李 萍，王化芬，史衛(wèi)峰，劉蘭蘭，劉 衛(wèi)△

（1.解放軍第八十八醫(yī)院，山東泰安271000；2.泰山醫(yī)學院生命科學研究所，山東泰安271000；3.山東省濟南市藥檢所 250011）

東莨菪堿（scopolamine）是一個經典的 M受體阻斷劑，防治暈動病的作用在軍事醫(yī)學上有重要意義［1］，為此，研制給藥方便并快速入腦起效的東莨菪堿制劑一直受到重視，新近有研究考察了東莨菪堿口服或經皮給藥在機體各組織的分布［2-3］。考慮到有的藥物經鼻給藥能快速入腦，本文在用液質聯用方法建立東莨菪堿血藥濃度和腦藥濃度檢測方法的基礎上，比較了在大鼠鼻腔給藥和腹腔注射相同劑量東莨菪堿后藥物動力學特點，以確定東莨菪堿經鼻腔給藥是否具有腦靶向性。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 Wistar大鼠，雌性，體質量180～220g，購自山東中醫(yī)藥大學實驗動物中心。

1.2 儀器與試劑 東莨菪堿乳膏（濟南軍區(qū)總醫(yī)院藥劑科產品，含氫溴酸東莨菪堿0.1%）。氫溴酸東莨菪堿（對照品），由濟南軍區(qū)總醫(yī)院胡冠時主任藥師惠贈。臨用前用50%甲醇配成0.1mg／mL標準液。阿普唑侖（內標）（標準品），購自中國藥品生物制品檢定研究院。臨用前用50%甲醇配成2μg／mL的內標液。LC／MS聯用系統(tǒng)，由質譜（mass spectrometry，MS）系統(tǒng)（WatersZQ4000型質譜儀，配有離子噴霧離子化源，美國 Waters公司）和液相（liquid chromatography，LC）系統(tǒng)［Waters2695型高效液相色譜儀（配有輸注泵，自動進樣器，柱溫箱，二極管陣列檢測器），美國Waters公司］組成。色譜柱：Zorbax XDB-C18柱，5μm粒徑，150×4.6mm I.D.（美國Agilent公司）。Oasis MCX固相萃取小柱（美國Waters公司）。

1.3 方法

1.3.1 采集樣品 大鼠用乙醚麻醉，斷頭取血不少于2mL，置離心管中，乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）抗凝，加入1mol／L的 HCl 0.10mL。常溫下4 000 r／min離心10min，分離血漿，以備固相萃取。分離腦組織，注意保留嗅球，置勻漿器中，加入等量氯化銨緩沖液，勻漿，以備固相萃取。

1.3.2 固相萃?。?-5］固相萃取小柱經2mL甲醇活化，用2 mL純化水平衡。取血漿2mL或組織勻漿樣品加壓濾過，棄去濾過液。先后用0.1mol／mL鹽酸、甲醇加壓濾過清洗，棄去濾過液。用甲醇（含4%氨水）洗脫，洗脫液接入離心管中，在水浴溫度不超過50℃的環(huán)境中用氮氣揮干洗脫液，用50%甲醇溶液2.00mL復溶。

1.3.3 LC／MS使用方法 流動相：乙腈，氨水調pH值為10.4。柱溫：室溫。掃描波長：200～300nm，進樣量：50μL。離子源：離子噴霧離子化源；檢測方式：正離子方式檢測；東莨菪堿和內標阿普唑侖用于定量分析的離子反應分別為m／z 304和 m／z 310，毛細管電壓3.2kV，錐孔電壓2.8V，源溫度105℃，脫溶劑氣流量350L／h，錐孔氣流量30L／h。在給定的色譜和質譜條件下，積分測定東莨菪堿和阿普唑侖的峰面積，以阿普唑侖為內標，與標準曲線對照得到樣品中氫溴酸東莨菪堿的含量。

1.3.4 給藥方法 大鼠的鼻腔給藥：大鼠用乙醚麻醉后，用自制的大鼠鼻腔給藥裝置，將東莨菪堿乳膏30mg（含氫溴酸東莨菪堿0.03mg）均勻地涂抹在大鼠單側鼻腔黏膜上（實驗組）。大鼠的腹腔給藥：大鼠用乙醚麻醉后，經腹腔注射氫溴酸東莨菪堿注射液（含氫溴酸東莨菪堿0.3mg／mL）0.1mL（對照組）。給藥大鼠的處置：大鼠給藥后5、10、20、30、60、120、240、480min，乙醚麻醉，斷頭處死，取血漿2.00mL或腦勻漿2.00mL，加阿普唑侖標準液20μL作為內標，固相萃取，進樣50μL，測定東莨菪堿和阿普唑侖的峰面積，計算氫溴酸東莨菪堿的濃度，繪制藥時曲線。

