楊 艷，向加林，歐陽(yáng)旭紅△，尹 玲，于國(guó)輝

（1.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科，貴州遵義563000；2.遵義醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系2006級(jí)本科，貴州遵義563003）

DUSP9基因是近年研究發(fā)現(xiàn)具有雙重專一性的磷酸酶家族（Dual specificity protein phosphtases，DUSPs）成員之一。DUSPs可逆轉(zhuǎn)應(yīng)激通路中絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）的活性，因此，也稱作 MAPK磷酸 酶 家 族 （mitogen-activated protein kinase phosphatases，MKPs）。該家族屬于酪氨酸蛋白磷酸酶超家族，可通過去磷酸化、鈍化MAPK關(guān)鍵的酪氨酸和蘇氨酸殘基，調(diào)控MAPK的功能［1-2］。其家族成員因?qū)APKs家族表現(xiàn)出獨(dú)特的底物特異性，故分為DUSP1（又名 MKP1）、DUSP4（又名 MKP2）、DUSP6（又名 MKP3）、DUSP9（又名 MKP4）、DUSP10（又名MKP5）。研究發(fā)現(xiàn)，人源與小鼠DUSP9同源性為83%，在胎盤、肝、腎臟中高表達(dá)，且在發(fā)育進(jìn)程中是可調(diào)型表達(dá)［3-4］，對(duì)胰島素作用存在爭(zhēng)議［2，5］，但其在胰島素抵抗進(jìn)程中的作用機(jī)制及分子靶點(diǎn)尚未清楚。本研究通過構(gòu)建DUSP9真核表達(dá)載體，并在小鼠Hepa1-6肝細(xì)胞中過表達(dá)DUSP9，為進(jìn)一步研究DUSP9生理功能及其在糖脂代謝、胰島素抵抗進(jìn)程中的作用奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 Hepa1-6肝細(xì)胞購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)；pEGFPN1載體購(gòu)于GENECHEM公司；DH5α購(gòu)于大連寶生物公司。主要試劑：DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、Opti-MEM培養(yǎng)基購(gòu)自GIBICO公司；LipofectamineTM2000購(gòu)自Invitrogen公司；RNA提取試劑、DNA聚合酶PrimeSTARTMHS DNA Polymerase、dNTP Mixture、SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ、Prime-ScriptTMRT reagent、引物、限制性內(nèi)切酶、T4DNA ligase等購(gòu)自TAKARA公司；去內(nèi)毒素質(zhì)粒小抽試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒、膠回收試劑盒均購(gòu)自O(shè)MEGA公司；兔抗小鼠β-actin一抗、HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗購(gòu)自北京中杉金橋公司；兔抗鼠DUSP9購(gòu)自Abnova公司。

1.2 方法

1.2.1 目的基因的獲取及擴(kuò)增 以健康C57小鼠肝組織總RNA為模板，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)條件為：37℃15min，85℃5s，將得到的cDNA溶液應(yīng)用于PCR擴(kuò)增。根據(jù)pubmed-GenBank中NM＿029352DUSP9mRNA序列，擴(kuò)增小鼠DUSP9基因全編碼區(qū)cDNA片段，所用引物即上游：5′-CCG GAA TTC TAT GGA GAG TCT GAG TCG G-3′（含ECORI酶切位點(diǎn)）；下游：5′-CGG GTA CCG GTA GTG TGG GGT CCA GCT CAA AG-3′（含 AgeI酶切位點(diǎn)），PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：98℃預(yù)變性4min；98℃變性12s，64℃退火17s，72℃延伸1min，共35個(gè)循環(huán)；72℃加長(zhǎng)延伸6min，并純化PCR產(chǎn)物。

1.2.2 重組真核表達(dá)載體的構(gòu)建 分別用ECORI和AgeI雙酶切pEGFP-N1載體及目的基因片段并膠回收，T4DNA ligase 16℃連接過夜，第2天取10uL連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α并將其涂布于含kanr的LB選擇性平板進(jìn)行篩選，挑取陽(yáng)性單克隆，置于含kanr的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振搖培養(yǎng)過夜，質(zhì)粒抽提，雙酶切鑒定并送大連寶生物公司測(cè)序。

