張麗美，楊婷婷，胡蔣寧，劉志剛，鄧澤元*

(南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江西 南昌 330047)

超聲波輔助提取茶粕多糖及其抗氧化活性

張麗美，楊婷婷，胡蔣寧，劉志剛，鄧澤元*

(南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江西 南昌 330047)

采用超聲波輔助提取油茶餅粕中的茶籽多糖。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，利用正交試驗優(yōu)化提取條件，然后采用苯酚-硫酸法測定總糖含量，PMP柱前衍生HPLC法測定單糖組成，并對其抗氧化活性進行研究。結(jié)果表明，茶籽多糖最佳提取工藝條件為超聲功率150W、提取溫度80℃、提取時間45min、料液比1:15(g/mL)，在此條件下茶粕多糖的得率為(14.22±0.51)%。茶粕多糖主要由葡萄糖、鼠李糖以及甘露糖組成，同時還含有少量半乳糖醛酸、半乳糖、阿拉伯糖及木糖，其總糖含量約為81.2%?？寡趸瘜嶒灡砻鳎杵啥嗵乔宄H及DPPH自由基的能力與質(zhì)量濃度呈正相關(guān)。當茶粕多糖質(zhì)量濃度為5mg/mL時，對·OH及DPPH自由基的清除率分別達到84.6%和73.5%；但其幾乎沒有還原能力。

茶粕多糖；超聲波提取；正交試驗；單糖組成；抗氧化活性

油茶(Camellia oleifera)屬山茶科植物，是我國特有的木本食用油料樹種。據(jù)統(tǒng)計，我國油茶栽培面積約為500萬公頃，年產(chǎn)油茶籽90余萬t，榨油后的茶粕約為60萬t[1]。茶粕中含有大量的蛋白質(zhì)、茶皂素、粗纖維、多糖等，它們是化工、輕工、食品、飼料等領(lǐng)域的重要原料[2]。因此我國潛在的可利用茶粕資源十分豐富。

多糖是由十個以上乃至幾十個單糖通過糖苷鍵相連形成的線性或支鏈的高聚物，是所有生命有機體的重要組成部分，同維持生物機能密切相關(guān)。多糖具有多方面的生理活性，如降血壓、降血脂、抗腫瘤、抗病毒、抗氧化、抗炎、免疫調(diào)節(jié)等。由于多糖所具有的多種生物活性功能及其在臨床上的廣泛應(yīng)用，多糖已成為近年來的研究熱點[3-4]。相關(guān)研究表明，茶籽多糖具有抗血栓、降血糖、抑制K562(人體白血病細胞)增長，促進淋巴細胞增殖的作用，此外還可能有修復(fù)糖代謝紊亂的功能[5-6]。茶籽多糖作為一種重要的活性多糖，必將成為人們研究的熱點[7]。但近幾年來，關(guān)于茶多糖的研究主要以茶葉多糖為主，而對油茶餅粕多糖的研究仍然甚少。因此，從油茶餅粕中提取多糖，并對其進行研究，不僅能提高茶粕的利用率，更有望為人們開發(fā)一種新的功能性成分。

本研究采用超聲波輔助提取油茶籽茶粕多糖，對其提取工藝條件進行優(yōu)化，并對所提多糖純度、單糖組成及其·OH清除能力、DPPH自由基清除能力及還原能力進行研究，以期為茶粕多糖的利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

油茶餅粕：將山茶籽經(jīng)本實驗室方法提取茶籽油以及茶皂素后所得。

葡萄糖、菲洛嗪、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)、三氟乙酸等試劑(均為分析純)；乙腈(色譜純)、1,1-二苯基苦?；诫?DPPH) 美國Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SK3310HP超聲波清洗器 上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司；TDL-5-A飛鴿牌臺式離心機 上海安亭科學(xué)儀器廠制造；722G紫外-可見分光光度計 上海精科儀器有限公司；HH-S11電熱恒溫水浴鍋 鞏義市英峪予華儀器廠；1100高效液相色譜儀(配有四元泵、紫外檢測器和1100色譜工作站) 美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 茶粕多糖的超聲波輔助提取[8-10]

