付思祺 范金財(cái) 焦 虎 劉立強(qiáng) 甘 承 田 佳 陳文霖 楊增杰 殷竹鳴

組織擴(kuò)張與機(jī)械牽拉對(duì)皮膚組織表達(dá)硫氧還蛋白影響的初步研究

付思祺 范金財(cái) 焦 虎 劉立強(qiáng) 甘 承 田 佳 陳文霖 楊增杰 殷竹鳴

目的探討硫氧還蛋白（TXN）在擴(kuò)張皮膚組織與正常皮膚組織中的表達(dá)差異。方法選取近兩年在我院行額部擴(kuò)張器取出術(shù)的患者13例，收集患者額部擴(kuò)張器張力最大點(diǎn)（擴(kuò)張組）以及顳部行附加切口處（對(duì)照組）的全層皮膚。免疫組織化學(xué)染色、Western blot檢測TXN蛋白在擴(kuò)張皮膚組織及正常皮膚組織中的表達(dá)。結(jié)果免疫組織化學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)，擴(kuò)張皮膚組織中TXN陽性細(xì)胞明顯多于正常皮膚組織（P＜0.05）；Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，擴(kuò)張皮膚組織中TXN表達(dá)高于正常皮膚組織。結(jié)論擴(kuò)張皮膚組織中TXN蛋白表達(dá)高于正常皮膚組織，為進(jìn)一步研究TXN在組織擴(kuò)張中的作用提供理論基礎(chǔ)。

硫氧還蛋白 組織擴(kuò)張 機(jī)械應(yīng)力

自體組織擴(kuò)張術(shù)可再生出具有完全生理功能的皮膚組織，在整形外科應(yīng)用廣泛，但存在治療周期漫長、再生皮膚有限、擴(kuò)張組織轉(zhuǎn)移后易壞死和感染等缺陷[1]。前期研究中，我們采集額部擴(kuò)張器取出術(shù)中額部張力最大處皮膚（擴(kuò)張組）和顳部行附加切口處皮膚（非擴(kuò)張組），應(yīng)用基因芯片技術(shù)進(jìn)行全基因組掃描，尋找皮膚組織擴(kuò)張相關(guān)基因，共篩選出105個(gè)存在差異表達(dá)的基因，其中90個(gè)上調(diào)基因，12個(gè)下調(diào)基因，硫氧還蛋白（Thioredoxin，TXN）就是表達(dá)上調(diào)的基因之一。近年的研究發(fā)現(xiàn)，TXN在生物體內(nèi)分布廣泛，具有抗氧化、清除自由基、促進(jìn)細(xì)胞生長增殖、抑制凋亡等多種功能[2-4]，但TXN與皮膚組織擴(kuò)張的關(guān)系尚未見報(bào)道。本研究采用免疫組織化學(xué)及Western Blot蛋白半定量檢測，分析TXN與組織擴(kuò)張和機(jī)械應(yīng)力之間的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

選取2010年至2012年在我院行額部擴(kuò)張術(shù)（威寧，長形，300/400 mL）的患者13例，年齡18～30歲（平均24歲），未訴及其他疾病。每周注水一次，一般擴(kuò)張時(shí)間為3～4個(gè)月，養(yǎng)皮時(shí)間（最后一次注水至手術(shù)之間的間隔時(shí)間）一般為3～4周。擴(kuò)張期間無感染壞死及擴(kuò)張器破裂、漏液等并發(fā)癥。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組取材部位皮膚無損傷及病變。

實(shí)驗(yàn)組標(biāo)本取自擴(kuò)張皮瓣的中心位置，因該部位承受應(yīng)力強(qiáng)度最大、時(shí)間最長。對(duì)照組標(biāo)本取自顳部行附加切口處正常皮膚。兩組標(biāo)本大小一致，均為1.5 cm×0.5 cm，全厚皮，一分為二。一份切取后立即放入福爾馬林溶液保存，以行HE染色和免疫組化染色，另一份切取后立即放入液氮中，以行蛋白提取及Western Blot蛋白半定量實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)通過中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者簽署知情同意書。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

倒置相差顯微鏡 （Nikon公司），組織切片機(jī)（Leice公司，RM2135），PHY-Ⅲ病理組織漂烘處理儀 （常州中威電子儀器廠），“Tissue-Tek”TEC組織包埋機(jī)，2U2-EO型臺(tái)式干燥箱（南通科學(xué)儀器廠），組織勻漿機(jī)，分光光度計(jì)。

