陳 娟，王昌明，周 燕，黎紅秀

（桂林醫(yī)學院附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，廣西桂林541001）

特發(fā)性肺纖維化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是一組多種病因引起的以氣道受損、炎癥因子大量分泌、間充質(zhì)細胞增生和細胞外基質(zhì)異常沉積為特點的漸進性疾病，患者確診后平均生存期僅3～5年［1］。IPF發(fā)病機制不明，近年來國內(nèi)外研究表明肺泡上皮細胞-間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)分化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是肺纖維的重要機制之一，細胞因子轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming growth factor beta1，TGF-β1）可通過活化p38絲裂原活化蛋白激酶類（p38mitogen-activated protein kinases，p38MAPK）誘導 EMT 過程［2］。目前，對IPF尚缺乏有效的治療方法，臨床上常用糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑，但效果并不滿意。本課題組前期研究表明，青蒿素衍生物青蒿琥酯除抗瘧疾外，還具有抗纖維化作用［3-4］。本研究用青蒿琥酯為工具藥，研究在其干預下對TGF-β1誘導的EMT過程中的影響及其可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料 永生化大鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞（rat lung epithelial-t-antigen negative，RLE-6TN）株購自中南大學湘雅實驗中心細胞庫。TGF-β1購自Peprotech公司（美國）；四甲基偶氮唑鹽（MTT）粉劑購自sigma公司（美國）；Total RNA提取試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKaRa寶生物工程大連有限公司；引物由Invitrogen公司設(shè)計合成；組織細胞裂解液（tissue and cell lysis solution，WIP）、BCA蛋白濃度測定試劑盒購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；p38MAPK兔抗人一抗購自Santa cruz（美國）；α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）兔抗人單克隆抗體購自ABBIOTEC公司（美國）；V-波形蛋白（vimentin，Vim）兔抗人一抗購自Bioworld Technology；辣根酶標記山羊抗兔IgG購自中杉金橋；胎牛血清購自GIBCO公司；1640培養(yǎng)基購自HyClone公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) RLE-6TN細胞在37℃、5%CO2、飽和濕度的條件下用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。穩(wěn)定傳代后用含1%胎牛血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞同步化24h，根據(jù)相關(guān)文獻及預實驗結(jié)果，誘導劑TGF-β1按說明書配置好母液后稀釋于含1%胎牛血清的培養(yǎng)液中，終濃度為3ng／mL，青蒿琥酯用NaHCO3溶解后再調(diào)整到相應終濃度作用于細胞。

1.2.2 細胞分組 MTT粉劑用PBS配成5mg／mL的存儲液，過濾除菌，4℃保存。將細胞分為6組，1個對照組、5個實驗組（其中1個誘導組，4個藥物干預組）。計數(shù)細胞，3 000個／孔細胞種植96孔板，設(shè)5個復孔，在1%FBS（對照組）、TGF-β13ng／mL（TGF-β1組）、TGF-β13ng／mL＋青蒿琥酯1 mg／L（TGF-β1聯(lián)合1組）、TGF-β13ng／mL＋青蒿琥酯2mg／L（TGF-β1聯(lián)合2組）、TGF-β13ng／mL＋ 青蒿琥酯 4mg／L（TGF-β1聯(lián)合3組）、TGF-β13ng／mL＋青蒿琥酯8mg／L（TGF-β1聯(lián)合4組）作用細胞24h后加入MTT溶液至終濃度0.5mg／mL，繼續(xù)培養(yǎng)4h，吸干凈 MTT溶液，加入二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）150μL，避光平搖10min，用酶標儀測定490nm處的吸光度值（A）。根據(jù)抑制率＝﹝（對照組OD490值-實驗組OD490值）／對照組OD490值﹞×100%計算細胞抑制率。用寇式改良法計算IC50，根據(jù)IC50選擇藥物干預濃度進行以下實驗。

1.2.3 倒置顯微鏡觀察 當細胞生長融合至60%～80%時，棄培養(yǎng)液，換含1%胎牛血清的1640培養(yǎng)液靜止24h，換新鮮靜止液，于對照組、TGF-β1組及 TGF-β1聯(lián)合1、2、3、4組培養(yǎng)液中分別加入1%FBS、TGF-β13ng／mL及TGF-β13ng／mL＋青蒿琥酯1、2、4、8mg／L作用細胞24h后，使用倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)學的改變并拍照。

