毛秀海 杜建聰 黃 慶 樊春海 鄧素輝

（中國科學院上海應用物理研究所嘉定園區(qū) 上海 201800）

超分辨光學顯微鏡的生物學應用

毛秀海 杜建聰 黃 慶 樊春海 鄧素輝

（中國科學院上海應用物理研究所嘉定園區(qū) 上海 201800）

生物學家一直渴望使用無損、可實時成像的遠場光學顯微鏡對細胞內動力學行為或者納米尺度的蛋白質-蛋白質相互作用進行研究。由于光學衍射極限的存在，傳統(tǒng)的遠場光學顯微鏡無法對200納米尺度內的這些生命活動進行觀察。近年來，克服光學衍射極限的超分辨成像技術快速發(fā)展，將分辨率提高至數(shù)十納米級別?；诔直婕夹g的熒光顯微鏡包括受激發(fā)射損耗顯微鏡(STED)、光敏定位顯微鏡(PALM)以及隨機光重建顯微鏡(STORM)。這些技術日趨成熟并成功應用于細胞生物學、微生物學、神經(jīng)生物學等研究，為整個生命科學的發(fā)展帶來全新的認識。

光學顯微鏡，超分辨，生物學，納米，蛋白質

生物學研究往往需要在活細胞條件下觀察胞內組織的活動。光學技術因其具備對生物樣品擾動最小、實時可見的優(yōu)勢，從而成為生物學觀察的重要技術手段[1–4]。遠場光學顯微鏡一直促進著人類對微觀世界的理解，并伴隨著整個生物學領域的產生和發(fā)展。三百多年以前，Hook等[4]對成像原理進行深入研究，發(fā)明了最早的光學顯微鏡。利用他發(fā)明并制作的光學顯微鏡首次觀察到細菌以及微生物，開創(chuàng)了生物學領域的新研究。常規(guī)的光學顯微鏡的橫向分辨率約200 nm，縱向分辨率400–700 nm，因此，無法觀測納米大小的許多重要的生命體，如病毒和細胞，以及生物體內的蛋白質等都無法進行觀測。為了揭示細胞內蛋白質活動和細胞微結構特征，提高光學顯微鏡分辨率成為細胞生物學發(fā)展的迫切要求。

1 超分辨成像的重要技術進展

近20年來，克服光學衍射極限的超分辨顯微鏡不斷發(fā)展，基于熒光的顯微鏡技術利用分子的熒光能級躍遷特性、熒光靈敏度高和特異性好的特點，將顯微鏡分辨率提高至納米尺度。超分辨技術的基本原則是減少或避免處在激發(fā)體積內的分子同時發(fā)射熒光。目前，超分辨顯微成像可以分為兩種方法。第一類是結合光學非線性效應對成像的照明光路進行整形，獲得小于衍射極限的熒光發(fā)光點。這類技術的典型代表是Hell等[5]提出的受激發(fā)射損耗顯微鏡(Stimulated emission of depletion microscopy, STED)。同時，STED也是第一個用來突破衍射極限的遠場光學顯微技術，其原理是采用兩束組合激光，一束激光被聚焦成正常的衍射極限焦斑，使焦斑內的熒光分子處于激發(fā)態(tài)；另一束為中心光強為零環(huán)形焦斑分布的損耗光，兩束光進行疊加，損耗光通過受激發(fā)射過程損耗周邊區(qū)域內的激發(fā)態(tài)熒光分子。因此，周邊區(qū)域內的熒光分子被淬滅，只剩下中心的熒光發(fā)光點，從而實現(xiàn)小于衍射極限的熒光發(fā)射面積。從原理上講，由于損耗光的中心光強為零，只要淬滅光足夠強，則由第一束光激發(fā)的熒光分子所占的體積可以被壓縮到極小的范圍內，極大提高熒光顯微鏡的分辨率。目前，STED顯微鏡可實現(xiàn)20 nm分辨率的免疫熒光成像和50–70 nm的熒光蛋白成像[6–17]。

