李貴平 黃寶丹 杜 麗 韓彥江 黃 凱 劉 峰 鄭文莉 張 輝 郭琳瑯

1（南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院 廣州510515）2（南方醫(yī)科大學珠江醫(yī)院 廣州510282）

肺癌特異性靶向小分子多肽在肺腺癌放射治療中的實驗研究

李貴平1黃寶丹1杜 麗1韓彥江1黃 凱1劉 峰1鄭文莉1張 輝1郭琳瑯2

1（南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院 廣州510515）
2（南方醫(yī)科大學珠江醫(yī)院 廣州510282）

在固相合成小分子肽的過程中完成酪氨酸與cNGQGEQc的連接，采用氯胺-T法進行131I標記，構建肺腺癌NCI-H1975細胞株荷瘤裸鼠模型，隨機分成4組，分別為：131I-cNGQGEQc治療組、131I-cNAQAEQc治療組、131I治療組和生理鹽水對照組，每組5只。尾靜脈注射相應藥物后，連續(xù)30天觀測荷瘤裸鼠腫瘤移植物的大小，計算各組荷瘤裸鼠的腫瘤抑制率。研究結果表明：小分子多肽的131I標記率均大于90%，放化純度均大于95%。131I-cNGQGEQc對肺腺癌NCI-H1975細胞移植瘤具有明顯的抑制作用，治療后第30天移植瘤腫瘤抑制率為60.93%。陰性多肽131I-cNAQAEQc治療組的腫瘤抑制率為11.63%。131I治療組的腫瘤抑制率為10.70%。實驗結果表明，131I-cNGQGEQc對肺腺癌NCI-H1975細胞具有良好的親和力及明顯的靶向抑制作用，對非小細胞肺癌的靶向治療具有潛在應用價值。

肺腺癌，放射治療，肽類，碘放射性同位素，裸鼠

整合素是一類細胞膜表面糖蛋白受體家族分子，主要介導細胞與細胞之間及細胞與細胞外基質(ECM)之間的粘附[1]。它是由α和β兩條鏈通過非共價鍵連接而成的異源性二聚體跨膜糖蛋白，是細胞粘附分子家族的重要成員。研究發(fā)現(xiàn)[2,3]，受體家族至少包括18個α亞單位和9個β亞單位，共同組成20余種不同的整合素，整合素信號轉導通路在腫瘤生長、浸潤及轉移中的作用，為腫瘤的分子靶向治療提供了重要依據(jù)。研究結果表明，整合素α3在正常組織中表達較低，但在非小細胞肺癌等腫瘤組織中卻高表達[4]，整合素在肺癌細胞中的分布存在細胞特異性，這種特異性可作為識別非小細胞肺癌和小細胞肺癌細胞的標志物及作用靶分子。在成功篩選得到與肺腺癌發(fā)生特異性結合的小分子多肽cNGQGEQc基礎上，進一步證實與癌細胞表面的整合素α3β1有高度特異性和親和性，本文探討以小分子多肽cNGQGEQc為載體，標記放射性核素131I，實現(xiàn)在荷瘤動物模型上對其在動物體內的腫瘤組織的聚集及抑瘤特性進行在體觀察，評價其作為肺腺癌靶向放射治療藥物的可能性。

1 材料與方法

1.1材料

肺腺癌特異性靶向小分子多肽的氨基酸序列為cNGQGEQc，對照小分子多肽的氨基酸序列為cNAQAEQc，由蘇州中科天馬肽工程中心有限公司合成并純化。氯胺-T：分析純，由美國Sigma公司生產；Na131I溶液購自中核高通同位素股份有限公司。SN-684型放射免疫γ計數(shù)儀購自上海日環(huán)光電儀器有限公司。肺腺癌NCI-H1975細胞株購自中國科學院上海細胞庫。5–6周齡、體重18–22 g/只BALB/c nu/nu裸鼠購自廣東省實驗動物中心(許可證號：SCXK粵2011-0015)。

1.2小分子多肽的131I標記

小分子多肽的131I標記通過在多肽N-端連接酪氨酸完成，小分子多肽cNGQGEQc及cNAQAEQc與酪氨酸偶聯(lián)物制備方法、131I的標記方法及標記率的測定方法參見文獻[5]。

