姚先超，張雪紅，梁玉石，周 紅，林翠梧,*

(1.廣西大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，廣西 南寧 530004；2.廣西民族大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，廣西 南寧 530006；3.廣西民族大學(xué)設(shè)備實(shí)驗(yàn)管理處，廣西 南寧 530006)

響應(yīng)面分析法優(yōu)化微波輔助提取劍麻果膠的工藝

姚先超1,2，張雪紅1，梁玉石3，周 紅1，林翠梧1,*

(1.廣西大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，廣西 南寧 530004；2.廣西民族大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，廣西 南寧 530006；3.廣西民族大學(xué)設(shè)備實(shí)驗(yàn)管理處，廣西 南寧 530006)

以劍麻纖維生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)生的廢渣為原料，采用微波輔助技術(shù)從中提取果膠。首先通過(guò)單因素試驗(yàn)考察選取影響因素和相關(guān)水平，然后采用三因素三水平的響應(yīng)面法分析設(shè)計(jì)優(yōu)化微波功率、提取時(shí)間、溶液pH值等因素的組合試驗(yàn)，對(duì)果膠提取條件進(jìn)行優(yōu)化和顯著性分析，依據(jù)回歸分析確定最佳提取工藝條件為微波功率534W、提取時(shí)間9.8min、pH1.3，在此工藝條件下，劍麻果膠的提取率為6.10%，其半乳糖醛酸含量和酯化度分別為75.3%和72.09%。

響應(yīng)面分析法；劍麻；果膠；微波；提取

劍麻(Agave sisalana Perrine)又名鳳尾蘭、千手蘭、菠蘿麻等，為龍舌蘭科植物，原產(chǎn)于墨西哥尤卡坦半島[1]，其劍狀單葉經(jīng)壓碾破碎后主要用于加工生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)纖維[2]?，F(xiàn)在巴西、坦桑尼亞等國(guó)及其他熱帶、亞熱帶地區(qū)均有廣大分布和種植生產(chǎn)[3]。中國(guó)是世界第二大劍麻主產(chǎn)國(guó)，產(chǎn)量?jī)H次于巴西；主要分布在海南、廣西、廣東、福建等省份[4]。在傳統(tǒng)中醫(yī)藥草中，劍麻是一種非常有用的中草藥植物，具有涼血止血、消腫止痛之功效，能夠用于治療肺癆咯血、痢疾以及癰瘡腫毒等傷病[5]。由于纖維僅占劍麻質(zhì)量的5%左右，其余部分在纖維生產(chǎn)中一般作為廢葉廢渣被丟棄[6]，致使大量資源浪費(fèi)。因此，研究如何更好地開(kāi)發(fā)利用劍麻廢液廢渣變得尤為重要。

劍麻葉肉及其汁液中含有大量的天然成分如葉綠素、皂苷、氨基酸及果膠，其中皂素等成分已知具有藥效作用[7]。從生產(chǎn)劍麻形成的廢液中提取重要的甾體激素藥物原料劍麻皂素[8]，是目前對(duì)劍麻廢液再利用最成功的例子，而關(guān)于其果膠多糖的研究則較少。果膠是一種應(yīng)用廣泛的食品添加劑；劍麻果膠作為天然多糖碳水合物，在動(dòng)物急性毒性實(shí)驗(yàn)中未發(fā)現(xiàn)其具有毒性，相關(guān)指標(biāo)符合國(guó)家食品添加劑標(biāo)準(zhǔn)，是一種有潛力的食用果膠資源[9]。

響應(yīng)面優(yōu)化法由數(shù)學(xué)分析方法和統(tǒng)計(jì)分析學(xué)方法組成，主要用于考察研究影響因素自變量及其相互之間的交互作用對(duì)變化過(guò)程因變量的影響，能夠反映因素自變量和響應(yīng)因變量之間的關(guān)系。響應(yīng)面優(yōu)化法是一種優(yōu)化工藝過(guò)程條件的有效方法，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于化學(xué)工藝、生物工程、食品工業(yè)以及冶金等領(lǐng)域[10-12]。目前關(guān)于應(yīng)用響應(yīng)面優(yōu)化微波提取劍麻果膠(A. sisalana pectic，ASP)的工藝研究還未見(jiàn)報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)引入響應(yīng)面法和微波輔助法以探討快速高效提取劍麻果膠，以期今后工業(yè)化生產(chǎn)尋找理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

