此工藝條件下，劍麻果膠的提取率為6.10%，其半乳糖醛酸含量和酯化度分別為75.3%和72.09%。

響應面分析法；劍麻；果膠；微波；提取

劍麻(Agave sisalana Perrine)又名鳳尾蘭、千手蘭、菠蘿麻等，為龍舌蘭科植物，原產(chǎn)于墨西哥尤卡坦半島[1]，其劍狀單葉經(jīng)壓碾破碎后主要用于加工生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)纖維[2]?，F(xiàn)在巴西、坦桑尼亞等國及其他熱帶、亞熱帶地區(qū)均有廣大分布和種植生產(chǎn)[3]。中國是世界第二大劍麻主產(chǎn)國，產(chǎn)量僅次于巴西；主要分布在海南、廣西、廣東、福建等省份[4]。在傳統(tǒng)中醫(yī)藥草中，劍麻是一種非常有用的中草藥植物，具有涼血止血、消腫止痛之功效，能夠用于治療肺癆咯血、痢疾以及癰瘡腫毒等傷病[5]。由于纖維僅占劍麻質(zhì)量的5%左右，其余部分在纖維生產(chǎn)中一般作為廢葉廢渣被丟棄[6]，致使大量資源浪費。因此，研究如何更好地開發(fā)利用劍麻廢液廢渣變得尤為重要。

劍麻葉肉及其汁液中含有大量的天然成分如葉綠素、皂苷、氨基酸及果膠，其中皂素等成分已知具有藥效作用[7]。從生產(chǎn)劍麻形成的廢液中提取重要的甾體激素藥物原料劍麻皂素[8]，是目前對劍麻廢液再利用最成功的例子，而關(guān)于其果膠多糖的研究則較少。果膠是一種應用廣泛的食品添加劑；劍麻果膠作為天然多糖碳水合物，在動物急性毒性實驗中未發(fā)現(xiàn)其具有毒性，相關(guān)指標符合國家食品添加劑標準，是一種有潛力的食用果膠資源[9]。

響應面優(yōu)化法由數(shù)學分析方法和統(tǒng)計分析學方法組成，主要用于考察研究影響因素自變量及其相互之間的交互作用對變化過程因變量的影響，能夠反映因素自變量和響應因變量之間的關(guān)系。響應面優(yōu)化法是一種優(yōu)化工藝過程條件的有效方法，已經(jīng)廣泛應用于化學工藝、生物工程、食品工業(yè)以及冶金等領(lǐng)域[10-12]。目前關(guān)于應用響應面優(yōu)化微波提取劍麻果膠(A. sisalana pectic，ASP)的工藝研究還未見報道，本實驗引入響應面法和微波輔助法以探討快速高效提取劍麻果膠，以期今后工業(yè)化生產(chǎn)尋找理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

劍麻廢渣由廣西劍麻集團有限公司提供，干渣經(jīng)粉碎后其粒度應低于100目。

濃鹽酸、無水乙醇均為國產(chǎn)分析純試劑；半乳糖醛酸和果膠標準品 美國Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

微波超聲波組合萃取儀 北京祥鵠公司；冷凍真空干燥器 北京博醫(yī)康儀器公司；AL204電子天平 梅特勒托利多儀器公司；RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化公司；低速臺式大容量離心機 上海安亭科學儀器廠；紫外-可見分光光度計 上海尤尼科儀器公司；FTIR紅外光譜儀 美國Thermo Nicolet公司。

1.3 方法

1.3.1 劍麻果膠提取工藝

定量稱取的劍麻渣粉末在常溫條件下復水20min，在200目的濾布中洗滌2次并擰干。濾渣在90℃以上的水中高溫滅酶10min，洗滌并擰干，反復3次。處理后的劍麻渣放入一定酸度的鹽酸溶液(即料液比1:25(g/mL)，麻渣浸入程度最佳)中，在恒定功率的微波輻射下，攪拌提取一段時間后，趁熱過濾，擠干，同樣條件反復提取3次。3次提取濾液匯集、冷卻、離心，所得清液在減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)系統(tǒng)中濃縮。在攪拌狀態(tài)下，將4倍體積的乙醇溶液加入冷卻后的濃縮液中，在4℃環(huán)境下醇沉靜置5h。然后，醇沉混合液以4700r/min的轉(zhuǎn)速離心10min，收集膠狀沉積物，以95%乙醇-0.1mol/L HCl(1:2，V/V)溶液溶解2次，每次都進行離心。最后，收集所得的沉積物在-45℃條件下真空冷凍干燥24h。稱質(zhì)量，按下式計算提取率：