兔抗人TXN單克隆抗體（Epitomics公司，批號(hào)5127－1），二步法免疫組化檢測試劑（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），蛋白裂解液（碧云天生物技術(shù)研究所），鼠抗人TXN一抗（Abcam公司），兔抗人β-actin一抗（Santa Cruz公司），兔抗人PCNA一抗（Epitomics公司）。

1.3 TXN免疫組化染色

組織蠟塊4 μm連續(xù)切片，二甲苯脫蠟，無水乙醇逐步水化，抗原修復(fù)，采用二步法免疫組化染色，嚴(yán)格按說明書進(jìn)行操作。TXN一抗按1∶200稀釋，以PBS緩沖液替代一抗作為陰性對(duì)照，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水，透明，封片。TXN染色以細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)黃色或棕褐色顆粒為陽性。應(yīng)用江蘇捷達(dá)科技公司圖像采集分析系統(tǒng)，在高倍鏡下，每張切片選取陽性細(xì)胞集中的10個(gè)視野采集圖像。采用陽性細(xì)胞技術(shù)法，計(jì)數(shù)10個(gè)高倍視野下陽性細(xì)胞數(shù)，求平均值。

陽性率=陽性細(xì)胞數(shù)/（陽性細(xì)胞數(shù)+陰性細(xì)胞數(shù)）

1.4 Western blot蛋白半定量檢測

提取皮膚組織總蛋白，BCA方法測定蛋白濃度，按Western Blot檢測試劑盒操作行蛋白電泳，將蛋白條帶轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜（NC膜）上，加TXN一抗（稀釋為1∶500），加入二抗（稀釋為1∶5 000），將膜浸入發(fā)光液中，再曝光，洗膠片。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

因?yàn)闃颖緮?shù)較少（n=13），將擴(kuò)張組和對(duì)照組陽性率進(jìn)行配對(duì)的秩和檢驗(yàn)。以SPSS13.0軟件分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HE及免疫組化染色結(jié)果

HE染色發(fā)現(xiàn)，額部擴(kuò)張皮膚組織層有額肌分布（圖1）；免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)擴(kuò)張皮膚組織和正常皮膚組織的表皮層、真皮層細(xì)胞都有TXN表達(dá)（圖2），TXN蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞核中，表皮細(xì)胞、皮膚成纖維細(xì)胞、毛囊細(xì)胞、汗腺細(xì)胞的細(xì)胞核都有表達(dá)（圖3）。通過比較擴(kuò)張皮膚組織和正常皮膚組織陽性細(xì)胞和陰性細(xì)胞的比例，擴(kuò)張皮膚組織中TXN陽性細(xì)胞比例較正常組織高（P＜0.05）。

圖1 擴(kuò)張皮膚及非擴(kuò)張皮膚的組織學(xué)觀察（100×）Fig.1 Histological observation of expanded skin and unexpanded skin(100×)

圖2 免疫組織化學(xué)檢測擴(kuò)張皮膚及非擴(kuò)張皮膚中TXN的表達(dá)Fig.2 The expression of TXN in expanded skin and unexpanded skin by immuno-histochemistry staining

圖3 擴(kuò)張皮膚毛囊及汗腺中TXN的表達(dá)（400×）Fig.3 The expression of TXN in hair follicle and sweat glands of expanded skin(400×)

2.2 Western blot蛋白半定量結(jié)果

Western blot結(jié)果顯示，擴(kuò)張組皮膚組織TXN蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組升高（圖4）。

圖4 Western blot檢測擴(kuò)張組皮膚組織與對(duì)照組皮膚組織TXN蛋白的表達(dá)Fig.4 The differential expression of TXN in expanded group and control group by Western blot

3 討論

TXN是具有氧化還原活性的小分子蛋白質(zhì)，分子量為12 KD，在生物體內(nèi)分布廣泛，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、增殖、凋亡等多種生物學(xué)功能[2-4]，在皮膚抗光老化、心血管疾病、乳腺癌、肺癌等疾病的治療中均發(fā)揮重要作用。我們在前期研究中，通過基因芯片和實(shí)時(shí)定量 PCR證實(shí)，TXN基因在擴(kuò)張皮膚中表達(dá)上調(diào)，但目前尚無TXN與擴(kuò)張皮膚相關(guān)的研究報(bào)道。因此，我們擬在蛋白層面進(jìn)一步研究TXN在擴(kuò)張皮膚與正常皮膚之間是否存在表達(dá)差異。通過免疫組化及Western blot蛋白半定量檢測發(fā)現(xiàn)，擴(kuò)張皮膚組織中TXN表達(dá)高于正常皮膚組織，預(yù)示著TXN在皮膚組織擴(kuò)張過程中可能發(fā)揮著一定功能。