第二類超分辨技術是基于單分子定位的成像方法，利用光開關熒光蛋白，光敏化或光漂白現(xiàn)象將衍射極限范圍內的單個分子在不同的時間隨機地激活，并將各個熒光分子精確定位再重組，疊加獲得超分辨圖像。該類技術通過將相互位置過于靠近而無法被傳統(tǒng)光學顯微鏡同時分辨的熒光標記分子逐個予以分別激發(fā)，使各個熒光分子所成的艾里斑像之間不再相互干擾，從而能夠對每個獨立的熒光分子逐個進行定位。這樣就可以通過提高時間分辨率，來達到改善空間分辨率的目的。這一類技術的典型代表有光敏定位顯微鏡(Photoactivation localization microscopy, PALM)和隨機光重建顯微鏡(Stochastic optical reconstruction microscopy, STORM)等。

2006年，Betzig等[18]首次使用光敏綠色熒光蛋白作為探針標記樣品，利用該光敏綠色熒光蛋白只有在405 nm的激光敏化后，才能被561 nm激發(fā)發(fā)射綠色熒光。他們首先利用低能量的405 nm激光輻照，僅敏化極稀少的光敏蛋白，再使用561 nm激光進行激發(fā)直至被記錄的分子發(fā)生光漂白。重復敏化-激發(fā)-定位-漂白過程，完成足夠多的分子被記錄。這種技術被稱為光敏定位顯微鏡(PALM)。文獻[19–29]中均介紹了該技術成果是2006年重要的研究發(fā)現(xiàn)，入選了2006年《Science》十大進展。

STORM成像方法與PALM類似，哈佛大學的Bates等[30,31]提出利用光控熒光分子可實現(xiàn)超分辨成像，即通過激光控制分子在熒光態(tài)和非熒光態(tài)之間轉換。實驗中，他們將Cy3和Cy5分子一同修飾在抗體上來標記細胞內的蛋白，用532 nm波長的激光敏化探針，632 nm波長的激光來觀察、定位，重復綠光開啟-紅光激發(fā)-定位-綠光開啟過程，記錄所有分子的位置，疊加組成一幅完整的圖像。在活細胞成像中，使用明暗轉換快速且較亮的探針標記樣品，可以讓2D成像的空間分辨率達到25 nm，而時間分辨率最快可達到0.5 s。與PALM相比，雖然兩種成像方法精度相同，但STORM可以重復記錄，對熒光分子隨機運動的影響更小[32–39]。

2 超分辨技術應用

近幾個世紀以來，遠場光學顯微鏡一直促進著人類對微觀世界的理解，并伴隨著整個生物學領域的產生和發(fā)展。盡管許多超分辨方法已經(jīng)在原理上實現(xiàn)了小于衍射極限的成像效果，但其中很大一部分技術距離生物學應用較遠，需要進一步探索和發(fā)展。在這些超分辨技術中，STED、STORM和PALM發(fā)展較早也日趨成熟，目前已經(jīng)廣泛應用于生物領域的研究，給生物學發(fā)展帶來了一些全新的發(fā)現(xiàn)。

2.1超分辨技術在細胞生物學中的應用

隨著超分辨熒光顯微鏡的發(fā)展，很多亞細胞結構，例如微管、肌動蛋白和線粒體等，被選為標準模型來驗證超分辨技術的分辨率和可靠性。這些研究不僅展現(xiàn)超分辨熒光顯微鏡的高分辨率，也說明該技術可以被用于研究分子尺度的細胞結構及相關功能。其中，胞膜蛋白以及胞膜微區(qū)的研究是超分辨技術應用的重點和難點。因為這些結構太小，無法用常規(guī)的顯微鏡觀察。而超分辨熒光顯微鏡的超分辨能力可以解決這些問題。例如，在細胞膜研究中，之前用生物化學的方法測得線粒體膜上的陰離子通道(hVDAC)是與細胞質基質中的己糖激酶-1相結合的。但Neumann等[14]用雙色STED熒光顯微方法觀察線粒體的結構，他們發(fā)現(xiàn)大部分的hVDAC并沒有與在線粒體上的己糖激酶-1相結合。這些研究充分展示了超分辨技術可以突破生物領域的瓶頸，有助于進一步認識細胞各蛋白的結構與功能。