1.3.2 單因素試驗

稱取10g劍麻渣粉末，在微波輻射作用下提取劍麻果膠，分別改變微波功率、pH值及時間等提取條件，考察這些因素對劍麻果膠提取率(Y，%)的總體影響趨勢。每組對應條件進行3次重復實驗，所得的果膠提取率取其平均值。

1.3.3 劍麻果膠提取工藝的響應面試驗設(shè)計

根據(jù)Box-Behnken組合試驗設(shè)計原理[13-14]，通過單因素試驗確定影響因素后，多因素三水平的設(shè)計方案可以在SAS軟件(Version 9.2，SAS Institute)完成。

1.3.4 劍麻果膠的紅外光譜

將適量的劍麻果膠與一定量的KBr混合研磨，壓片。采用Nicollet Nexus FTIR于4000～400cm-1波數(shù)范圍內(nèi)掃描64次，分辨率為4cm-1。

1.3.5 劍麻果膠的酯化度測定

劍麻果膠的酯化度測定參照文獻[15]的方法進行測定。1.3.6 劍麻果膠中半乳糖醛酸含量的測定

劍麻果膠中半乳糖醛酸含量通過硫酸咔唑比色法[16]進行測定，測定條件為濃硫酸用量6.0mL、水解溫度70℃、水解時間20min、0.15%咔唑無水乙醇溶液用量為0.5mL，在室溫條件下暗處顯色，顯色時間為30min，在530nm波長處測定其吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 pH值對提取率的影響

在微波功率800W、提取時間10min條件下，選擇pH值分別為0.5、1.0、1.5、2、3、4的溶液酸度，對劍麻果膠進行提取，其提取率隨pH值的影響變化如圖1所示。顯然，溶液的酸度(pH值)對果膠的浸出影響很大。當pH值小于2時，較強的酸性可以有效地破壞細胞組織結(jié)構(gòu)等因素對果膠分子封閉，提取率較大。酸性減弱時，原果膠難以完全轉(zhuǎn)化為水溶性果膠，甚至只有少量低聚糖溶出，因此產(chǎn)率很小。所以，優(yōu)化試驗的pH值選擇1.5較為合適。

圖1 pH值對劍麻果膠提取率的影響Fig.1 Effect of pH of the extraction yield of ASP

2.1.2 微波功率對提取率的影響

保持條件pH1.0、提取時間10min，微波功率分別選擇為200、400、500、700、800、1000W對劍麻果膠的提取效果的影響如圖2所示。當微波功率較低時，檢測到的溫度較低，因此提取率較低。微波功率達到400W以上時，劍麻果膠的提取率明顯增大，但600W以上的功率對提取率影響不明顯，所以選擇500W作為優(yōu)化點。

圖2 微波功率對劍麻果膠提取率的影響Fig.2 Effect of microwave output power on the extraction yield of ASP

2.1.3 提取時間對提取率的影響

在微波功率800W、pH1.0條件下，提取時間分別為5、10、15、20、30、40min對劍麻果膠的提取效果的影響如圖3所示。在5min內(nèi)，提取時間對劍麻果膠產(chǎn)率的影響不明顯。在5～10min期間，隨著微波的不間斷作用，物料和溶劑溫度不斷升高，細胞組織的不同部位升溫率差異不斷擴大，具有支鏈的高分子果膠也能夠大量浸出，果膠得率隨之增大。當進一步延長時間，果膠提取率并沒有明顯變化，說明大部分果膠在提取10min左右后已經(jīng)溶出，所以選擇10min作為進一步的優(yōu)化條件。

圖3 提取時間對劍麻果膠提取率的影響Fig.3 Effect of extraction time on the extraction yield of ASP

2.2 響應面試驗設(shè)計與優(yōu)化分析

2.2.1 響應面分析因素水平的選取

綜合單因素試驗結(jié)果，pH值、微波功率、提取時間三因素對果膠的提取率有較為明顯的影響。根據(jù)Box-Behnken的原理，在單因素數(shù)據(jù)結(jié)果的基礎(chǔ)上，采取三因素三水平的響應面試驗設(shè)計分析方法，試驗因素與水平設(shè)計見表1。