1.3.5 精密度與準確度測定 制備氫溴酸東莨菪堿低、中、高3個濃度（分別為0.2、2.0、20.0ng／mL）的樣品2mL，加內標20μL，根據東莨菪堿的峰面積／阿普唑侖的峰面積和標準曲線計算氫溴酸東莨菪堿含量，計算精密度和準確度。

1.3.6 基質效應［6-7］測定 制備氫溴酸東莨菪堿低、中、高3個濃度（分別為0.2，2.0，20.0ng／mL）的對照品溶液，于40℃水浴中氮氣吹干，上述3種濃度樣品分成A、B兩組（每組每個濃度各6份樣品），A組用流動相80μL渦旋30s溶解；B組用空白生物基質（空白血漿或腦勻漿樣品經處理后得到的上清液，每個濃度的6份血漿樣品，分別使用6份不同來源的空白血漿制作）80μL渦旋30s溶解。分別進樣，計算B組峰面積與A組峰面積的比值以考察樣品的基質效應。內標的基質效應以相同方法考察。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用的SPSS13.0軟件進行數據處理，計量資料用±s表示。不同劑量組間比較采用SNK-q檢驗。以東莨菪堿濃度為縱坐標，時間為橫坐標作圖，用3p97計算藥代動力學參數。不同給藥方法的兩組間藥-時曲線下面積（AUC）比較采用t檢驗。檢驗水準α＝0.05，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 東莨菪堿檢測方法的建立

2.1.1 方法的專屬性 在給定的色譜質譜條件下，東莨菪堿（M＋＝284）和內標阿普唑侖的峰形良好，分離完全，血漿或腦勻漿中的內源性物質不干擾東莨菪堿和內標阿普唑侖的測定。東莨菪堿的定量下限為（0.02±0.005）ng／mL，n＝4，S／N≥3，見圖1。

圖1 東莨菪堿的液質聯用色譜圖

2.1.2 標準曲線的建立 用大鼠的空白血漿或空白腦組織勻漿，配成藥物濃度為0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0ng／mL的氫溴酸東莨菪堿的系列溶液各2mL，加內標20μL，混勻，固相萃取，進樣，測定東莨菪堿和內標的峰面積，分別以血漿中或腦勻漿中氫溴酸東莨菪堿的濃度C（ng／mL）為橫坐標，以東莨菪堿與內標阿普唑侖峰面積比值Y為縱坐標進行線性回歸，求得標準曲線：Y＝0.247 1C-1.201，r＝0.9907（血漿）；Y＝0.148 9C＋0.085 8，r＝0.993 5（腦勻漿）。根據標準曲線，東莨菪堿的線性范圍為0.2～20.0ng／mL。

2.1.3 方法的回收率 將測量值與實際量比較，計算回收率，結果見表1。

2.1.4 精密度、準確度及基質效應 每一濃度進行6樣本分析，連續(xù)測定3輪，結果進行方差分析，求得準確度偏差（以相對偏差RE%為指標）不超過±6.2% ，精密度偏差（以相對標準差RSD%為指標）不超過±1.9%。按1.3.6方法計算得到的比值均在±15%之間，表明在本方法下基質效應對樣品和內標的影響可以忽略。

表1 東莨菪堿在血漿和在腦勻漿中的濃度及回收率 （±s，n＝5）

表1 東莨菪堿在血漿和在腦勻漿中的濃度及回收率 （±s，n＝5）

實際濃度（ng／mL）測定濃度（ng／mL） 回收率（%）血漿 腦 血漿 腦0.2 0.21±0.01 0.21±0.01 100.5±2.9 103.5±2.4 2.0 1.97±0.14 2.09±0.17 98.6±6.7 104.6±8.2 20.0 19.91±1.27 19.98±1.40 98.1±3.2 98.3±4.1

2.2 東莨菪堿在大鼠體內的藥物動力學和東莨菪堿乳膏的生物利用度 腹腔給藥和鼻腔給藥血藥濃度數據采用3p97藥動學程序擬合，符合兩室模型：C＝Ae-αt＋Be-βt。采用梯形法計算AUC0-480值。血藥濃度-時間曲線如圖2所示，血藥濃度-時間的各種參數見表2。比較二者AUC0-480值，鼻腔給藥對腹腔給藥的相對生物利用度為65.46%。