PALM熒光顯微技術也提供新的視角來觀察質膜中的蛋白組織以及胞內細胞器。Bakshi等[40]使用該技術得到RNA聚合酶在大腸桿菌中的分布及擴散過程。同時English等[41]通過實時定位ReIA 分子的擴散活動，發(fā)現(xiàn)蛋白的活性隨著分裂周期而發(fā)生變化。Matsuda等[24]在染色質的研究中，觀察到染色質纖維結構。為了進一步提高PALM數(shù)據(jù)的空間分析能力，Burnette等[36]聯(lián)合應用PALM熒光顯微技術和雙色熒光分子標記方法，以提高成像的清晰度。并且該新方法被廣泛用于細胞受體之間相互作用的研究中。例如Betzig等[18]在研究細胞粘附蛋白的動力學過程中，用該技術準確定位兩種不同蛋白在膜上的相對位置。例外，Sherman等[42]研究了T-淋巴細胞與TCR(T-Cell antigen Receptor)結合過程(圖1)。他們清晰地觀測到在T-淋巴細胞膜上的一系列蛋白中間體和聚集體的結構變化，并且發(fā)現(xiàn)TCR信號分子存在納米尺度的功能區(qū)。這一結果擴展人們對T細胞活化機制以及TCR蛋白介導的信號復合物的形成和組織的理解。因此，PALM熒光顯微技術不僅可以突破常規(guī)方法的極限、清晰觀測分子尺度的細胞結構，而且為研究蛋白間的動態(tài)相互作用提供了更加便捷和可靠的途徑。

圖1 T-淋巴細胞與TCR結合的PALM成像Fig.1 PALM imaging of interaction between T-Cell and TCR.

STORM熒光顯微鏡也被用于觀察分子尺度的亞細胞結構。其中Bates等[31]利用STROM觀察了細胞BS-C-1的線粒體網(wǎng)絡結構，解析了觀察微管和網(wǎng)格蛋白包被單元。并且證明STORM具有相當高的分辨能力，可以突破普通熒光顯微鏡的極限，將分辨出重疊或者不能分解的細絲。而Huang等[34]進一步改進了超分辨技術，并發(fā)明新型的3D STORM顯微技術。他們結合使用共聚焦平面三維掃描技術和折射率錯配修正方法獲得了20–30 nm的橫向分辨率和50–60 nm的縱向分辨率。并且得到了清晰的細胞微管成像，也證明線粒體具有纖薄外殼以及內部空心的結構(圖2)。他們提出根據(jù)線粒體外殼形態(tài)，可將與線粒體連接的微管分為細胞內球狀分散結構和管狀交聯(lián)結構兩類。同時他們觀察到線粒體與微管之間存在尺蠖式的相互接觸模式。這為線粒體的研究及其運輸機理提供了新的視角，從而進一步研究細胞內的活動與功能。

這些結果展示了超分辨熒光顯微鏡的發(fā)展，推進了細胞生物學的研究。生物學家們期待著用超分辨顯微鏡觀察到更多的細胞亞結構。

圖2 細胞微管的STORM成像Fig.2 3D STORM image of the mitochondrial network in cell.

2.2超分辨技術在神經(jīng)生物學中的應用

自從在一個世紀之前用光學顯微鏡觀察到神經(jīng)細胞后，人們已經(jīng)知道大腦主要的工作方式是通過將信息從神經(jīng)元中的軸突傳送到樹突。而神經(jīng)元的性質與突觸結構息息相關。為研究神經(jīng)細胞的性質和功能，需要了解突觸的分子尺度的結構及其性質。實際上，突觸的功能是由一個含有數(shù)百種蛋白的蛋白工廠精確調控的。研究突觸的功能和結構需要對樹突位點上的蛋白進行精確的定位和研究。因此，完成神經(jīng)細胞的研究需要既能滿足納米尺度的分辨率，又可以與活體成像相容的方法。而超分辨熒光顯微鏡可以滿足這些苛刻的要求。