我們推測，TXN在皮膚組織擴(kuò)張過程中發(fā)揮了抗氧化、清除自由基的功能。研究發(fā)現(xiàn)，皮膚軟組織擴(kuò)張過程中會(huì)產(chǎn)生大量自由基，其產(chǎn)生機(jī)制包括兩方面。一方面與皮膚組織在機(jī)械壓力下缺血/再灌注有關(guān)。皮膚軟組織的每次擴(kuò)張，先壓力增加，毛細(xì)血管閉塞，導(dǎo)致急性缺血[5]。然后膠原纖維重新排列，細(xì)胞分裂增殖[6]，使擴(kuò)張皮膚變軟，加之缺血、缺氧的刺激，毛細(xì)血管增生、開放，血運(yùn)逐漸恢復(fù)。缺血/再灌流過程中，細(xì)胞進(jìn)行無氧代謝，ATP分解為腺苷酸，最后生成氧自由基。另一方面與硅膠膜的置入有關(guān)。無論是動(dòng)物還是人體，硅膠囊周圍會(huì)逐漸形成纖維囊。關(guān)于其形成機(jī)理尚不完全清楚，許多學(xué)者認(rèn)為，硅膠假體盡管化學(xué)性質(zhì)極其穩(wěn)定、組織相容性好，但仍有硅膠微粒逸出進(jìn)入假體周圍組織，尤其是直徑為10～60 μm的硅膠微粒，作為一種抗原或半抗原誘發(fā)免疫反應(yīng)，趨化吸引白細(xì)胞，白細(xì)胞膜上的還原型輔酶Ⅱ可將還原型輔酶Ⅱ的電子傳遞給氧，產(chǎn)生氧自由基[7-8]。氧自由基產(chǎn)生后，可趨化吸引白細(xì)胞浸潤，構(gòu)成惡性循環(huán)。這是纖維囊內(nèi)氧自由基的主要來源。此外，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)[9]，皮膚組織經(jīng)過擴(kuò)張后，氧自由基使生物膜上的不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化，引起長鏈反應(yīng)，使其終末代謝產(chǎn)物丙二醛（Malodialdehyde，MDA）含量增高，超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）活性下降。說明硅膠纖維囊形成過程中產(chǎn)生了氧自由基。

硫氧還蛋白系統(tǒng)包括硫氧還蛋白（TXN）、硫氧還蛋白還原酶（TXNR）、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH），是一個(gè)廣泛分布的NADPH依賴性二硫化物還原酶系統(tǒng)，在氧化還原調(diào)節(jié)和抗氧化防御中起重要的作用。因此，TXN最重要的作用就是抗氧化，能起到自由基清除劑的作用[2-4]。TXN作為一種供氫體而有著多種生物活性，自由基清除劑是其生物學(xué)活性之一。氧自由基清除劑能夠減輕組織、器官缺血造成的再灌注損傷。TXN其活性中心（Trp-Cys-Gly-Pro-Cys）的兩個(gè)Cys從二巰基到二硫鍵的可逆性反應(yīng)與體內(nèi)的氧化還原反應(yīng)密切相關(guān)。

其次，TXN在皮膚組織擴(kuò)張過程中可能參與了細(xì)胞增殖過程。因?yàn)門XN不但能清除自由基，而且具有抑制凋亡和促進(jìn)細(xì)胞生長的多重生物學(xué)作用，可促進(jìn)組織損傷后的修復(fù)與再生[2-4]。TXN也是一種具有獨(dú)特作用機(jī)制的生長因子。TXN產(chǎn)生的氧化還原反應(yīng)能控制一些轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)其與DNA結(jié)合，從而調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄。細(xì)胞內(nèi)的TXN可以作為細(xì)胞的分泌因子，發(fā)揮細(xì)胞因子樣或趨化因子樣的活性。細(xì)胞在應(yīng)激狀態(tài)下可以將TXN分泌到胞外[10]，作為自分泌和旁分沁因子保護(hù)細(xì)胞[11]，抵抗凋亡[10]，抗炎癥[12]和促進(jìn)生長[13]。Wakasugi等[13]發(fā)現(xiàn)，TXN可作為自分泌的生長因子，并與白細(xì)胞介素1和2協(xié)同作用，發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞增殖生長的功能。