劍麻廢渣由廣西劍麻集團(tuán)有限公司提供，干渣經(jīng)粉碎后其粒度應(yīng)低于100目。

濃鹽酸、無(wú)水乙醇均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?；半乳糖醛酸和果膠標(biāo)準(zhǔn)品 美國(guó)Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

微波超聲波組合萃取儀 北京祥鵠公司；冷凍真空干燥器 北京博醫(yī)康儀器公司；AL204電子天平 梅特勒托利多儀器公司；RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化公司；低速臺(tái)式大容量離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海尤尼科儀器公司；FTIR紅外光譜儀 美國(guó)Thermo Nicolet公司。

1.3 方法

1.3.1 劍麻果膠提取工藝

定量稱取的劍麻渣粉末在常溫條件下復(fù)水20min，在200目的濾布中洗滌2次并擰干。濾渣在90℃以上的水中高溫滅酶10min，洗滌并擰干，反復(fù)3次。處理后的劍麻渣放入一定酸度的鹽酸溶液(即料液比1:25(g/mL)，麻渣浸入程度最佳)中，在恒定功率的微波輻射下，攪拌提取一段時(shí)間后，趁熱過(guò)濾，擠干，同樣條件反復(fù)提取3次。3次提取濾液匯集、冷卻、離心，所得清液在減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)系統(tǒng)中濃縮。在攪拌狀態(tài)下，將4倍體積的乙醇溶液加入冷卻后的濃縮液中，在4℃環(huán)境下醇沉靜置5h。然后，醇沉混合液以4700r/min的轉(zhuǎn)速離心10min，收集膠狀沉積物，以95%乙醇-0.1mol/L HCl(1:2，V/V)溶液溶解2次，每次都進(jìn)行離心。最后，收集所得的沉積物在-45℃條件下真空冷凍干燥24h。稱質(zhì)量，按下式計(jì)算提取率：

1.3.2 單因素試驗(yàn)

稱取10g劍麻渣粉末，在微波輻射作用下提取劍麻果膠，分別改變微波功率、pH值及時(shí)間等提取條件，考察這些因素對(duì)劍麻果膠提取率(Y，%)的總體影響趨勢(shì)。每組對(duì)應(yīng)條件進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，所得的果膠提取率取其平均值。

1.3.3 劍麻果膠提取工藝的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)Box-Behnken組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理[13-14]，通過(guò)單因素試驗(yàn)確定影響因素后，多因素三水平的設(shè)計(jì)方案可以在SAS軟件(Version 9.2，SAS Institute)完成。

1.3.4 劍麻果膠的紅外光譜

將適量的劍麻果膠與一定量的KBr混合研磨，壓片。采用Nicollet Nexus FTIR于4000～400cm-1波數(shù)范圍內(nèi)掃描64次，分辨率為4cm-1。

1.3.5 劍麻果膠的酯化度測(cè)定

劍麻果膠的酯化度測(cè)定參照文獻(xiàn)[15]的方法進(jìn)行測(cè)定。1.3.6 劍麻果膠中半乳糖醛酸含量的測(cè)定

劍麻果膠中半乳糖醛酸含量通過(guò)硫酸咔唑比色法[16]進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定條件為濃硫酸用量6.0mL、水解溫度70℃、水解時(shí)間20min、0.15%咔唑無(wú)水乙醇溶液用量為0.5mL，在室溫條件下暗處顯色，顯色時(shí)間為30min，在530nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 pH值對(duì)提取率的影響