Meyer等[43]用STED熒光顯微技術發(fā)現(xiàn)AMPA受體在神經(jīng)細胞的突觸上形成一個環(huán)形的分布。Nagerl[11]則用STED顯微技術展現(xiàn)了細胞中的突觸頂端的形狀和結構。Ding等[13]用雙光子STED顯微技術觀察在深層組織樣品中的突觸頂端的形態(tài)。其中Van等[44]通過超分辨的STED熒光顯微技術，清晰地觀測到在胞吐作用中起重要作用的受體蛋白syntaxin會因靜電相互作用而被陰離子脂類PIP2緊緊包裹，并形成72 nm大小微區(qū)(圖3)。同時，他們也發(fā)現(xiàn)在缺少膽固醇時，PIP2與受體蛋白syntaxin仍能形成這種微區(qū)。這個結果說明磷脂雙分子層中的微區(qū)主要是通過蛋白與脂類的靜電作用而形成。這些結果指出蛋白在細胞膜中的活動與在胞質的活動的機理是不同的。

圖3 細胞膜成像技術Fig.3 Confocal and corresponding STED image of membrane.

除了研究在神經(jīng)元內的亞細胞結構，超分辨顯微鏡也被用來研究神經(jīng)細胞的形態(tài)。例如，Willig等[7]在突觸結合蛋白的研究中，發(fā)現(xiàn)這些蛋白在胞吐作用后仍處以團簇狀態(tài)。Hell等[45]成功地利用STED顯微鏡觀測活鼠大腦皮層神經(jīng)元及其精細的動力學過程，實現(xiàn)了高速檢測活細胞內高分辨率圖像，并且分辨率已經(jīng)提高至數(shù)十納米，遠遠突破了光學衍射極限。STED熒光顯微技術為以后神經(jīng)間相互作用的研究，提供了可靠的方法。

STORM也被用于研究突觸的分子尺度的構型。例如，Dani等[46]在神經(jīng)軸突的研究中，利用該技術成功定論地研究了神經(jīng)遞質在神經(jīng)軸突傳遞的方式以及神經(jīng)突觸在神經(jīng)細胞上的分布，并且對突觸中神經(jīng)遞質的組成成分進行了定量分析。同時隨著STORM熒光顯微技術不斷發(fā)展，3D多色STORM的方法取得了諸多成功，并成功用于研究神經(jīng)細胞中微絲和血影蛋白的組織結構中。Xu等[47]使用多色STORM熒光顯微技術觀測到微絲蛋白在軸突中形成環(huán)狀結構(圖4)，同時發(fā)現(xiàn)每兩個微絲蛋白環(huán)之間由一個血影蛋白連接，并構成一個周期性的結構。他們發(fā)現(xiàn)該環(huán)狀結構與軸突中的鈉離子通道有一定關聯(lián)，而在樹突中，沒有這種周期性的結構，而是有較長的微絲蛋白存在。

圖4 神經(jīng)突觸的3D STORM成像Fig.4 3D STORM image of actin in a dendritic region.

達到數(shù)十納米的分辨率可以研究分子級別的組織和細胞器，而幾個納米的分辨率就可以達到直接觀察分子與分子間反應的要求。盡管可以用不同的超分辨顯微鏡得到數(shù)十納米的分辨率，但由于在追蹤軸突在腦神經(jīng)的分布卻需要幾個納米的分辨率，因此仍需要更高的分辨率。隨著現(xiàn)有超分辨技術的發(fā)展，在亞神經(jīng)元的研究中會得到更直觀的結果。

2.3超分辨技術在微生物學中的應用

近幾年的研究中，對于細菌結構的認識也在不斷改變與轉型中。之前只是簡單地認為細菌體內的生物物質都是無規(guī)律、隨機分布的，但現(xiàn)在認識到細菌內的染色體分工明細、結構骨架變化不斷并且信號傳導和生物物質合成有著自己的區(qū)域。盡管如此，在光學顯微鏡下，細菌內的大部分結構都是一團陰影，因此，對于細菌內的分子構成一直處于研究初始狀態(tài)。這是因為細菌的尺寸遠小于光學顯微鏡的分辨率，因此，無法對它們進行清晰的結構成像。雖然電子顯微鏡(EM)能夠提供很高的成像分辨率，但是該技術還無法應用于細菌成像領域。這是因為在電子顯微鏡成像過程中，一般需要膠體金免疫標記方法處理細菌。但是該方法需要對細菌進行固化處理，因此會破壞細菌的內結構并影響實驗結果。因此電子顯微鏡無法進行活體成像。

