陳倩倩 李 清 畢開順

沈陽藥科大學(xué)中藥學(xué)院中藥質(zhì)量控制技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，遼寧 沈陽 110016

茵陳為菊科植物濱蒿Artemisia scoparia Waldst.et Kit.或茵陳蒿Artemisia capillaris Thunb.的干燥地上部分。春季幼苗高6～10cm時(shí)采收或秋季花蕾長成花除開時(shí)采割，除去雜質(zhì)及老莖，曬干。春季采收的習(xí)稱“綿茵陳”［1］。綿茵陳藥理作用廣泛，具有抗病原微生物、保肝利膽、鎮(zhèn)痛消炎、降血脂、增強(qiáng)免疫、抗腫瘤等方面的活性［2］。臨床上常用茵陳蒿湯或茵陳蒿湯加減治療各種尤其是伴有細(xì)菌性感染的肝膽疾?。?］。

穿心蓮為爵床科植物穿心蓮 Andropraphis paniculata (Burm.f.)Nees的干燥地上部分［4］。梁汝堅(jiān)等［5］觀察穿心蓮內(nèi)酯注射液對成年重型上呼吸道感染有明顯的療效，同時(shí)使上呼吸道感染的病程明顯縮短。另據(jù)報(bào)道，穿心蓮內(nèi)酯類還具有抑制表皮細(xì)菌感染等功能［6］。此外，有文獻(xiàn)指出穿心蓮對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌都表現(xiàn)出不同程度的敏感性［7－8］。

臨床上，綿茵陳和穿心蓮配伍的處方比較多，本試驗(yàn)旨在考察二者配伍后對不同類型測試菌的抑制作用，并優(yōu)化出抗菌效果最佳的配伍比例，為下一步臨床用藥提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 綿茵陳、穿心蓮購自沈陽同仁堂藥房。經(jīng)沈陽藥科大學(xué)賈英副教授鑒定均為正品。滅菌蒸餾水為實(shí)驗(yàn)室自制。

1.2 培養(yǎng)基 瓊脂 (上海楚柏實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司)，MH肉湯 (杭州天和微生物試劑有限公司)，液體沙氏培養(yǎng)基(北京奧科試劑有限公司)，沙氏瓊脂培養(yǎng)基 (北京奧科試劑有限公司)，抑菌圈測量儀 (北京先驅(qū)威鋒技術(shù)開發(fā)公司)。

1.3 儀器與設(shè)備 BJ－1CD超凈工作臺，IKA RV10V/IKA RV10V－C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，LDZX－75KBS立式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌器，HZQ2F全溫振蕩培養(yǎng)箱。

1.4 菌種及培養(yǎng)條件 金黃色葡萄球菌 (Staphylococcus)、枯草芽孢桿菌 (Bacillus)、大腸桿菌 (Escherichia)和白色念珠菌 (Candida albicans)均購自中國食品藥品檢定研究院。前兩種為革蘭氏陽性菌，大腸桿菌為革蘭氏陰性菌，白色念珠菌為真菌。除白色念珠菌于沙氏瓊脂中28℃培養(yǎng)2 d外，其余菌種均于瓊脂培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)24 h活化，備用。

1.5 方法

1.5.1 植物提取物的制備 將干燥的穿心蓮藥材，粉碎，過40目篩。取藥材粉末10 g，用200 ml蒸餾水回流提取2 h，過濾，殘?jiān)?0 ml蒸餾水回流提取0.5 h，過濾，合并兩次提取液，減壓干燥濃縮成粉末，稱重，用滅菌蒸餾水稀釋成每毫升含100 mg原藥材的水提取液，干燥低溫保存，備用。

按上述方法制得相同濃度的綿茵陳水提取液。

綿茵陳、穿心蓮按照1∶1，1∶2，1∶3，1∶4，2∶1，3∶1，4∶1的質(zhì)量比稱取藥材混合粉末共10 g，按上述方法制得每毫升含有100 mg混合原藥材的水提取液。

1.5.2 菌懸液的制備 將上述活化后的供試菌種，用比濁法確定菌量至0.5麥?zhǔn)媳葷峁軡岫龋儆肕H肉湯稀釋，使其含菌量約為1×107CFU/m1，作為菌懸液，備用。