稱取一定量經(jīng)本實驗室方法提油及脫茶皂素后的油茶籽粕，按一定料液比加蒸餾水攪拌后，放入超聲波清洗器內(nèi)按實驗設(shè)計工藝提取，離心取上清液，加入三氯乙酸至其最終質(zhì)量濃度為5g/100mL，靜置12h后離心取上清液，加入4倍體積分數(shù)為95%的乙醇，于-4℃冰箱靜置過夜后離心，所得沉淀物即為茶粕粗多糖。

1.3.2 單因素試驗

以0.5g茶粕作為提取對象，通過前期試驗摸索，確定多糖初始提取工藝參數(shù)為：料液比1:10、超聲功率180W、提取溫度70℃、提取時間45min。按1.3.1節(jié)中方法進行多糖提取。實驗過程中，固定其他3個因素，分別考察料液比、超聲功率、提取溫度、提取時間對茶粕多糖得率的影響。

1.3.3 正交試驗

表1 正交試驗因素水平表Table1 Coded levels for independent variables used in orthogonal array design

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選擇影響較顯著的因素，利用L9(34)正交試驗對提取工藝做進一步優(yōu)化，試驗方案見表1。

1.3.4 茶粕多糖含量的測定

苯酚-硫酸法檢測[11]：將上述多糖沉淀物加蒸餾水溶解后定容至100mL，取0.2mL于具塞試管中，補加蒸餾水至2.0mL，然后加入質(zhì)量濃度為6mg/mL的苯酚溶液1.0mL，再加入濃硫酸5mL，搖勻后沸水浴顯色15min，冷卻后于490nm波長處測吸光度。同時用2.0mL蒸餾水按上述操作做空白實驗。根據(jù)標準曲線計算得到樣品溶液中茶粕多糖的含量，并根據(jù)式(1)計算多糖得率。所得葡萄糖標準曲線方程為：y=0.826x＋0.015，R2=0.999。

1.3.5 茶粕多糖的鑒定

1.3.5.1 總糖含量測定

將按1.3.1節(jié)方法提取的多糖沉淀物溶于蒸餾水后采用Sevag法反復(fù)脫蛋白5次，再用95%乙醇沉淀，沉淀依次用無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌，再用蒸餾水透析48h，冷凍干燥。取0.1g定容至100mL，按1.3.4節(jié)的方法測定多糖含量，見式(2)。

1.3.5.2 單糖及糖醛酸鑒定

采用PMP柱前衍生化HPLC法[12-13]檢測茶粕多糖的單糖及糖醛酸組成。準確稱取20mg粗多糖，加入2mL 4mol/L三氟乙酸(TFA)于110℃烘箱中水解4h，真空干燥后加入甲醇并用氮氣吹干，重復(fù)操作2～3次以除去多余的TFA，然后向水解管中加入200μL蒸餾水溶解。

取單糖、糖醛酸標準品及水解后的茶粕多糖樣品200μL，分別加入200μL 0.5mol/L PMP甲醇溶液及0.3mol/L氫氧化鈉溶液，然后置于70℃恒溫水浴中反應(yīng)70min。取出后冷卻至室溫，加入0.3mol/L鹽酸中和后補水至1mL，再加入2mL三氯甲烷反復(fù)萃取3次，將得到的水相過0.22μm的濾膜后進行HPLC分析。

色譜條件：大連依利特C18柱(150mm×4.6mm，5μm)；流動相：20mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.72)-乙腈(82:18，V/V)溶液；柱溫：30℃；檢測波長：250nm；流速：0.5mL/min；進樣體積：10μL。

1.3.6 茶粕多糖的體外抗氧化活性測定

1.3.6.1 清除羥自由基(·OH)活性測定[14]