表1 響應面試驗設(shè)計的因素變量和水平Table1 Coded levels for independent variables used in response surface analysis

2.2.2 響應面試驗設(shè)計與結(jié)果

以pH值(X1)、微波功率(X2)、提取時間(X3)為自變量，以提取率(Y)為響應值，試驗設(shè)計方案及結(jié)果見表2。

表2 Box-Behnken試驗設(shè)計和結(jié)果Table2 Box-Behnken design and results

2.2.3 模型建立與顯著性檢驗

在表2中，此15個試驗選擇分為響應面的析因點和零點，其中序號1～12的試驗屬于析因試驗，序號13～15屬于中心試驗。析因點自變量在由X1、X2、X3因素所構(gòu)成的三維頂點上取值，零點則在對應區(qū)域的中心點[17]。一般，零點試驗要重復進行3次，以便用于試驗的估計誤差。由于各因素對提取率的影響均不是簡單的線性關(guān)系，所以采用SAS-RSREG程序?qū)Ρ?中的響應值分別進行多元回歸擬合[18]，并確定各因素對響應值的影響，回歸方差分析結(jié)果見表3。各因素經(jīng)回歸擬合后，響應變量Y對pH值、提取時間、微波功率的二次多項回歸方程如下：

擬合方程的每個變量對響應值影響的顯著程度，可以通過P值來判斷[19]，P值小則表示對應變量的影響顯著性高。通常認為，模型在P≤0.05時水平顯著，在P≤0.01時水平極顯著，表明試驗設(shè)計可靠。由表3可知，對于劍麻果膠多糖的提取率而言，pH值的一次項(X1)和二次項()均達到極顯著水平，說明在該試驗中pH值的影響是不可忽視的；微波功率的一次項(X2)和二次項(X22)均達到顯著水平；其他項均P＞0.05，說明其他2個因素自身作用或3個因素之間的交互作用不顯著；由此可見回歸模型不是簡單的線性關(guān)系?；貧w模型的R2為95.63%，說明95.63%的響應值變化與所選的3個變量(pH值、提取時間和微波功率)相關(guān)；調(diào)整后R2仍然能夠達到87.77%的相關(guān)度，而且模型顯著水平P為0.0067，可見擬合方程能夠較準確地描述所選因素變量與響應變量值之間的實際關(guān)系，可用于確定提取工藝條件。

表3 響應面回歸模型的方差分析(ANOVA)Table3 ANOVA for the response surface model

2.2.4 響應面分析

SAS軟件對響應變量的變化趨勢進行預測優(yōu)化，并畫出由響應值與因素變量構(gòu)成的三維響應曲面和二維等高圖線，能夠?qū)M合模型進行直觀分析。提取條件對劍麻果膠的提取率的響應面變化趨勢如圖4所示。比較此3組圖可知，pH值(X1)對劍麻果膠提取的影響最為顯著，表現(xiàn)為曲線較陡；其次是微波功率(X2)；而提取時間(X3)最不明顯，在曲面和等高線上表現(xiàn)較為平坦，也就是隨著試驗因素變量數(shù)值的增加或減少，引起的響應變量即提取率的變化值比較小[20]。說明各因素的主效應關(guān)系為：pH值(X1)＞微波功率(X2)＞提取時間(X3)。圖4中3組響應曲面呈一定程度拋物曲面狀，Y隨因素變量的變化，極易出現(xiàn)一個最大值，此時最易與找出最佳優(yōu)化條件。

圖4 微波提取條件對劍麻果膠的提取率的響應面Fig.4 Response surface plot showing the interaction effects of three extraction conditions on the extraction yield of ASP

2.2.5 最佳提取工藝的優(yōu)化及驗證

回歸方程的典型相關(guān)分析表明Y的穩(wěn)定點為最大點，其值分別為6.14%，無需進行進一步的嶺脊分析(ridge analysis)。最后，通過SAS軟件的最優(yōu)化模型回歸分析得到最佳的提取工藝條件為pH1.3、微波功率533.7W、提取時間9.75min，此條件下劍麻果膠提取率的預測值為6.14%。為便于實際操作，將最佳提取工藝修正為pH1.3、微波功率534W、提取時間9.8min。