將眾多的熒光標記方法與超分辨顯微鏡結合，就可以解決細菌成像問題。該方法已經(jīng)被用來研究細菌中眾多的蛋白組織結構。例如，Greenfield等[48]用PALM技術研究趨化蛋白焦油受體CheY 和CheW在大腸桿菌中的分布。Biteen等[49]在新月柄桿菌的研究中，使用PALM熒光顯微鏡給肌動蛋白的類似物MreB的成像，發(fā)現(xiàn)該蛋白結構為螺旋型。Ptacin等[50]則用類似方法研究了新月柄桿菌內的分區(qū)蛋白(Par)的功能。他們同時發(fā)現(xiàn)ATP酶與ParA形成一個狹小、線性的聚體，該聚體穿過細胞體的中間，與真核細胞中的紡錘體功能相似。其中，F(xiàn)u等[23]成功用PALM熒光顯微技術觀察了原核細胞的分裂過程，特別是FtsZ蛋白在分裂過程中的分布及功能(圖5)。他們清晰地觀測到在細胞分裂的過程中，該蛋白在細胞中間形成一個自組裝蛋白圓環(huán)。該蛋白圓環(huán)作為細胞分裂的骨架，對細胞分裂有著重要作用，并為細胞分裂研究提供了新的途徑。

圖5 FtsZ蛋白環(huán)的PALM成像Fig.5 PALM imaging of Z-ring in E. coli cells.

Wang等[51]用STORM熒光顯微技術研究H-NS蛋白在細菌中的分布及其功能(圖6)。他們發(fā)現(xiàn)H-NS蛋白與DNA結合并在染色體中形成緊湊的聚集體，將與之結合的DNA包裹在其中。由于H-NS可以與E.coli基因組的多個位點相結合，這個形成聚集體的過程可能引起細菌DNA的折疊、收縮，并充當DNA環(huán)的錨點。因此，超分辨技術可以進一步幫助研究H-NS蛋白的工作原理及其DNA的三級結構形成的過程。

超分辨熒光顯微技術在細菌細胞研究中的應用，展示了該技術在細菌研究中的巨大潛力?？紤]到對細菌中染色體和蛋白質結構的研究甚少，生物學家們期待超分辨熒光顯微鏡在未來幾年中，不斷推進微生物的發(fā)展。

圖6 H-NS蛋白在細菌中的成像Fig.6 STORM image of H-NS in E.coli.

2.4超分辨技術在其它領域中的應用

超分辨熒光顯微技術不僅可以研究細胞內的結構和作用，也可以對DNA等遺傳物質進行單分子成像和研究。由于DNA分子的長度最短僅約50 nm，所以常規(guī)的熒光成像方法無法得到清晰的圖像。Persson等[17]利用STED高分辨率的優(yōu)勢，成功地得到了單個DNA分子高質量的熒光圖像并觀測到單個DNA分子中的構想變化(圖7)。同時，他們也證明了哺乳動物線粒體的內核質粒大小相同。

STED熒光顯微技術也被廣泛用于病毒研究中。Chojnacki等[52]利用STED熒光顯微鏡研究了HIV-1(艾滋病病毒)的外殼蛋白(Env)的分布，并發(fā)現(xiàn)HIV病毒外殼蛋白(Env)的分布隨著其成熟作用而發(fā)生結構改變，并最終形成穩(wěn)定的外殼蛋白(Env)三聚體(圖8)。他們清晰地觀測到外殼蛋白Env在胞內Gag水解酶的作用下，將隨機分布在病毒表面的外殼蛋白(Env)進行重構而形成有序的外殼蛋白(Env)三聚體。在該重構作用下，病毒細胞的表面結構改變從而讓其形態(tài)成熟，并使其能夠侵入靶標蛋白CD4并繁殖。這些結果說明在病毒表面形成外殼蛋白Env在三聚體HIV-1的成熟的重要標志。這些結果不僅進一步解析HIV-1成熟的機制，也為今后消滅AIDS疾病提供了新的理論依據(jù)。

圖7 DNA成像技術Fig.7 Confocal and corresponding STED image of DNA.