1.2.3 Hepa1-6肝細(xì)胞的培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 （1）細(xì)胞培養(yǎng)：將 Hepa1-6肝細(xì)胞接種于6孔板，細(xì)胞密度確保第2天每孔能匯合80%，DMEM＋10%FBS培養(yǎng)（無(wú)雙抗），CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（5%CO2，37℃）孵育細(xì)胞。（2）細(xì)胞分組及轉(zhuǎn)染：將 Hepa1-6肝細(xì)胞分為3組，即陰性對(duì)照組（僅加入相對(duì)應(yīng)量的脂質(zhì)體和PBS的細(xì)胞，negative control group，NC組）、空載組（轉(zhuǎn)染空載體pEGFP-N1的細(xì)胞，blank control group，BC組）、轉(zhuǎn)染組（轉(zhuǎn)染pEGFP-DUSP9的細(xì)胞，transfection group，TG組），每組設(shè)平行實(shí)驗(yàn)復(fù)孔（3孔），重復(fù)實(shí)驗(yàn)2次。將質(zhì)粒和脂質(zhì)體按1∶2.5與Opti-MEM混合進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染方法按LipofectamineTM2000說(shuō)明書。

1.2.4 DUSP9mRNA表達(dá)水平的檢測(cè) 轉(zhuǎn)染48h后，分別提取各組細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。采用SYBR GreenⅠ熒光染料實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)DUSP9mRNA的表達(dá)。以β-actin基因作為內(nèi)參，用2-△△CT值表示基因相對(duì)表達(dá)量。所用引物即 DUSP9上游：5′-GCT TCA GTG GTC GTG CC G-3′，DUSP9下游5′-GGA GGG GAT GTG GTG TTC-3′；小鼠β-actin上游引物：5′-GCT GTC CCT GTA TGC CTC T-3′，下游：5′-GAT GTC ACG CAC GAT TTC C-3′。

1.2.5 DUSP9蛋白表達(dá)水平的檢測(cè) 采用 Western blot法檢測(cè)各組細(xì)胞DUSP9蛋白表達(dá)水平。提取各組細(xì)胞總蛋白，按每泳道加80ug蛋白進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳，半干轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜）（0.45μm），室溫封閉3h，一抗（內(nèi)參β-actin 1∶250，DUSP9 1∶200稀釋）4℃孵育過夜，二抗（1∶5 000稀釋）孵育1h并洗脫，將PVDF膜置于化學(xué)發(fā)光板，加入發(fā)光試劑，室溫反應(yīng)2min后置化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)成像。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以±s表示，組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 pEGFP-DUSP9重組真核表達(dá)質(zhì)粒酶切、測(cè)序鑒定結(jié)果

pEGFP-DUSP9質(zhì)粒經(jīng)ECORⅠ、AgeⅠ雙酶切，切出約4 700、1 359bp的片段，分別代表質(zhì)粒pEGFP-N1和插入目的片段DUSP9，與預(yù)期結(jié)果完全一致，說(shuō)明DUSP9基因已正確克隆到pEGFP-N1表達(dá)載體。測(cè)序結(jié)果（部分見圖1）顯示與目的基因序列（NM＿029352）CDS區(qū)完全一致。

2.2 pEGFP-DUSP9轉(zhuǎn)染的驗(yàn)證 倒置熒光顯微鏡下可見重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hepa1-6細(xì)胞發(fā)綠色熒光，見圖2。

圖1 重組質(zhì)粒DNA測(cè)序結(jié)果部分彩圖（紅色劃線部分表示克隆序列的起始位）

圖2 Hepa1-6細(xì)胞培養(yǎng)及pEGFP-DUSP9轉(zhuǎn)染圖

2.3 DUSP9過表達(dá)的驗(yàn)證 RT-QPCR、Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，TG組肝細(xì)胞中，DUSP9mRNA表達(dá)量明顯上調(diào)，是NC組61.82倍（ΔCt值：11.18±0.35 vs 17.13±0.22，P＜0.01），其蛋白水平也呈高表達(dá)，NC、BC組中DUSP9蛋白表達(dá)較低，提示DUSP9質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染Hepa1-6肝細(xì)胞且高表達(dá)，見圖3。

圖3 Western blot檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組Hepa1-6細(xì)胞中DUSP9的表達(dá)

3 討 論

胰島素抵抗（IR）是2型糖尿?。═2DM）發(fā)病的一個(gè)關(guān)鍵因素，其產(chǎn)生是遺傳和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果。近年來(lái)隨著國(guó)內(nèi)外對(duì)IR的深入研究，氧化應(yīng)激學(xué)說(shuō)、炎癥病因?qū)W說(shuō)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激學(xué)說(shuō)相繼提出且成為IR的研究熱點(diǎn)，其相關(guān)信號(hào)通路的調(diào)節(jié)子等研究更為深入。