在微波功率800W、提取時(shí)間10min條件下，選擇pH值分別為0.5、1.0、1.5、2、3、4的溶液酸度，對(duì)劍麻果膠進(jìn)行提取，其提取率隨pH值的影響變化如圖1所示。顯然，溶液的酸度(pH值)對(duì)果膠的浸出影響很大。當(dāng)pH值小于2時(shí)，較強(qiáng)的酸性可以有效地破壞細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)等因素對(duì)果膠分子封閉，提取率較大。酸性減弱時(shí)，原果膠難以完全轉(zhuǎn)化為水溶性果膠，甚至只有少量低聚糖溶出，因此產(chǎn)率很小。所以，優(yōu)化試驗(yàn)的pH值選擇1.5較為合適。

圖1 pH值對(duì)劍麻果膠提取率的影響Fig.1 Effect of pH of the extraction yield of ASP

2.1.2 微波功率對(duì)提取率的影響

保持條件pH1.0、提取時(shí)間10min，微波功率分別選擇為200、400、500、700、800、1000W對(duì)劍麻果膠的提取效果的影響如圖2所示。當(dāng)微波功率較低時(shí)，檢測(cè)到的溫度較低，因此提取率較低。微波功率達(dá)到400W以上時(shí)，劍麻果膠的提取率明顯增大，但600W以上的功率對(duì)提取率影響不明顯，所以選擇500W作為優(yōu)化點(diǎn)。

圖2 微波功率對(duì)劍麻果膠提取率的影響Fig.2 Effect of microwave output power on the extraction yield of ASP

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)提取率的影響

在微波功率800W、pH1.0條件下，提取時(shí)間分別為5、10、15、20、30、40min對(duì)劍麻果膠的提取效果的影響如圖3所示。在5min內(nèi)，提取時(shí)間對(duì)劍麻果膠產(chǎn)率的影響不明顯。在5～10min期間，隨著微波的不間斷作用，物料和溶劑溫度不斷升高，細(xì)胞組織的不同部位升溫率差異不斷擴(kuò)大，具有支鏈的高分子果膠也能夠大量浸出，果膠得率隨之增大。當(dāng)進(jìn)一步延長(zhǎng)時(shí)間，果膠提取率并沒(méi)有明顯變化，說(shuō)明大部分果膠在提取10min左右后已經(jīng)溶出，所以選擇10min作為進(jìn)一步的優(yōu)化條件。

圖3 提取時(shí)間對(duì)劍麻果膠提取率的影響Fig.3 Effect of extraction time on the extraction yield of ASP

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與優(yōu)化分析

2.2.1 響應(yīng)面分析因素水平的選取

綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，pH值、微波功率、提取時(shí)間三因素對(duì)果膠的提取率有較為明顯的影響。根據(jù)Box-Behnken的原理，在單因素?cái)?shù)據(jù)結(jié)果的基礎(chǔ)上，采取三因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)分析方法，試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素變量和水平Table1 Coded levels for independent variables used in response surface analysis

2.2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

以pH值(X1)、微波功率(X2)、提取時(shí)間(X3)為自變量，以提取率(Y)為響應(yīng)值，試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果Table2 Box-Behnken design and results

2.2.3 模型建立與顯著性檢驗(yàn)

在表2中，此15個(gè)試驗(yàn)選擇分為響應(yīng)面的析因點(diǎn)和零點(diǎn)，其中序號(hào)1～12的試驗(yàn)屬于析因試驗(yàn)，序號(hào)13～15屬于中心試驗(yàn)。析因點(diǎn)自變量在由X1、X2、X3因素所構(gòu)成的三維頂點(diǎn)上取值，零點(diǎn)則在對(duì)應(yīng)區(qū)域的中心點(diǎn)[17]。一般，零點(diǎn)試驗(yàn)要重復(fù)進(jìn)行3次，以便用于試驗(yàn)的估計(jì)誤差。由于各因素對(duì)提取率的影響均不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，所以采用SAS-RSREG程序?qū)Ρ?中的響應(yīng)值分別進(jìn)行多元回歸擬合[18]，并確定各因素對(duì)響應(yīng)值的影響，回歸方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。各因素經(jīng)回歸擬合后，響應(yīng)變量Y對(duì)pH值、提取時(shí)間、微波功率的二次多項(xiàng)回歸方程如下：