1.3131I標記小分子多肽的純化和放化純度測定

131I標記小分子多肽采用Sep-Pak C18反相萃取柱進行純化。首先活化C18柱，向柱內依次加入無水甲醇3 mL和生理鹽水5 mL，將標記小分子多肽反應混合液全部移入C18柱內，取0.1%三氟乙酸生理鹽水15 mL加入柱內洗去游離碘，最后取無水甲醇3 mL洗脫C18柱上的標記多肽，并收集每管1 mL，取10 μL測放射性計數(shù)，取標記峰產物作紙層析分析，計算放化純度。

1.4131I標記小分子多肽的體外穩(wěn)定性分析

取新鮮制備的131I標記小分子多肽100 μL與 1 mL新鮮人血清混勻，置于37°條件下溫育2、4、6、8、20、24 h后，分別取樣紙層析法測定其放化純度，觀察標記物的體外穩(wěn)定性。

1.5荷瘤裸鼠模型的構建

取5–6周齡雄性裸鼠，SPF條件下飼養(yǎng)。常規(guī)方法培養(yǎng)肺腺癌NCI-H1975細胞至對數(shù)生長期，用0.25%的胰蛋白酶消化，離心除去消化液，加入無血清培養(yǎng)液制成單細胞懸液，調整細胞濃度為5×106/ mL，分別于裸鼠右后肢外側皮下注射細胞懸液0.1 mL，建立肺腺癌細胞的荷瘤裸鼠模型，定期觀察腫瘤生長情況，待裸鼠腫瘤直徑長至0.8–1 cm左右時備用。

1.6標記小分子多肽在荷瘤裸鼠模型中的抑瘤作用

將20只接種肺腺癌NCI-H1975細胞后2–3周的荷瘤裸鼠隨機分為4組，即131I-cNGQGEQc治療組、131I-cNAQAEQc治療組、131I治療組和生理鹽水對照組，每組5只。各組荷瘤裸鼠分別經尾靜脈注射131I-cNGQGEQc (18.5 MBq，42 μg)、131I-cNAQAEQc (18.5 MBq，42 μg)、131I(18.5 MBq)和生理鹽水(NS)，注射體積均為0.01 mL。給藥前3 d至實驗結束，在裸鼠飲水中加入適量質量分數(shù)l%碘化鉀液，以封閉甲狀腺。治療期間觀察各組荷瘤裸鼠的活動及進食情況，治療開始后每3天用游標卡尺測量移腫瘤的長徑(L)和短徑(W)值。按照公式V(mm3) = (LW2π)/ 6計算腫瘤的體積，并計算腫瘤抑制率(IR)。IR = (V0?Vn)/V0×100%，公式中V0為生理鹽水對照組腫瘤體積，Vn為治療組腫瘤體積。治療30 d后處死全部荷瘤裸鼠，分離腫瘤及裸鼠正常器官組織，稱重后用體積分數(shù)10%甲醛溶液固定，石蠟包埋，切片后行HE染色，作常規(guī)病理檢查。

1.7統(tǒng)計學處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件包進行數(shù)據(jù)處理，實驗數(shù)據(jù)以x±SD表示，采用One-Way ANOVA分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1小分子多肽的131I標記率及放化純度測定

在最佳標記條件下，131I-cNGQGEQc及131I-cNAQAEQc的標記率分別為(90.45±2.11)%和(90.27±2.10)%。經Sep-Pak C18反相萃取柱分離純化后131I標記小分子多肽的放化純度分別為(97.36±1.29)%和(96.73±1.35)%。

2.2131I標記小分子多肽的體外穩(wěn)定性測定

在37oC下人血清中放置2、4、6、8、20、24 h后，131I-cNGQGEQc的放化純度分別為(95.07±1.10)%、(94.57±0.92)%、(94.00±0.72)%、(93.13±0.40)%、(92.17±0.59)%、(90.9±0.52)%；131I-cNAQAEQc的放化純度分別為(95.23±0.81)%、(94.33±0.81)%、(92.93±0.29)%、(91.97±0.21)%、(91.17±0.31)%、(90.03±0.11)%。體外穩(wěn)定性結果表明，131I標記小分子多肽具有良好的體外穩(wěn)定性。

2.3131I標記小分子多肽在荷瘤裸鼠模型中的抑瘤作用

各組裸鼠在接種部位均有移植瘤形成，成瘤率為100%。各組荷瘤裸鼠移植瘤體積大小在開始治療時差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。治療開始后，各組荷瘤裸鼠移植瘤的體積均表現(xiàn)為隨時間的延長而增大的趨勢；但131I-cNGQGEQc治療組與其他各組相比較，移植瘤體積的增長速度明顯延緩(見圖1)。

圖1 荷肺腺癌裸鼠移植瘤治療后腫瘤體積變化Fig.1 Volume changers of transplantation tumor by different treatments to lung adenocarcinoma-bearing mice.