為驗證響應面法所得結(jié)果的可靠性，在上述修正條件下，采用微波輔助提取法對同處理批次的劍麻渣粉進行果膠提取，進行3次驗證實驗，計算所得產(chǎn)品的得率，平均提取率為6.10%，結(jié)果與預測值相近。驗證表明，擬合模型對于劍麻果膠提取率有較好的預測能力。

2.3 劍麻果膠的特征

劍麻果膠和標準品果膠(柑橘)的紅外光譜對比如圖5所示。由紅外圖譜可知，劍麻果膠在500～4000cm-1范圍內(nèi)具有糖類的特征吸收峰，其峰形和變化趨勢與柑橘標準品果膠類似。在3100～3600cm-1之間存在碳環(huán)上的O—H的吸收寬峰，2950～2750cm-1附近的吸收峰則由半乳糖醛酸甲酯或碳環(huán)上(—CH3、—CH2、—CH)上的C—H的伸縮振動引起的。1760～1745cm-1與1640～1620cm-1處的強吸收峰分別由羧酸酯的羰基基團(COOR)和自由羧酸的羧基(COO—)伸縮振動引起[21]。1650～1550cm-1附近的吸收為非對稱伸縮吸收峰，即羧基有兩個譜帶；1400cm-1附近出現(xiàn)較弱的吸收由飽和C—H鍵的彎曲振動吸收引起。這些吸收峰均屬多糖化合物所特有的特征性吸收峰[22]。

通過測定，微波提取法獲得的劍麻果膠的半乳糖醛酸含量能達到75.3%，酯化度達72.09%。可見，微波提取法獲得的劍麻果膠純度較高，酯化度也比較高。

圖5 在優(yōu)化的微波條件下獲得的劍麻果膠的紅外光譜圖Fig.5 FTIR spectra of pectin standard and ASP extracted under the optimal conditions

3 結(jié) 論

溶液pH值、微波功率、提取時間對微波提取劍麻果膠均有不同程度的影響，其中pH值和微波功率對提取率的影響較大。本實驗通過響應面分析法優(yōu)化得出的最佳提取工藝條件為：pH1.3、微波功率534W、提取時間9.8min，與驗證實驗相符，在此條件下，劍麻果膠提取率為6.10%，半乳糖醛酸含量和酯化度分別為75.3%和72.09%。

[1] ROBERTA X S, ANA C S C, MARIANA B, et al. Action of sisal (Agave sisalana Perrine) extract in the in vitro development of sheep and goat gastrointestinal nematodes[J]. Experimental Parasitology, 2012, 131(2): 162-168.

[2] 吳學鋒, 羅志祥, 陳海艷. 劍麻纖維生產(chǎn)與應用[J]. 中國纖檢, 2010(2): 59-61.

[3] 薛剛, 王越川. 近十年世界劍麻生產(chǎn)與貿(mào)易概括[J]. 熱帶農(nóng)業(yè)科學, 2010, 30(4): 62-66.

[4] 中國農(nóng)業(yè)年鑒編輯委員會. 2009中國農(nóng)業(yè)年鑒[M]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社, 2009: 209-210.

[5] 國家中醫(yī)藥管理局中華本草編委會. 中華本草[M]. 上海: 科學技術(shù)出版社, 1999.

[6] OASHI M C G. Estudo da cadeia produtiva como subsídio para pesquisa e desenvolvimento do agronegócio do sisal na Paraíba[D]. Santa Catarina: Federal University of Santa Catarina, 1999.

[7] SANTOS J D G, BRANCO A, SILVA A F, et al. Antimicrobial activity of Agave sisalana[J]. African Journal of Biotechnology, 2009, 8: 6181-6184.

[8] 韓廣甸, 馬兆揚. 我國利用劍麻皂素合成甾體藥物的研究進展[J].中國醫(yī)藥工業(yè)雜志, 2002, 33(9): 459-464.

[9] 韓耀玲. 劍麻的綜合利用[D]. 南寧: 廣西大學, 2004.

[10] 涂行浩, 張弘, 鄭華, 等. 響應面法優(yōu)化微波鈍化瑪咖黑芥子酶活[J].食品科學, 2011, 32(18): 148-153.