3 結論及展望

生物技術和納米技術是21世紀最引人注目的研究領域，而在生命科學與納米技術走向融合的今天，研究者更關注細胞內納米尺度分子的動態(tài)過程和結構特征，超分辨熒光顯微技術應運而生，并在近20年發(fā)展飛速，激勵大批的科研工作者投身這一研究領域，并作出卓越的貢獻。

超分辨技術在生物技術應用過程中存在很多難題，如生物樣品的光毒性、活細胞快速成像的分辨率遠低于固定樣本、成像速度慢等。為了解決這些難題，近年超分辨技術的研究熱點集中于提高活細胞成像的時空分辨率。研究者繼續(xù)研發(fā)出更穩(wěn)定、效率更高、顏色多樣的熒光染料或熒光蛋白。并嘗試結合不同成像方法的優(yōu)點，旨在進一步提高精度和準確性。隨著超分辨技術的迅猛發(fā)展，生物研究者對生物有機體內生化反應過程進行實時動態(tài)的觀察將成為現(xiàn)實，對人們更加直觀的理解生命現(xiàn)象，揭示各種疾病的發(fā)病機理，探索新型藥物具有重要的意義。

1 Hell S W. Far-field optical nanoscopy[J]. Science, 2007, 316(5828): 1153–1158

2 Deng S, Chen J, Huang Q, et al. Saturated forster resonance energy transfer microscopy with a stimulated emission depletion beam: a pathway toward singlemolecule resolution in far-field bioimaging[J]. Optics Letters, 2010, 35(23): 3862–3864

3 Huang B, Babcock H, Zhuang X. Breaking the diffraction barrier: super-resolution imaging of cells[J]. Cell, 2010, 143(7): 1047–1058

4 Hook R. Micrographia[M]. London: Royal Society of London, 1664

5 Hell S W, Wichmann J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emissiondepletion fluorescence microscopy[J]. Optics Letters, 1994, 19(11): 780–782

6 Bain A J, Marsh R J, Armoogum D A, et al. Timeresolved stimulated emission depletion in two-photon excited states[J]. Biochemical Society Transactions, 2003, 31: 1047–1051

7 Willig K I, Rizzoli S O, Westphal V, et al. STED microscopy reveals that synaptotagmin remains clustered after synaptic vesicle exocytosis[J]. Nature, 2006, 440(7086): 935–939

8 Rankin B R, Kellner R R, Hell S W. Stimulated-emissiondepletion microscopy with a multicolor stimulated-Raman-scattering light source[J]. Optics Letters, 2008, 33(21): 2491–2493

9 Hein B, Willig K I, Hell S W. Stimulated emission depletion (STED) nanoscopy of a fluorescent proteinlabeled organelle inside a living cell[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2008, 105(38): 14271–14276

10 Auksorius E, Boruah B R, Dunsby C, et al. Stimulated emission depletion microscopy with a supercontinuum source and fluorescence lifetime imaging[J]. Optics Letters, 2008, 33(2): 113–115

11 Negerl U V, Willig K I, Hein B, et al. Live-cell imaging of dendritic spines by STED microscopy[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2008, 105(48): 18982–18987

12 Han K Y, Willig K I, Rittweger E, et al. Threedimensional stimulated emission depletion microscopy of nitrogen-vacancy centers in diamond using continuouswave light[J]. Nano Letters, 2009, 9(9): 3323–3329

13 Ding J B, Takasaki K T, Sabatini B L. Supraresolution imaging in brain slices using stimulated-emission depletion two-photon laser scanning microscopy[J]. Neuron, 2009, 63(4): 429–437

14 Neumann D, Beckers J, Kastrup L, et al. Two-color STED microscopy reveals different degrees of colocalization between hexokinase-I and the three human VDAC isoforms[J]. BMC Biophysics, 2010, 3(1): 4–18

15 Willig K I, Stiel A C, Brakemann T, et al. Dual-label STED nanoscopy of living cells using photochromism[J]. Nano Letters, 2011, 11(9): 3970–3973