精確稱取1.3.5.1節(jié)粗多糖和VC，分別用適量的蒸餾水溶解，配制成質(zhì)量濃度為5mg/mL的儲備液。分別取多糖及VC儲備液稀釋成質(zhì)量濃度為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mg/mL的溶液，待測。

測定方法：在反應(yīng)體系中分別加入0.5mL 0.75mmol/L鄰二氮菲，1.0mL 0.15mol/L PBS緩沖液(pH7.4)，0.5mL不同質(zhì)量濃度的粗多糖溶液，充分混勻后加入0.5mL 0.75mmol/L 硫酸亞鐵，混勻后再加入0.5mL 0.01%的過氧化氫，混勻后于37℃水浴30min，取出冷卻至室溫，在536nm波長處測定吸光度，以VC作為陽性對照，按式(3)計算樣品對·OH的清除率。

式中：A0為以水代替過氧化氫及樣品溶液的吸光度；A1為以水代替樣品溶液的吸光度；A2為加入樣品溶液反應(yīng)后的吸光度。

1.3.6.2 清除DPPH自由基活性測定[15]

取1mL不同質(zhì)量濃度的樣品溶液，加入1mL蒸餾水，再加入2mL 2×10-4mol/L DPPH溶液(無水乙醇配制)，搖勻后于25℃水浴30min，在517nm波長處測定其吸光度。以水代替樣品溶液、無水乙醇代替DPPH作空白實驗調(diào)零，按式(4)計算樣品對DPPH自由基的清除率。

式中：A0為以無水乙醇代替樣品溶液及蒸餾水的吸光度；A1為樣品溶液的吸光度；A2為以無水乙醇代替DPPH的吸光度。

1.3.6.3 還原能力測定[16]

取2.5mL不同質(zhì)量濃度的樣品溶液，分別加入0.2mol/L PBS緩沖液(pH6.6)和1g/100mL的鐵氰化鉀溶液各2.5mL，充分混勻后，50℃水浴20min，再加入2.5mL 10g/100mL的三氯乙酸溶液，混勻后于3000r/min離心10min，取2.5mL上清液，加入2.5mL蒸餾水和0.5mL 0.1g/100mL的三氯化鐵溶液，于700nm波長處測定吸光度，吸光度越大表明還原能力越強。以蒸餾水代替樣品溶液做空白實驗調(diào)零。VC作為陽性對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶粕多糖提取單因素試驗

2.1.1 料液比對多糖得率的影響

由圖1可知，料液比在1:5～1:10(g/mL)范圍內(nèi)，多糖提取得率隨著提取液用量的增加而升高，提取液用量繼續(xù)增大，多糖得率基本上趨于穩(wěn)定。原因可能是提取液用量過少時，多糖提取不充分，而當料液比達到一定范圍后，傳質(zhì)作用力達到平衡致使多糖能被充分提取出來?？紤]到提取液用量過大，會延長濃縮耗時，增加能耗，因此料液比應(yīng)選擇1:10左右為宜。

圖1 料液比對茶粕多糖得率的影響Fig.1 Effect of solid-to-solvent ratio on the yield of polysaccharides

2.1.2 提取時間對多糖得率的影響

圖2 提取時間對茶粕多糖得率的影響Fig.2 Effect of extraction time on the yield of polysaccharides

由圖2可知，在15～45min范圍內(nèi)，多糖得率隨著提取時間的增加急劇上升，并且在45min時達到最大值，此后延長提取時間，多糖得率略微下浮。原因可能是因為長時間的機械剪切作用，致使部分多糖降解。因此選擇提取時間為45min左右為宜。

2.1.3 提取溫度對多糖得率的影響

圖3 提取溫度對茶粕多糖得率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on the yield of polysaccharides

由圖3可知，在50～70℃范圍內(nèi)，多糖得率隨著提取時間的延長急劇上升，此后升高提取溫度，多糖得率增加緩慢，因此從能耗及經(jīng)濟角度考慮，選擇提取溫度為70℃左右為宜。