[11] KURT S, ZORBA O. Response surface optimization of pH and ionic strength for emulsion characteristics of egg yolk[J]. Poultry Science, 2009, 88: 2422-2427.

[12] 馬少健, 梁玉石, 封金鵬, 等. 應用響應面設(shè)計分析法研究碳酸錳吸收微波的性能[J]. 有色金屬: 冶煉部分, 2012(2): 9-15.

[13] BOX G E P, BEHNKEN D W. Some new three level designs for the study of quantitative variables[J]. Technometrics, 1960, 2: 455-475.

[14] SHEIN C C. Encyclopedia of biopharmaceutical statistics[M]. 3rd. London: Informa Healthcare, 2010: 1171-1179.

[15] 姚先超, 張雪紅, 韋金銳, 等. 小波變換漫反射紅外光譜法測定劍麻果膠的酯化度[J]. 分析測試學報, 2011, 30(3): 274-278.

[16] 丁建東, 張雪紅, 姚先超, 等. 咔唑比色法測定劍麻果膠含量[J]. 食品研究與開發(fā), 2010, 31(11): 138-140.

[17] 李蕾, 岳喜華, 于歡, 等. 響應面法優(yōu)化酸漿果多糖的提取工藝[J].食品與生物技術(shù)學報, 2009(1): 53-56.

[18] 應芝, 勵建榮, 韓曉祥. 響應面分析法優(yōu)化桑葉多糖提取工藝的研究[J]. 中國食品學報, 2008, 8(4): 39-45.

[19] SHENGLI Y, HUI Z. Optimization of cholesterol oxidase production by Brevibacterium sp. employing response surface methodology[J]. African Journal of Biotechnology, 2012, 24: 8316-8322.

[20] 褚福紅, 陸寧, 于新, 等. 響應面法優(yōu)化微波提取野菊花抗氧化物質(zhì)[J]. 食品科學, 2010, 31(24): 90-94.

[21] GNANASAMBANDAM R, PROCTOR A. Determination of pectin degree of esterifcation by disffuse reflectance Fourier transform infrared spectroscopy[J]. Food Chemistry, 2000, 68(3): 327-332.

[22] FELLAHA, ANJUKANDI P, WATERLAND M R, et al. Determining the degree of methyl esterification of pectin by ATR/ FT-IR: methodology optimisation and comparison with theoretical calculations[J]. Carbohydrate Polymers, 2009, 78(4): 847-853.

Optimization of Microwave-Assisted Extraction of Pectic Polysaccharides from Agave sisalana Perrine by Response Surface Methodology

YAO Xian-chao1,2，ZHANG Xue-hong1，LIANG Yu-shi3，ZHOU Hong1，LIN Cui-wu1,*
(1. School of Chemistry and Chemical Engineering, Guangxi University, Nanning 530004, China；2. School of Chemistry and Chemical Engineering, Guangxi University for Nationalities, Nanning 530006, China；3. Department of Facility and Laboratory Management, Guangxi University for Nationalities, Nanning 530006, China)

The microwave-assisted extraction of pectic polysaccharides from sisal wastes left over after fiber production was investigated. Response surface methodology (RSM) based on a three-level, three-variable Box-Behnken design was applied to optimize three extraction conditions including microwave output power, extraction time and solvent pH. The optimum extraction conditions were found to be 534 W, 9.8 min and pH 1.3. The yield of ASP (pectic from Agave sisalana Perrine) under the optimized conditions was 6.10% and galacturonic acid content and esterification degree of the extract were 75.3% and 72.09%, respectively.

response surface methodology；Agave sisalana；pectic；microwave；extraction

TQ432.71

A

1002-6630(2013)18-0056-05

10.7506/spkx1002-6630-201318012

2012-08-22

廣西自然科學基金項目(2010GXNSFA013038；2011GXNSFA018051)；廣西博士研究生創(chuàng)新基金資助項目(105931001008)；廣西科技攻關(guān)項目(桂科攻1355003-15)

姚先超(1984—)，男，碩士，研究方向為天然藥物化學。E-mail：yxc2772552@163.com

*通信作者：林翠梧(1958—)，女，教授，博士，研究方向為天然資源開發(fā)與利用。E-mail：lincuiwu@126.com