16 Wolf T J A, Fischer J, Wegener M, et al. Pump-probe spectroscopy on photoinitiators for stimulated- emissiondepletion optical lithography[J]. Optics Letters, 2011, 36(16): 3188–3190

17 Persson F, Bingen P, Staudt T, et al. Fluorescence nanoscopy of single DNA molecules by using stimulated emission depletion (STED)[J]. Angewandte Chemie-International Edition, 2011, 50(24): 5581–5583

18 Betzig E, Patterson G H, Sougrat R, et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution[J]. Science, 2006, 313(5793): 1642–1645

19 Hess S T, Girirajan T P K, Mason M D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy[J]. Biophysical Journal, 2006, 91(11): 4258–4272

20 Flors C, Hotta J-I, Uji-I H, et al. A stroboscopic approach for fast photoactivation-localization microscopy with Dronpa mutants[J]. Journal of the American Chemical Society, 2007, 129(45): 13970–13977

21 Hess S T, Gunewardene M. In micro and nano technologies in bioanalysis: methods and protocols[M]. Lee J W, Foote R S. Eds. Totowa: Humana Press, 2009

22 Gould T J, Verkhusha V V, Hess S T. Imaging biological structures with fluorescence photoactivation localization microscopy[J]. Nature Protocols, 2009, 4(3): 291–308

23 Fu G, Huang T, Buss J, et al. In vivo structure of the E. coli FtsZ-ring revealed by photoactivated localization microscopy(PALM)[J]. PLoS One, 2010, 5(9): 12680–12695

24 Matsuda A, Shao L, Boulanger J, et al. Condensed mitotic chromosome structure at nanometer resolution using PALM and EGFP-histones[J]. PLoS One, 2010, 5(9): 12768–12780

25 Hsu C-J, Baumgart T. Spatial association of signaling proteins and F-Actin effects on cluster assembly analyzed via photoactivation localization microscopy in T cells[J]. PLoS One, 2011, 6(8): 23586–23598

26 Mlodzianoski M J, Schreiner J M, Callahan S P, et al. Sample drift correction in 3D fluorescence photoactivetion localization microscopy[J]. Optics Express, 2011, 19(16): 15009–15019

27 Lin H, Centeno S P, Su L, et al. Mapping of surface-enhanced fluorescence on metal nanoparticles using super-resolution photoactivation localization microscopy[J]. Chemphyschem, 2012, 13(4): 973–981

28 Dedecker P, Mo G C H, Dertinger T, et al. Widely accessible method for superresolution fluorescence imaging of living systems[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2012, 109(27): 10909–10914

29 Quirin S, Pavani S R P, Piestun R. Optimal 3D single-molecule localization for superresolution microscopy with aberrations and engineered point spread functions[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2012, 109(3): 675–679

30 Rust M J, Bates M, Zhuang X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM)[J]. Nature Methods, 2006, 3(10): 793–795

31 Bates M, Huang B, Dempsey G T, et al. Multicolor super-resolution imaging with photo-switchable fluorescent probes[J]. Science, 2007, 317(5845): 1749–1753

32 Huang B, Jones S A, Brandenburg B, et al. Whole-cell 3D STORM reveals interactions between cellular structures with nanometer-scale resolution[J]. Nature Methods, 2008, 5(12): 1047–1052

33 Vaziri A, Tang J, Shroff H, et al. Multilayer three-dimensional super resolution imaging of thick biological samples[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2008, 105(51): 20221–20226

34 Huang B, Wang W, Bates M, et al. Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy[J]. Science, 2008, 319(5864): 810–813

35 Wu M, Huang B, Graham M, et al. Coupling between clathrin-dependent endocytic budding and F-BAR-dependent tubulation in a cell-free system[J]. Nature Cell Biology, 2010, 12(9): 902–908

36 Burnette D T, Sengupta P, Dai Y, et al. Bleaching/blinking assisted localization microscopy for superresolution imaging using standard fluorescent molecules[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2011, 108(52): 21081–21086

37 Jones S A, Shim S-H, He J, et al. Fast, three-dimensional super-resolution imaging of live cells[J]. Nature Methods, 2011, 8(6): 499–505

38 Xu K, Babcock H P, Zhuang X. Dual-objective STORM reveals three-dimensional filament organization in the actin cytoskeleton[J]. Nature Methods, 2012, 9(2): 185–188