1.5.3 最低抑菌濃度 (MIC)的測定 采用8排12孔的一次性培養(yǎng)板，標(biāo)記后在每排1－11孔中各加入MH肉湯100 μl，1－10以及12號孔各加入100 μl菌懸液。每排1號孔加入原藥液100 μl，用MH肉湯采用兩倍稀釋法稀釋，使得1－10孔含藥濃度分別為 50.0、25.0、12.5、6.25、3.13、1.57、1.79、0.39、0.20、0.10 mg/ml，第11孔為純?nèi)鉁珜φ?，?2孔為純測試菌對照。將培養(yǎng)板于37℃培養(yǎng)24 h。肉眼觀察細(xì)菌生長情況，培養(yǎng)液澄清的為陰性 (即無細(xì)菌生長)，培養(yǎng)液混濁的為陽性 (即有細(xì)菌生長)。以此確定藥液的MIC值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次取平均值。

1.5.4 最低殺菌濃度 (MBC)的測定 分別從上述實(shí)驗(yàn)中肉眼觀察培養(yǎng)液陰性的孔中取50 μl，移種至相應(yīng)培養(yǎng)基的瓊脂板上。37℃恒溫培養(yǎng)24 h。觀察記錄菌落數(shù)。菌落數(shù)小于3的最低濃度即為藥材的最低殺菌濃度 (MBC)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次取平均值。

1.5.5 茵陳和穿心蓮配伍后抑菌活性 茵陳和穿心蓮配伍后抑菌活性的測定采用瓊脂擴(kuò)散法。用無菌棉簽蘸107CFU/ml的金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌以及大腸桿菌的菌懸液，分別在兩塊瓊脂平板表面均勻涂抹三次，再用無菌棉簽蘸1×107CFU/ml的白色念珠菌的菌懸液于沙氏瓊脂平板表面均勻涂抹三次，蓋好平皿，室溫干燥5 min，濾紙片10枚 (直徑6.0 mm)平放于無菌平皿內(nèi)，標(biāo)記為1－10號。在1－7號濾紙片分別滴加七種兩藥材不同配伍比例水提取液20 μl，8號滴加茵陳的水提取液20 μl，9號滴加茵陳的水提取液20 μl，10號滴加滅菌蒸餾水滴加茵陳的水提取液20 μl，以上室溫自然晾干，用無菌鑷子將樣片平鋪于平板表面，于37℃培養(yǎng)24 h后用抑菌圈測量儀測量抑菌直徑。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次取平均值。

2 結(jié)果

2.1 兩種藥材水提物的MIC、MBC值 綿茵陳和穿心蓮的水提物對4種測試菌的MIC值和MBC值見表1和表2。

表1 兩種藥材水提物對四種測試菌的MIC值

表2 兩種藥材水提物對四種測試菌的MBC值

結(jié)果顯示，綿茵陳水提物對大腸桿菌的抑菌和殺菌作用最強(qiáng)，其MIC和MBC分別為0.39 mg·ml－1和6.25 mg· ml－1。而穿心蓮水提物對大腸桿菌的抑菌作用最強(qiáng)，MIC為1.72 mg·ml－1，對金黃色葡萄球菌的殺菌作用最強(qiáng)，MBC為10.4 mg·ml。綿茵陳水提物對真菌白色念珠菌有一定的抑制作用，MIC為12.5 mg·ml－1，但是穿心蓮水提物對其未見抑制作用。

2.2 茵陳和穿心蓮配伍后抑菌活性結(jié)果 采用瓊脂擴(kuò)散法測得的兩種藥材單煎以及配伍共煎水提物的抑菌作用見表3。

表3 單味藥材及配伍后水提物的抑菌效果

由表3可見，綿茵陳和穿心蓮配伍水提物對金黃色葡萄球菌，枯草芽孢桿菌和大腸桿菌的抑菌效果均強(qiáng)于單味藥水提物，說明二者配伍后對細(xì)菌的抑制均有不同程度的協(xié)同效應(yīng)。綿茵陳與穿心蓮以1:1配伍共煎時(shí)對兩種革蘭氏陽性菌的抑制作用最強(qiáng)，兩者以3∶1配伍共煎時(shí)對大腸桿菌和白色念珠菌抑制作用最強(qiáng)。由于前面實(shí)驗(yàn)顯示穿心蓮沒有對白色念珠菌的抑制作用，兩者配伍后的水提物對其抑制作用有所增加，但是效果不是很明顯。