擬合方程的每個(gè)變量對(duì)響應(yīng)值影響的顯著程度，可以通過(guò)P值來(lái)判斷[19]，P值小則表示對(duì)應(yīng)變量的影響顯著性高。通常認(rèn)為，模型在P≤0.05時(shí)水平顯著，在P≤0.01時(shí)水平極顯著，表明試驗(yàn)設(shè)計(jì)可靠。由表3可知，對(duì)于劍麻果膠多糖的提取率而言，pH值的一次項(xiàng)(X1)和二次項(xiàng)()均達(dá)到極顯著水平，說(shuō)明在該試驗(yàn)中pH值的影響是不可忽視的；微波功率的一次項(xiàng)(X2)和二次項(xiàng)(X22)均達(dá)到顯著水平；其他項(xiàng)均P＞0.05，說(shuō)明其他2個(gè)因素自身作用或3個(gè)因素之間的交互作用不顯著；由此可見(jiàn)回歸模型不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系?；貧w模型的R2為95.63%，說(shuō)明95.63%的響應(yīng)值變化與所選的3個(gè)變量(pH值、提取時(shí)間和微波功率)相關(guān)；調(diào)整后R2仍然能夠達(dá)到87.77%的相關(guān)度，而且模型顯著水平P為0.0067，可見(jiàn)擬合方程能夠較準(zhǔn)確地描述所選因素變量與響應(yīng)變量值之間的實(shí)際關(guān)系，可用于確定提取工藝條件。

表3 響應(yīng)面回歸模型的方差分析(ANOVA)Table3 ANOVA for the response surface model

2.2.4 響應(yīng)面分析

SAS軟件對(duì)響應(yīng)變量的變化趨勢(shì)進(jìn)行預(yù)測(cè)優(yōu)化，并畫出由響應(yīng)值與因素變量構(gòu)成的三維響應(yīng)曲面和二維等高圖線，能夠?qū)M合模型進(jìn)行直觀分析。提取條件對(duì)劍麻果膠的提取率的響應(yīng)面變化趨勢(shì)如圖4所示。比較此3組圖可知，pH值(X1)對(duì)劍麻果膠提取的影響最為顯著，表現(xiàn)為曲線較陡；其次是微波功率(X2)；而提取時(shí)間(X3)最不明顯，在曲面和等高線上表現(xiàn)較為平坦，也就是隨著試驗(yàn)因素變量數(shù)值的增加或減少，引起的響應(yīng)變量即提取率的變化值比較小[20]。說(shuō)明各因素的主效應(yīng)關(guān)系為：pH值(X1)＞微波功率(X2)＞提取時(shí)間(X3)。圖4中3組響應(yīng)曲面呈一定程度拋物曲面狀，Y隨因素變量的變化，極易出現(xiàn)一個(gè)最大值，此時(shí)最易與找出最佳優(yōu)化條件。

圖4 微波提取條件對(duì)劍麻果膠的提取率的響應(yīng)面Fig.4 Response surface plot showing the interaction effects of three extraction conditions on the extraction yield of ASP

2.2.5 最佳提取工藝的優(yōu)化及驗(yàn)證

回歸方程的典型相關(guān)分析表明Y的穩(wěn)定點(diǎn)為最大點(diǎn)，其值分別為6.14%，無(wú)需進(jìn)行進(jìn)一步的嶺脊分析(ridge analysis)。最后，通過(guò)SAS軟件的最優(yōu)化模型回歸分析得到最佳的提取工藝條件為pH1.3、微波功率533.7W、提取時(shí)間9.75min，此條件下劍麻果膠提取率的預(yù)測(cè)值為6.14%。為便于實(shí)際操作，將最佳提取工藝修正為pH1.3、微波功率534W、提取時(shí)間9.8min。

為驗(yàn)證響應(yīng)面法所得結(jié)果的可靠性，在上述修正條件下，采用微波輔助提取法對(duì)同處理批次的劍麻渣粉進(jìn)行果膠提取，進(jìn)行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，計(jì)算所得產(chǎn)品的得率，平均提取率為6.10%，結(jié)果與預(yù)測(cè)值相近。驗(yàn)證表明，擬合模型對(duì)于劍麻果膠提取率有較好的預(yù)測(cè)能力。