39 Veatch S L, Machta B B, Shelby S A, et al. Correlation functions quantify super-resolution images and estimate apparent clustering due to over-counting[J]. PLoS One, 2012, 7(2): 31457

40 Bakshi S, Siryaporn A, Goulian M, et al. Superresolution imaging of ribosomes and RNA polymerase in live Escherichia coli cells[J]. Molecular Microbiology, 2012, 85(1): 21–38

41 English B P, Hauryliuk V, Sanamrad A, et al. Single-molecule investigations of the stringent response machinery in living bacterial cells[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2011, 108(31): 365–373

42 Sherman E, Barr V, Manley S, et al. Functional nanoscale organization of signaling molecules downstream of the T cell antigen receptor[J]. Immunity, 2011, 35(5): 705–720

43 Meyer A C, Frank T, Khimich D, et al. Tuning of synapse number, structure and function in the cochlea[J]. Nature Neuroscience, 2009, 12(4): 444–453

44 Van Den Bogaart G, Meyenberg K, Risselada H J, et al. Membrane protein sequestering by ionic protein-lipid interactions[J]. Nature, 2011, 479(7374): 552–555

45 Hell S W. Microscopy and its focal switch[J]. Nature Methods, 2008, 6(1): 24–32

46 Dani A, Huang B, Bergan J, et al. Super-resolution imaging of chemical synapses in the brain[J]. Neuron, 2010, 68(5): 843–856

47 Xu K, Zhong G, Zhuang X. Actin, spectrin, and associated proteins form a periodic cytoskeletal structure in axons[J]. Science, 2013, 339(6118): 452–456

48 Greenfield D, Mcevoy A L, Shroff H, et al. Self-organization of the Escherichia coli chemotaxis network imaged with super-resolution light microscopy[J]. PLoS Biology, 2009, 7(6): 1000137–1000147

49 Biteen J S, Thompson M A, Tselentis N K, et al. Super-resolution imaging in live caulobacter crescentus cells using photoswitchable EYFP[J]. Nature Methods, 2008, 5(11): 947–949

50 Ptacin J L, Lee S F, Garner E C, et al. A spindle-like apparatus guides bacterial chromosome segregation[J]. Nature Cell Biology, 2010, 12(8): 791–798

51 Wang W, Li G W, Chen C, et al. Chromosome organization by a nucleoid-associated protein in live bacteria[J]. Science, 2011, 333(6048): 1445–1449

52 Chojnacki J, Staudt T, Bingen P, et al. Maturationdependent HIV-1 surface protein redistribution revealed by fluorescence nanoscopy[J]. Science, 2012, 338(6106): 524–528

CLCTL99

Application of super-resolution optical microscopy in biology

MAO Xiuhai DU Jiancong HUANG Qing FAN Chunhai DENG Suhui
(Shanghai Institute of Applied Physics,Chinese Academy of Sciences,Jiading Campus, Shanghai 201800,China)

Background:A noninvasive, real-time far-field optical microscopy is needed to study the dynamic function inside cells and proteins. However, the resolution limit of traditional optical microscope is about 200 nm due to the diffraction limit of light. So, it’s hard to directly observe the subcellular structures. Over the past several years of microscopy development, the diffraction limit of fluorescence microscopy has been overcome and its resolution limit is about tens of nanometers. Methods: To overcome the diffraction limit of light, many super-resolution fluoresce microcopies, including stimulated emission of depletion microscopy (STED), photoactivation localization microscopy (PALM) and stochastic optical reconstruction microscopy (STORM), have been developed. Conclusions: These methods have been applied in cell biology, microbiology and neurobiology, and the technology of super-resolution provides a new insight into the life science.

Optical microscopy, Super-resolution, Biology, Nano, Protein

TL99

10.11889/j.0253-3219.2013.hjs.36.060502

毛秀海，男，1986年出生，2008年畢業(yè)于華中科技大學，現(xiàn)為上海應用物理研究所博士研究生，從事納米科學的研究

鄧素輝，E-mail: dengsuhui@sinap.ac.cn

2013-04-03，

2013-04-20