2.1.4 超聲功率對多糖得率的影響

由圖4可知，在60～150W超聲功率變化范圍內(nèi)，多糖得率隨著超聲功率的增大而上升，此后增大超聲功率，多糖得率略有減少，這可能是因為超聲功率提高時，傳質(zhì)作用力增強，因而能夠增大多糖溶解度。而功率過大時，強烈的振動作用又會導(dǎo)致部分多糖降解，因此選擇超聲功率為150W左右為宜。

圖4 超聲功率對茶粕多糖得率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic output power on the yield of polysaccharides

2.2 最佳工藝條件的確定

正交試驗結(jié)果見表2，顯著性檢驗見表3。

表2 正交試驗設(shè)計及結(jié)果Table2 Orthogonal array design and results

表3 正交試驗結(jié)果方差分析Table3 Analysis of variance for the experimental results of orthogonal array design

由表3極差分析可知，影響茶粕多糖得率的各因素大小為D(提取溫度)＞A(料液比)＞C(超聲功率)＞B(提取時間)。比較k值大小可知，最佳提取工藝條件為A3B2C2D3，即料液比1:15(g/mL)、提取時間45min、超聲功率150W、提取溫度80℃。由表3方差分析可知，在考察范圍內(nèi)提取溫度對于茶粕多糖的提取具有顯著性差異，而料液比、超聲功率及提取時間在考察范圍內(nèi)無顯著差異。

2.3 驗證實驗

由于上述最佳工藝條件在正交試驗的9次試驗中并沒有出現(xiàn)，因此對試驗得到的最佳工藝條件進行3次驗證實驗，得到茶粕多糖的平均得率為(14.22±0.51)%。因此，通過正交試驗優(yōu)化的多糖提取工藝參數(shù)準確可靠。試驗表明，采用超聲波輔助提取茶粕多糖不僅能夠提高提取效率，降低成本，而且該工藝產(chǎn)率高，重復(fù)性好，能夠為茶粕多糖的開發(fā)及利用提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)保障。

2.4 茶粕多糖的鑒定

圖5 混合單糖標準對照品(A)和茶粕多糖(B)的PMP衍生物液相色譜圖Fig.5 HPLC chromatograms of PMP derivatives mixed standards of monosaccharides and polysaccharides from seed cake of Camellia oleifera Abel

由圖5可知，茶粕多糖主要含有葡萄糖、鼠李糖以及甘露糖，此外，還含有少量的半乳糖醛酸、半乳糖、阿拉伯糖以及木糖，其峰面積比約為Glu:Rha:Man:GalUA: Gal:Xyl:Ara=1.0:0.40:0.28:0.09:0.17:0.10:0.07，總糖含量約為81.2%。

2.5 體外抗氧化活性實驗

2.5.1 茶粕多糖清除·OH活性

圖6 茶粕多糖對·OH的清除能力Fig.6 Scavening effect of polysaccharides from seed cake of Camellia oleifera Abel

如圖6所示，在質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，·OH的清除能力隨著茶粕多糖質(zhì)量濃度的增加而增強。當茶粕多糖質(zhì)量濃度為5mg/mL時，·OH的清除率達到84.6%。但與VC相比，其·OH清除能力較弱。當VC質(zhì)量濃度為1mg/mL時，對·OH的清除率達到96.0%，而等質(zhì)量濃度的茶粕多糖對·OH的清除率僅為22.2%。

2.5.2 茶粕多糖清除DPPH自由基活性

圖7 茶粕多糖對DPPH自由基的清除能力Fig.7 DPPH radical scavenging effect of polysaccharides from seed cake of Camellia oleifera Abel

如圖7所示，在實驗質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，隨著茶粕多糖質(zhì)量濃度的增加，DPPH自由基的清除能力增強。當茶粕多糖質(zhì)量濃度為5mg/mL時，DPPH自由基的清除率達到73.5%。但與VC相比，其DPPH自由基清除能力較弱。當VC質(zhì)量濃度為1mg/mL時，DPPH自由基的清除率達到98.9%，而等質(zhì)量濃度的茶粕多糖對DPPH自由基的清除率僅為13.7%。