治療結束時，131I-cNGQGEQc治療組與131I-cNAQAEQc治療組、131I治療組、NS對照組的腫瘤體積相比，差異有明顯統(tǒng)計學意義(P＜0.01)；而131I-cNAQAEQc治療組和131I治療組與生理鹽水對照組腫瘤體積差異則無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。與NS 對照組相比，131I-cNGQGEQc治療組、131I-cNAQAEQc治療組和131I治療組的腫瘤抑制率分別為60.93%、11.63%和10.70%。

圖2 各組移植腫瘤組織病理切片結果(×100)Fig.2 Pathological section of the transplantation tumor in each group(×100).

2.4荷瘤裸鼠移植瘤組織病理學結果

肺腺癌NCI-H1975細胞異體移植瘤的組織切片經常規(guī)HE染色、顯微鏡觀察，131I-cNGQGEQc治療組可見腫瘤組織壞死明顯，胞核溶解，細胞結構消失。而131I-cNAQAEQc治療組和131I治療組則腫瘤細胞的形態(tài)、核分裂象和腫瘤細胞的排列方式等未見明顯差異，組織病理切片結果如圖2所示。

3 討論

針對腫瘤發(fā)生發(fā)展的機制，從腫瘤細胞的特性、信號轉導的途徑以及腫瘤生長所需的環(huán)境因素等環(huán)節(jié)，尋找新的分子作用靶點，己成為抗腫瘤小分子多肽研究的熱點。為了提高多肽藥物對腫瘤細胞的殺傷作用，常將具有靶向作用的多肽與放射性核素相連接，用于體內放射靶向治療。相對于大分子抗體，小分子多肽的優(yōu)越性表現(xiàn)在可以有效避免大分子蛋白存在的穿透性差、清除緩慢、免疫源性等問題，且可有效與受體結合，標記方法和化學修飾簡單易行，具有合成方便、制作成本低及可大批量生產的特性，可見核素標記小分子多肽較抗體具有更好的臨床應用前景。近年來，與整合素αvβ3受體結合的小分子肽RGD(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)在腫瘤分子影像學和放射靶向治療研究中已成為熱點之一[1,6,7]。

整合素是廣泛存在于細胞表面的一類細胞粘附分子，介導細胞與細胞外基質間及細胞與細胞間的信息傳遞，在細胞間的粘附、增殖、分化和移動等方面發(fā)揮了重要作用，與包括肺癌在內的惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關[1–3]。采用基因芯片、基因表達限制性分析及流式細胞技術已經證實整合素α3β1在肺鱗癌和腺癌中存在表達異常，可作為非小細胞肺癌分子靶向治療的靶點[4]。利用組合化學肽庫篩選出能與肺腺癌細胞系特異性結合的小分子多肽cNGQGEQc，通過對其特異性和結構穩(wěn)定性分析，證實小分子多肽的特異性和穩(wěn)定性均較強；抗體阻斷結合實驗表明小分子多肽cNGQGEQc是通過細胞表面整合素α3β1與肺腺癌細胞發(fā)生特異性結合[8]。小分子多肽cNGQGEQc由8個氨基酸殘基組成，分子量為837.89，兩端的D型半胱氨酸通過二硫鍵形成環(huán)肽，環(huán)肽結構有助于提高小分子肽的穩(wěn)定性，減少降解的機會。對肽的活性結構分析表明，-NGXG-結構中的3個氨基酸對小分子多肽的粘附至關重要，而且小分子多肽的長度cNGQGEQc也與細胞粘附活性密切相關[8]。本實驗選擇整合素作為肺腺癌的分子靶點，以特異性識別整合素α3β1的小分子多肽cNGQGEQc作為放射性核素131I的載體，在荷肺腺癌裸鼠模型中進行小分子多肽的實驗性靶向放射治療研究。在固相合成小分子多肽的過程中直接完成cNGQGEQc與酪氨酸(Tyr)的連接，通過氯胺-T法進行131I對cNGQGEQc的放射性標記，標記方法簡單、標記效率高、體外穩(wěn)定性好，可進一步應用于腫瘤治療的研究。