MAPK及應(yīng)激活化蛋白激酶（stress-activated protein kinases，SAPK，）在IR發(fā)展進(jìn)程中起著重要作用［6］，二者的作用靶點(diǎn)之一為胰島素傳導(dǎo)關(guān)鍵分子-胰島素受體底物1（insulin receptor substrate-1，IRS-1），均能使IRS-1絲氨酸殘基磷酸化［7］，降低IRS-1酪氨酸磷酸化水平，進(jìn)而阻礙了它與胰島素信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)下游元件的相互作用［8］，導(dǎo)致IR的發(fā)生。有趣的是MAPK及SAPK的激活是一個(gè)可逆的過程，阻斷這些應(yīng)激激酶可能阻止IR的發(fā)展。

DUSP9作為可逆轉(zhuǎn)應(yīng)激通路中MAPK活性的雙重專一性磷酸酶家族成員，可鈍化細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellularregulatedproteinkinases，ERK）及p38MAPK 的活性，但對(duì)SAPK的作用尚無(wú)定論，最新研究發(fā)現(xiàn)在惡性腎腫瘤透明細(xì)胞下調(diào)DUSP9的表達(dá)與疾病的預(yù)后不良有關(guān)聯(lián)［9］。其在IR進(jìn)程中的作用也尚未明確。有研究認(rèn)為，在3T3-F442A脂肪細(xì)胞中過表達(dá)DUSP9，可封閉胰島素誘導(dǎo)的脂質(zhì)形成及糖攝取，負(fù)向調(diào)節(jié)胰島素信號(hào)，可能促使了IR的發(fā)生［4］。然而，最新研究發(fā)現(xiàn)，在3T3-L1細(xì)胞中過表達(dá)DUSP9，抑制ERK及JNK／SAPK的磷酸化以及在較小程度上抑制了p38MAPK磷酸化［2］。茴香霉素誘導(dǎo)的IRS-1絲氨酸磷酸化被終止，IRS-1酪氨酸磷酸化的信號(hào)路徑得以恢復(fù)，從而恢復(fù)了胰島素的敏感性，并且能逆轉(zhuǎn)腫瘤壞死因子-a（TNF-α）抑制的胰島素信號(hào)。

此外，有研究發(fā)現(xiàn)在小鼠白色脂肪可檢測(cè)到DUSP9的表達(dá)；肥胖小鼠體內(nèi)DUSP9在胰島素敏感組織特異性上調(diào)表達(dá)；3T3-F442A前脂肪細(xì)胞中DUSP9成低表達(dá)，在脂肪形成期表達(dá)上調(diào)［9］，說(shuō)明DUSP9可能參與了促成熟脂肪細(xì)胞形成，或與脂質(zhì)形成相關(guān)。但其在代謝組學(xué)如對(duì)糖脂代謝、脂肪細(xì)胞因子的作用尚未見進(jìn)一步研究報(bào)道。

因此，本實(shí)驗(yàn)欲通過克隆DUSP9真核表達(dá)載體，并在胰島素敏感組織-肝細(xì)胞（Hepa1-6）中過表達(dá)DUSP9蛋白，為進(jìn)一步探討DUSP9對(duì)糖脂代謝、脂肪細(xì)胞因子可能的作用及機(jī)制奠定研究基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)中，利用pEGFP-N1質(zhì)粒（帶綠色熒光蛋白的報(bào)告載體）、采取雙酶切定向克隆的方式（避免自連和反向連接）構(gòu)建DUSP9重組真核表達(dá)載體。pEGFP-N1包含增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因EGFP，使得其在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中有較高的表達(dá)及較強(qiáng)的熒光得到最佳化，并為可應(yīng)用流式細(xì)胞篩選或其他方式對(duì)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)EGFP及目的蛋白的有效率提供一個(gè)依據(jù)；含有高效的功能強(qiáng)大的啟動(dòng)子SV40和PCMV，可以使目的基因在增殖的細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)；結(jié)構(gòu)上，該質(zhì)粒具有很強(qiáng)的復(fù)制能力，可以滿足隨宿主細(xì)胞分裂時(shí)跟隨細(xì)胞質(zhì)遺傳給新生的子細(xì)胞，這是保證目的基因穩(wěn)定表達(dá)的因素之一；具有新霉素抗性（neo）基因，可以采用G418來(lái)篩選已成功轉(zhuǎn)染了該載體的靶細(xì)胞。此外，采用含Kanr的LB選擇性培養(yǎng)基篩選含Kanr轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒，并經(jīng)雙酶切初步鑒定克隆正確，最后經(jīng)DNA測(cè)序分析確定所插入的目的基因片段的正確性。

本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pEGFP-DUSP9，并在Hepa1-6肝細(xì)胞中高效表達(dá)DUSP9蛋白，有望成為IR發(fā)生的分子生物學(xué)治療靶點(diǎn)，同時(shí)也為T2DM的治療提供新的思路。

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