1.2.4 Western blot檢測上皮及間質(zhì)細胞標志物的表達 各組細胞生長、培養(yǎng)同1.2.3，培養(yǎng)細胞24h后用WIP裂解液（1 mL）＋蛋白酶抑制劑（10μL）＋磷酸酶抑制劑（10μL）混合，每皿（d＝10cm）加入 WIP裂解液混合液200μL，冰上裂解45 min，用細胞刮刮下后離心取上清液，BCA蛋白測定試劑盒做標準曲線測定蛋白濃度后，取30μg樣品蛋白進行10%的十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝膠變性電泳，然后轉(zhuǎn)膜至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，加入一抗，37℃孵育2h，Tris-Buffered-Saline with Tween-20（TBST）洗滌后加辣根酶標記二抗，37℃孵育2h，TBST洗滌后加適量ECL發(fā)光液（ECL luminous liquid）暗室發(fā)光，曝光后在凝膠成像系統(tǒng)下掃描并獲取密度值。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行分析，各實驗均重復3次。實驗數(shù)據(jù)以±s表示，差異顯著性分析采用One-way ANOVA分析，組間采用方差分析比較，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 青蒿琥酯對TGF-β1誘導的RLE-6TN細胞增殖的影響TGF-β1作用于RLE-6TN 24h后，細胞較對照組增殖明顯（P＜0.05）；青蒿琥酯不同濃度作用于 TGF-β1誘導的 RLE-6TN 24h后，細胞增殖受到抑制（表1）。根據(jù)抑制率用寇式改良法計算IC50，24hIC50＝8.86mg／L。

2.2 青蒿琥酯對TGF-β1誘導的RLE-6TN細胞形態(tài)的影響與對照組比較，加入TGF-β1后，RLE-6TN由鋪路石狀上皮形態(tài)變成梭形、紡錘形，而且其細胞間隙略變大，細胞和細胞之間的連接變得松散。在TGF-β1誘導后再加入青蒿琥酯，即TGF-β1聯(lián)合1、2、3、4組，與 TGF-β1組比較，細胞的梭形結(jié)構(gòu)減少，部分恢復鋪路石狀上皮形態(tài)，但細胞之間連接仍松散，見圖1。

2.3 青蒿琥酯對TGF-β1誘導的RLE-6TN細胞p38MAPK及間質(zhì)細胞標志性蛋白表達的影響 細胞培養(yǎng)24h后，TGF-β1誘導RLE-6TN表達p38MAPK、α-SMA、Vim均較對照組明顯增加（P＜0.05），青蒿琥酯作用于 TGF-β1誘導的 RLE-6TN后，p38MAPK、α-SMA、Vim表達均較 TGF-β1組明顯減少（P＜0.01），且各組間減少呈劑量依賴性（P＜0.05）。內(nèi)參為甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH），各組蛋白表達的電泳圖，見圖2。

圖1 倒置顯微鏡下各組細胞形態(tài)（×100）

表1 各組細胞24h后增殖抑制率比較

圖2 各組蛋白表達的電泳圖

3 討 論

肺間質(zhì)纖維化（Pulmonary fibrosis，PF）是一組多種病因引起的以氣道、肺泡結(jié)構(gòu)排列紊亂，膠原大量沉積為特點的漸進性疾病。臨床表現(xiàn)為刺激性干咳、無痰、進行性的呼吸困難等，最終可以引起呼吸功能衰竭而死亡。目前肺纖維化的病因及其發(fā)病機制尚未完全闡明，但都有其共同規(guī)律，肺部受感染或損傷后，損傷的肺上皮細胞和血管內(nèi)皮細胞產(chǎn)生大量的細胞因子，刺激炎癥細胞的聚集、活化，分泌膠原等細胞外基質(zhì)，沉積在肺間質(zhì)，導致肺纖維化［5］。

TGF-β1是一種多效性的細胞因子，是目前肺纖維化的研究熱點和重要藥物作用靶點。TGF-β1可由淋巴細胞、單核細胞、上皮細胞和成纖維細胞等多種細胞產(chǎn)生，通過自分泌和旁分泌的方式調(diào)節(jié)細胞的增殖、分化、遷移、黏附、調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)的代謝，參與肺胚胎發(fā)育、組織損傷和修復［6］。

Furukawa等［7］研究表明，TGF-β1誘導MAPK磷酸化活性變化，通過MAPK信號轉(zhuǎn)導途徑調(diào)節(jié)人肺上皮細胞向肌纖維母細胞轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生大量的細胞外基質(zhì)，導致肺間質(zhì)纖維化。肺泡上皮細胞（alveolar epithelial cell，AEC）包括Ⅰ和Ⅱ型，肺泡Ⅱ型上皮細胞（typeⅡalveolar epithelial cell or typeⅡpneumocyte，ATⅡ）是一種多功能細胞，對維持肺泡結(jié)構(gòu)和功能有重要意義。它是Ⅰ、Ⅱ型上皮細胞的祖細胞［8-9］，在正常細胞更新和損傷修復過程中，ATⅡ可以分化為Ⅰ型細胞，也可通過有絲分裂補充自身的數(shù)量。此外，ATⅡ具有合成和分泌肺表面活性物質(zhì)，維持肺泡內(nèi)外液體平衡，免疫調(diào)節(jié)等作用［10］。

絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶（MAPKs）信號通路是真核細胞轉(zhuǎn)導細胞外信號到細胞內(nèi)引起細胞反應的四大信號系統(tǒng)之一，其參與了細胞生長、發(fā)育及細胞間功能同步等多種生理功能，目前已知MAPKs由4個主要成員構(gòu)成，即細胞外信號調(diào)節(jié)激酶 （ERK1／ERK2）、應激活化蛋白激酶 （SAOK／JNK）、p38MAPK和ERK5。其中p38MAPK與肺纖維化過程密切相關(guān)［11］。TGF-β1誘導活化TGF-β1受體復合物，級聯(lián)活 化p38MAPK，p38MAPK把信號傳遞到細胞核內(nèi)，活化EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Snail家族蛋白中的Snail1和Slug表達，從而引起細胞形態(tài)及分泌功能的改變。Snail家族蛋白通過鋅指結(jié)構(gòu)域及N-末端結(jié)構(gòu)域起著轉(zhuǎn)錄抑制子的作用，Snail1在EMT過程中的作用早已有報道［12］。

張新志等［13］用抗纖靈沖劑作用于SD大鼠后，發(fā)現(xiàn)抗纖靈沖劑可通過調(diào)節(jié)TGF-β1／p38MAPK信號轉(zhuǎn)導通路，發(fā)揮抗腎小管間質(zhì)纖維化效應。Matsuoka等［14］研究也證實，用p38MAPK拮抗劑干預由博萊霉素誘導的肺纖維化動物模型后纖維化程度明顯減輕，以上資料均顯示p38MAPK的活化與纖維化的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。

Willis等［15］研究表明Vim是一種中間絲蛋白，是間質(zhì)細胞的典型標記物，α-SMA是一種肌動蛋白，幾乎所有的真核細胞都表達肌動蛋白，常用于標記間質(zhì)細胞。TGF-β1誘導的EMT早期變化就是細胞質(zhì)內(nèi)細胞骨架進行重排，表達新的表型蛋白如α-SMA，細胞質(zhì)內(nèi)肌絲也從上皮型的角蛋白（cytokeratin，CK）轉(zhuǎn)變?yōu)殚g質(zhì)細胞的Vim。細胞黏附連接主要成分E-鈣黏蛋白的下調(diào)或丟失，緊密連接成分的下調(diào)，以及間充質(zhì)細胞特異性的蛋白標記，如纖維連接蛋白、Vim和N-鈣黏蛋白的表達上調(diào)已成為人們判斷EMT發(fā)生的重要的分子指標［16］。

青蒿琥酯是抗瘧疾的有效單體，近年來研究發(fā)現(xiàn)青蒿琥酯除了有很好的抗瘧作用外，還具有抗炎、抗腫瘤、抗纖維化等作用［17］。本課題前期研究表明青蒿琥酯可以抑制人胚肺成纖維細胞增殖、促進其凋亡［3-4］，且呈劑量依賴性。以上的研究結(jié)果為青蒿素防治肺纖維化提供了理論依據(jù)。但是目前國內(nèi)外關(guān)于青蒿琥酯防治肺纖維化的研究報道較少，主要是關(guān)于其對成纖維細胞增殖的抑制作用，而對青蒿琥酯調(diào)控TGF-β1誘導的EMT的作用機制研究少見報道。

本研究穩(wěn)定傳代ATⅡRLE-6TN后，予TGF-β13ng／mL誘導ATⅡ轉(zhuǎn)分化為間質(zhì)細胞，結(jié)果表明，TGF-β1作用于RLE-6TN 24h后，p38MAPK、α-SMA、Vim蛋白均表達增加（P＜0.05）?？烧J為TGF-β1成功誘導RLE-6TN轉(zhuǎn)分化為間質(zhì)細胞，其可能機制為活化p38MAPK蛋白。給予不同劑量的青蒿琥酯作用于TGF-β1誘導后的RLE-6TN 24h后，信號蛋白p38MAPK及間質(zhì)細胞標志物α-SMA、Vim蛋白均較TGF-β1組表達明顯減少（P＜0.01），且呈濃度依賴性?？烧J為青蒿琥酯對TGF-β1誘導的轉(zhuǎn)分化過程有抑制作用，且隨著青蒿琥酯濃度的增加，這種抑制作用逐漸增強。

綜上所述，TGF-β1能誘導EMT過程。青蒿琥酯具有抗纖維化作用，其可能機制為抑制p38MAPK的活性從而抑制EMT過程。

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