為進(jìn)一步驗(yàn)證兩藥材以最佳配伍比例配伍后水煎液抗菌效果和單煎液相比是否存在顯著性差異，采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，結(jié)果表明共煎液綿茵陳和穿心蓮綿茵陳配伍共煎時(shí)比二者分別單煎時(shí)對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和大腸桿菌的抑制作用明顯增強(qiáng)，具有顯著性差異。

3 討論

眾所周知，具有抗菌作用的中藥材是“天然的抗生素”。近年來隨著合成與半合成抗菌素的增多和廣泛使用，細(xì)菌耐藥性問題日趨嚴(yán)重，已成為21世紀(jì)全球關(guān)注的熱點(diǎn)［9］由于具有不良反應(yīng)小，鮮有細(xì)菌耐藥性等自身特點(diǎn)，其開發(fā)利用廣闊。而藥材之間配伍使用能大大擴(kuò)大抗菌譜和抗菌能力，有關(guān)這方面的研究甚少。

本實(shí)驗(yàn)旨在研究綿茵陳和穿心蓮兩種中藥材各自及配伍后的水提物的體外抑菌作用，從而篩選出抗菌活性最強(qiáng)的藥材配伍比例，為臨床用藥提供依據(jù)。選擇了金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌和白色念珠菌，這4種微生物分別代表了革蘭陽性菌、革蘭陰性菌、真菌，具有一定的代表性。實(shí)驗(yàn)測得的兩種藥材水提物的MIC和MBC表明，綿茵陳的水提物對以上各種測試菌都有抑菌、殺菌作用;穿心蓮的水提物對前三種菌有較強(qiáng)的抑菌殺菌作用但是對真菌白色念珠菌未見抑制作用，對其他真菌的作用有待進(jìn)一步研究。

試驗(yàn)中采用了瓊脂擴(kuò)散法來比較考察兩種藥材單煎和共煎水提物對上述測試菌的抑菌作用。結(jié)果表明，二者配伍后的水提物對測試菌的抑制作用均有不同程度的提高，其中二者1:1配伍時(shí)對兩種革蘭氏陽性菌的抑制作用最強(qiáng);綿茵陳與穿心蓮質(zhì)量比3:1配伍時(shí)對大腸桿菌和白色念珠菌抑制作用最強(qiáng)。本文考察的事水煎劑型，與臨床常用的服藥劑型相同，結(jié)果具有可借鑒性。有關(guān)兩者配伍使用后藥效成分的變化，在后續(xù)試驗(yàn)中將做進(jìn)一步研究。

［1］國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典一部［M］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:223

［2］謝韜，梁敬鈺，劉凈.茵陳化學(xué)成分和藥理作用研究進(jìn)展［J］.海峽藥學(xué)，2004，16(1):8—13.

［3］盂繁欽，吳宜艷，雷濤.茵陳的藥理作用及臨床應(yīng)用進(jìn)展［J］.牡丹江醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，30(1):46—47

［4］國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典一部［M］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:251－252

［5］梁汝堅(jiān).穿心蓮內(nèi)酯治療上呼吸道感染療效觀察［J］.廣東醫(yī)學(xué)，1998，19(6):473

［6］《全國中草藥匯編》編寫組.中國中草藥匯編 (上、下冊)［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，1976.

［7］Gupt a K K，Aneja S C，Dhar K L.Flavonoids of Andrographis Panic ulata［J］.Phytochemist ry，1983，22(1):314－315.

［8］Koteswara Rao Y，Vimalamma G，Venkata Rao C.Flavonoids and andrographolides f rom Andrographis Paniculata［J］.Phytochemist ry，2004，65:2317－2321.

［9］陳代杰.抗菌藥物與細(xì)菌耐藥性［M］.上海:華東理工大學(xué)出版社，2001.