考慮到放射性核素示蹤技術具有安全、可靠和無創(chuàng)性以及治療放射性核素131I發(fā)射的β射線通過電離輻射生物效應可達到抑制或殺傷腫瘤細胞的特點，本文對131I標記的cNGQGEQc在荷肺腺癌裸鼠移植瘤中的治療效果進行研究，結果表明：經單次尾靜脈注射放射性活度18.5 MBq，131I-cNGQGEQc治療組移植瘤腫瘤抑制率為60.93%；而陰性多肽131I-cNAQAEQc治療組及131I治療組的移植瘤腫瘤抑制率分別為11.63%和10.70%；提示131I-cNGQGEQc對肺腺癌NCI-H1975細胞移植瘤具有明顯的靶向抑制作用。本實驗中放射性藥物的給藥途徑為單次靜脈給藥，如能多次給藥則可獲得更好的治療效果。而且實驗中每只荷瘤裸鼠經尾靜脈注射的放射性活度為18.5 MBq[5]，下一步將繼續(xù)優(yōu)化投入的劑量以取得最佳的治療效果。本文實驗研究結果為進一步開展基于小分子多肽的特異性放射靶向診斷和治療肺癌的臨床研究提供依據(jù)。

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CLCTL99

Experimental study of radiotargeting-therapy with small molecular polypeptide in nude mice bearing lung adenocarcinoma

LI Guiping1HUANG Baodan1DU Li1HAN Yanjiang1HUANG Kai1LIU Feng1ZHENG Wenli1ZHANG Hui1GUO Linlang2

1(Nanfang Hospital,Southern Medical University,Guangzhou510515,China)
2(Zhujiang Hospital,Southern Medical University,Guangzhou510282,China)

Background:Integrin signal transduction pathways provide an important basis for molecular targeting therapy of cancerin tumor growth, infiltration and transfer. Existing research data have shown that small molecular peptide labeled with radionuclide has good clinical application prospects, but the successful researches on lung cancer have not been reported so far. It is considered that the main reason is the lack of small molecule peptide for specific targeting lung cancer. Purpose: Based on the small molecular peptide cNGQGEQc for specifically identifying integrin α3 and β1 found previously, polypeptide cNGQGEQc is selected and radiolabelled with131I. And the inhibitory effect of131I-cNGQGEQc in nude mice bearing lung adenocarcinoma is observed. Methods: The coupling of cNGQGEQc and tyrosine was done in the processing of solid phase synthesis of small molecular peptide. Chloramine-T method was used for radiolabelling of cNGQGEQc with131I. Twenty nude mice bearing NCI-H1975 were built and randomly divided into four groups with five mice in each group, including the group of131I-cNGQGEQc, the group of131I-cNAQAEQc, the group of131I and the saline control group. The general condition was observed in nude mice bearing tumor after tail vein injection of corresponding drugs. And the tumor sizes after grafting were measured per 3 days in 30 days. The inhibitory rate of tumor in each group was calculated. Results: The labeling efficiencies of131I-cNGQGEQc and131I-cNAQAEQc were greater than 90% with the radiochemical purity of more than 95%, and131I-cNGQGEQc had obvious inhibitory effect for transplantation tumor in nude mice bearing NCI-H1975 adenocarcinoma of lung. After a treatment for 30 days the tumor inhibitory rates were 60.93% for the group of131I-cNGQGEQc, 11.63% for the group of131I-cNAQAEQ and 10.70% for the group of131I. Conclusion:131I-cNGQGEQc has a good affinity and effective inhibit effect for the NCI-H1975 lung adenocarcinoma. Integrin is a promising targeting therapy agent for non-small cell lung cancer.

Lung adenocarcinoma, Radiotherapy, Peptides, Iodine radioisotopes, Mice nude

TL99

10.11889/j.0253-3219.2013.hjs.36.060301

廣東省科技計劃項目(2012B031800391)和南方醫(yī)院院長基金項目(2012Z008)資助

李貴平，男，1962年出生，1999年于上海第二醫(yī)科大學獲博士學位，中國科學院上海應用物理研究所博士后，主任醫(yī)師，從事分子

影像學和腫瘤核醫(yī)學的研究

2013-03-26，

2013-04-18