2.5.3 茶粕多糖還原能力

圖8 茶粕多糖還原能力Fig.8 Reducing power of polysaccharide from seed cake of Camellia oleifera Abel

如圖8所示，在實驗質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，增大茶粕多糖質(zhì)量濃度其還原能力無明顯變化。當VC質(zhì)量濃度為1mg/mL時，其吸光度為2.52，而茶粕多糖質(zhì)量濃度為5mg/mL時，吸光度僅為0.26。這說明茶粕多糖幾乎沒有還原能力。

3 結(jié) 論

3.1 采用超聲波輔助提取茶粕多糖，考察料液比、提取時間、提取溫度以及超聲功率對茶粕多糖得率的影響。正交試驗確定的最佳提取工藝條件為：料液比1:15(g/mL)、提取時間45min、超聲功率150W、提取溫度80℃，在此條件下茶粕多糖的得率為(14.22±0.51)%。

3.2 PMP柱前衍生化HPLC法測定結(jié)果顯示，茶粕多糖主要含有葡萄糖、鼠李糖以及甘露糖，此外，還有少量半乳糖醛酸、半乳糖、阿拉伯糖及木糖，其峰面積比約1.0:0.40:0.28:0.09:0.17:0.07:0.10，總糖含量約為81.2%。3.3 體外抗氧化活性實驗表明，茶粕多糖具有一定的清除·OH及DPPH自由基的能力，并且其抗氧化活性與質(zhì)量濃度呈正相關(guān)。當多糖質(zhì)量濃度為5mg/mL時，對·OH的清除率為84.6%，對DPPH自由基的清除率為73.5%；但其幾乎沒有還原能力。

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Ultrasonic-Assisted Extraction and Antioxidant Activity of Polysaccharides from Seed Cake of Camellia oleifera Abel

ZHANG Li-mei，YANG Ting-ting，HU Jiang-ning，LIU Zhi-gang，DENG Ze-yuan*
(State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

The ultrasonic-assisted extraction of polysaccharides from seed cake of Camellia oleifera Abel was investigated. An orthogonal array design was used to establish the optimum extraction conditions. Total sugar content was determined by phenol-sulfuric acid method and monosaccharide composition was analyzed by HPLC following pre-column derivatization. Besides, the antioxidant activity of polysaccharides from seed cake of Camellia oleifera Abel was assessed. The results showed that the optimum extraction conditions of ultrasonic output power, temperature, time and solid-to-solvent ratio were 150 W, 80 ℃, 45 min and 1:15 (g/mL), respectively. Under these conditions, the extraction yield of polysaccharides was (14.22 ± 0.51)%. The extracted polysaccharides consisted mostly of glucose Glu, Rha and Man along with a small amount of GalUA, Gal, Xyl andAra and showed a total sugar content of 81.2%. Antioxidant experiments showed that the free radical scavenging activity of the polysaccharides against hydroxyl and DPPH radicals was concentration dependent, with scavenging rates of 84.6% and 73.5% at 5 mg/mL, respectively. Nevertheless, almost no reducing power activity was observed.

polysaccharides from seed cake of Camellia oleifera Abel；ultrasonic-assisted extraction；orthogonal array design；monosaccharide composition；antioxidant activity

TS222.1

A

1002-6630(2013)18-0036-05

10.7506/spkx1002-6630-201318008

2012-07-12

江西省科技重大專項(贛科發(fā)[2010]J217)

張麗美(1987—)，女，碩士研究生，主要從事天然產(chǎn)物研究。E-mail：zhanglimei1987@yahoo.cn

*通信作者：鄧澤元(1963—)，男，教授，博士，主要從事天然產(chǎn)物及油脂研究。E-mail：dengzy28@yahoo.com.cn