免疫組化研究發(fā)現(xiàn)，TXN廣泛分布在哺乳動(dòng)物的不同組織中[14]。目前，TXN分為TXN-1和TXN-2兩類。TXN-2僅位于線粒體中[15-17]，TXN-1主要位于細(xì)胞漿[18]。目前尚未發(fā)現(xiàn)TXN-1帶有向核定位的信號(hào)序列，但仍可在腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞核中發(fā)現(xiàn)[19-20]，并且細(xì)胞在經(jīng)過H2O2[21]、PMA[22]和紫外線[23]的處理后，均會(huì)導(dǎo)致TXN-1從胞質(zhì)向胞核的遷移。TXN-1中的一個(gè)基本的區(qū)域，Lys-81、82和85可能與一個(gè)核內(nèi)定位的必需組成因子相互作用，從而使TXN-1得以進(jìn)入核內(nèi)[23]?；蛘?，TXN-1的核定位由TXN相互影響蛋白（TXNIP）介導(dǎo)，這種蛋白同時(shí)和TXN-1和定位因子α1相互作用[20-21]。TXN-1在核內(nèi)調(diào)控各種氧化還原反應(yīng)敏感的轉(zhuǎn)錄因子的活性，比如細(xì)胞核因子-κB（NF-κB），激活物蛋白1（AP-1），氧化還原反應(yīng)因子1（Ref-1）和 p53[11，24]，但是這種調(diào)節(jié)可能與細(xì)胞類型相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，擴(kuò)張皮膚組織和正常皮膚組織中TXN-1主要位于細(xì)胞核中，其細(xì)胞定位與促進(jìn)細(xì)胞增殖的具體關(guān)系并不清楚，還需要進(jìn)一步研究。

我們曾通過基因芯片和實(shí)時(shí)定量PCR證實(shí)TXN mRNA在擴(kuò)張皮膚組織中較正常組織增高。本實(shí)驗(yàn)通過免疫組織化學(xué)和Western Blot發(fā)現(xiàn)，TXN主要位于皮膚組織的細(xì)胞核中，TXN蛋白表達(dá)在擴(kuò)張皮膚組織中較正常組織高，為進(jìn)一步研究TXN蛋白與皮膚組織擴(kuò)張機(jī)制的關(guān)系，提供了新的思路和線索。

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The Differential Expression of TXN between Expanded Skin Tissue and Normal Skin Tissue in Vivo

FU Siqi,FAN Jincai,JIAO Hu,LIU Liqiang,GAN Cheng,TIAN Jia,CHEN Wenlin,YANG Zengjie,YIN Zhuming.

Ninth Department of Plastic Surgery,Plastic Surgery Hospital of Chinese Academy of Medical Sciences,Beijing 100144,China.Corresponding author:FAN Jincai(E-mail:fanjincaimd@hotmail.com).

ObjectiveTo investigate the difference of TXN protein expression between the expanded skin and the normal skin.MethodsFrom 2010 to 2012,13 patients underwent forehead expanded flap transfer were included in this study. Full-thickness skin were harvested from central forehead skin with maximum strain(expanded group)and temporal additional excision sites (control group).Immunohistochemistry and western blot were used to detect the TXN expression between the expanded skin and the normal skin.ResultsThe positive cell number of TXN in the expanded skin tissue was more than that in normal skin tissue showed by immunohistochemistry staining.Western bolt showed that the TXN expression in the expanded skin tissue is higher than in normal skin tissue.ConclusionThe TXN protein expression in expanded skin tissue is higher compared with normal skin tissue.It provides the theoretical basis for the further research of TXN function on skin tissue expansion.

Thioredoxin(TXN);Tissue expansion;Mechanical stress

R622

A

1673－0364（2013）01－0014－04

2012年11月25日；

2013年1月6日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2013.01.004

100144 北京市 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院整形外科醫(yī)院整形九科。

范金財(cái)（E-mail：fanjincaimd@hotmail.com）。