2.3 劍麻果膠的特征

劍麻果膠和標(biāo)準(zhǔn)品果膠(柑橘)的紅外光譜對(duì)比如圖5所示。由紅外圖譜可知，劍麻果膠在500～4000cm-1范圍內(nèi)具有糖類的特征吸收峰，其峰形和變化趨勢(shì)與柑橘標(biāo)準(zhǔn)品果膠類似。在3100～3600cm-1之間存在碳環(huán)上的O—H的吸收寬峰，2950～2750cm-1附近的吸收峰則由半乳糖醛酸甲酯或碳環(huán)上(—CH3、—CH2、—CH)上的C—H的伸縮振動(dòng)引起的。1760～1745cm-1與1640～1620cm-1處的強(qiáng)吸收峰分別由羧酸酯的羰基基團(tuán)(COOR)和自由羧酸的羧基(COO—)伸縮振動(dòng)引起[21]。1650～1550cm-1附近的吸收為非對(duì)稱伸縮吸收峰，即羧基有兩個(gè)譜帶；1400cm-1附近出現(xiàn)較弱的吸收由飽和C—H鍵的彎曲振動(dòng)吸收引起。這些吸收峰均屬多糖化合物所特有的特征性吸收峰[22]。

通過(guò)測(cè)定，微波提取法獲得的劍麻果膠的半乳糖醛酸含量能達(dá)到75.3%，酯化度達(dá)72.09%?？梢?jiàn)，微波提取法獲得的劍麻果膠純度較高，酯化度也比較高。

圖5 在優(yōu)化的微波條件下獲得的劍麻果膠的紅外光譜圖Fig.5 FTIR spectra of pectin standard and ASP extracted under the optimal conditions

3 結(jié) 論

溶液pH值、微波功率、提取時(shí)間對(duì)微波提取劍麻果膠均有不同程度的影響，其中pH值和微波功率對(duì)提取率的影響較大。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)響應(yīng)面分析法優(yōu)化得出的最佳提取工藝條件為：pH1.3、微波功率534W、提取時(shí)間9.8min，與驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)相符，在此條件下，劍麻果膠提取率為6.10%，半乳糖醛酸含量和酯化度分別為75.3%和72.09%。

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Optimization of Microwave-Assisted Extraction of Pectic Polysaccharides from Agave sisalana Perrine by Response Surface Methodology

YAO Xian-chao1,2，ZHANG Xue-hong1，LIANG Yu-shi3，ZHOU Hong1，LIN Cui-wu1,*
(1. School of Chemistry and Chemical Engineering, Guangxi University, Nanning 530004, China；2. School of Chemistry and Chemical Engineering, Guangxi University for Nationalities, Nanning 530006, China；3. Department of Facility and Laboratory Management, Guangxi University for Nationalities, Nanning 530006, China)

The microwave-assisted extraction of pectic polysaccharides from sisal wastes left over after fiber production was investigated. Response surface methodology (RSM) based on a three-level, three-variable Box-Behnken design was applied to optimize three extraction conditions including microwave output power, extraction time and solvent pH. The optimum extraction conditions were found to be 534 W, 9.8 min and pH 1.3. The yield of ASP (pectic from Agave sisalana Perrine) under the optimized conditions was 6.10% and galacturonic acid content and esterification degree of the extract were 75.3% and 72.09%, respectively.

response surface methodology；Agave sisalana；pectic；microwave；extraction

TQ432.71

A

1002-6630(2013)18-0056-05

10.7506/spkx1002-6630-201318012

2012-08-22

廣西自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2010GXNSFA013038；2011GXNSFA018051)；廣西博士研究生創(chuàng)新基金資助項(xiàng)目(105931001008)；廣西科技攻關(guān)項(xiàng)目(桂科攻1355003-15)

姚先超(1984—)，男，碩士，研究方向?yàn)樘烊凰幬锘瘜W(xué)。E-mail：yxc2772552@163.com

*通信作者：林翠梧(1958—)，女，教授，博士，研究方向?yàn)樘烊毁Y源開(kāi)發(fā)與利用。E-mail：lincuiwu@126.com