圖2 東莨菪堿經腹腔給藥和經鼻腔給藥后血藥濃度的藥時曲線比較

表2 東莨菪堿經腹腔給藥和經鼻腔給藥后血藥濃度的主要藥動學參數

2.3 東莨菪堿在腦中的藥物濃度 實驗比較了腹腔注射和鼻腔給藥兩種途徑使用氫溴酸東莨菪堿后大鼠腦中東莨菪堿濃度，結果表明，腹腔注射后5min即可在腦中檢測到東莨菪堿，其最高藥物濃度約4ng／mL。鼻腔給藥后腦中東莨菪堿濃度逐漸升高，最高時能超過6ng／mL，發(fā)生在給藥后30min。腦藥濃度-時間曲線如圖3所示，腦藥濃度-時間曲線的各種參數見表3。

2.4 東莨菪堿鼻腔給藥腦靶向性的評價［8-9］為了確定鼻腦之間是否存在東莨菪堿的直接轉運途徑，采用不同時間段腦藥濃度曲線下面積（AUC brain）與血藥濃度曲線下面積（AUC plasma）的比值來進行靶向性比較。鼻腔、腹腔給藥后AUC brain／AU plasma計算結果分別見表4。結果表明，在各時間段上，東莨菪堿鼻腔給藥的AUC brain／AUC plasma值都大于腹腔注射，表明鼻腔給藥時東莨菪堿入腦存在BBB以外的途徑，也就是說，部分藥物不經BBB入腦，因而有腦靶向性。

圖3 東莨菪堿經腹腔給藥和經鼻腔給藥后腦藥濃度的藥時曲線比較

表3 東莨菪堿經腹腔給藥和經鼻腔給藥后腦藥濃度的主要藥動學參數

表4 東莨菪堿經腹腔給藥和經鼻給藥后AUC brain／AUC plasma的比較（±s，n＝5）

表4 東莨菪堿經腹腔給藥和經鼻給藥后AUC brain／AUC plasma的比較（±s，n＝5）

時間區(qū)間（min） 腹腔給藥 鼻腔給藥P 0～60 0.19±0.07 0.58±0.11 ＜0.01 0～120 0.26±0.08 0.65±0.23 ＜0.05 0～240 0.15±0.04 0.75±0.20 ＜0.01 0～480 0.11±0.02 0.52±0.12 ＜0.01

3 討 論

常用的東莨菪堿為氫溴酸鹽，在給定的質譜條件下脫去氫溴酸得到東莨菪堿的分子離子峰。回收率實驗、精密度與準確度實驗表明，用東莨菪堿的分子離子（M＋＝284）峰面積為指標，內標法實驗能達到對東莨菪堿定量檢測的要求。

東莨菪堿本身有良好的脂溶性，但其氫溴酸鹽在溶液中使藥物呈離子狀態(tài)。調整溶液pH值可改善其脂溶性。有研究表明，氫溴酸東莨菪堿鼻腔給藥吸收入血的生物利用度與給藥時的pH 值有關［10］。

氫溴酸東莨菪堿腹腔給藥與鼻腔給藥的對比研究表明，兩種條件下東莨菪堿的腦藥濃度各有特點。特別是腹腔給藥后，東莨菪堿在腦內的濃度呈現雙峰。排除導致血藥濃度雙峰現象的原因［11-12］，認為導致腦藥濃度波動的可能原因來自于動物本身，比如體液pH的微小差別可導致氫溴酸東莨菪堿解離程度的不同造成藥物透過BBB的差別。另外，實驗沒有控制動物麻醉程度，而麻醉藥能改變BBB的通透性。所以，實驗不能否認麻醉是導致腹腔注射后東莨菪堿腦藥濃度不穩(wěn)定的原因之一。

有的藥物可經鼻腔直接吸收入腦，特別是小分子藥物沿嗅通路轉運入腦中的量同它們的脂溶性直接相關［13-14］。東莨菪堿分子量小，脂溶性好，具備經鼻入腦的條件。東莨菪堿腹腔注射后AUC brain／AUC plasma表示藥物從血液循環(huán)經血腦屏障BBB進入到腦組織的程度，假如只存在BBB一條轉運途徑，那么鼻腔給藥后因藥物不能瞬時入血，則鼻腔給藥的AUC brain／AUC plasma的比值應略低于腹腔給藥或與腹腔給藥相當。本研究在確認氫溴酸東莨菪堿乳膏鼻腔給藥有東莨菪堿吸收入腦的基礎上，證明氫溴酸東莨菪堿乳膏鼻腔給藥后在腦中的分布濃度接近血藥濃度的一半。通過比較不同給藥途徑下血藥濃度和腦藥濃度的藥時曲線下面積證實了東莨菪堿鼻腔給藥有腦靶向性。

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