李明浩 侯金艷 吳麗芳

60Co γ射線對小麥愈傷組織的誘變效應(yīng)研究

李明浩 侯金艷 吳麗芳

（中國科學(xué)院合肥物質(zhì)科學(xué)研究院 中國科學(xué)院離子束生物工程學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 合肥 230031）

創(chuàng)造新的種質(zhì)資源材料，對于加速小麥遺傳改良研究具有重要意義。利用60Co γ射線對小麥幼胚愈傷組織進(jìn)行5?30 Gy劑量的輻照處理，并對其生物學(xué)效應(yīng)進(jìn)行研究。結(jié)果表明，輻照處理對小麥幼胚愈傷組織的分化產(chǎn)生很大影響，隨輻照劑量增大，愈傷組織的分化率逐漸下降。對M2代分離群體進(jìn)行觀察，獲得葉片、莖稈、株型和穗型等形態(tài)性狀發(fā)生變異的突變體，以及生育期等生理性狀發(fā)生改變的變異株。這些突變體材料為小麥新品種的選育及其功能基因組學(xué)研究提供了很好的基礎(chǔ)材料。

小麥，愈傷組織，60Co γ射線，誘變效應(yīng)

小麥?zhǔn)莾H次于水稻的第二大糧食作物，發(fā)展小麥生產(chǎn)在我國糧食生產(chǎn)中占有舉足輕重的地位，對人民生活水平的提高更是具有重大的影響[1]。種質(zhì)資源是遺傳育種的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，多年來在小麥育種上由于對已有種質(zhì)資源的反復(fù)利用，使得可供利用的優(yōu)異種質(zhì)資源的范圍非常狹窄。因此，生產(chǎn)上迫切需要不斷發(fā)現(xiàn)和創(chuàng)造新種質(zhì)、新材料。

輻射誘變是創(chuàng)造小麥新的種質(zhì)資源和培育新品種的主要途徑之一。誘變育種能夠有效地誘發(fā)基因發(fā)生突變，引起各個性狀的變異，從而創(chuàng)造出更多新的種質(zhì)類型[2]。60Co γ射線是目前應(yīng)用最為廣泛的物理誘變劑，育種成效較為顯著[3]。孫繼堂等用60Co γ射線照射春小麥8131，創(chuàng)造了一批理想的優(yōu)質(zhì)小麥種質(zhì)資源，有的籽粒蛋白質(zhì)和賴氨酸含量分別達(dá)21.20%和0.48%[4]；王彩萍等[5]用60Co γ射線處理“農(nóng)大179”小麥品種，最終獲得超大粒、綜合性狀優(yōu)良、高糊化溫度、類似糯麥的新材料；Singh等[6]用10?100 Gy劑量處理小麥種子，獲得一批株高明顯降低，產(chǎn)量水平得到明顯提高的新突變體材料；Pang等[7]用60Co γ射線處理野牛草種子，獲得高度顯著變小，分蘗數(shù)、株高、葉長和葉寬均小于對照的突變體材料。

輻射誘變技術(shù)與組織培養(yǎng)相結(jié)合的育種體系是近年來研究者倍受關(guān)注的一個重要育種手段，它可以有效提高植物在染色體水平上的變異率，有利于打破基因間的性狀連鎖并促進(jìn)基因有效重組，從而擴(kuò)大變異范圍，縮短育種周期，最終獲得新的種質(zhì)資源材料[8]。宣云用γ射線處理水稻愈傷組織，從后代中獲得多種新的種質(zhì)資源材料[9]。目前，利用小麥幼胚愈傷組織進(jìn)行輻射誘變的報(bào)道還不是很多，且不同的小麥品種之間存在嚴(yán)重的基因型差異。本研究以小麥品種揚(yáng)麥158幼胚愈傷組織為材料，通過60Co γ射線進(jìn)行照射處理，探討不同劑量對其分化及形態(tài)變異產(chǎn)生的影響，以期為小麥愈傷組織輻射誘變體系完善及其新種質(zhì)的創(chuàng)造提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)材料為普通小麥(Triticum aestivum L.)品種揚(yáng)麥158，種植于合肥科學(xué)島試驗(yàn)基地。

1.2培養(yǎng)基

愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+2,4-D 2.0 mg·L?1+蔗糖30 g·L?1+瓊脂8 g·L?1，pH值5.8；繼代培養(yǎng)基同誘導(dǎo)培養(yǎng)基；分化1培養(yǎng)基為MS+ZT 1.0 mg·L?1+IAA 0.5 mg·L?1+蔗糖30 g·L?1+瓊脂8 g·L?1，pH值5.8；分化2培養(yǎng)基為MS+ZT 0.5 mg·L?1+IAA 0.5 mg·L?1+蔗糖30 g·L?1+瓊脂8 g·L?1，pH值5.8；生根培養(yǎng)基為1/2 MS+IAA 1.0 mg·L?1+PP3330.5 mg·L?1+蔗糖30 g·L?1+瓊脂8 g·L?1，pH值5.8。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

將小麥開花后15 d左右的幼嫩種子作消毒處理，挑取幼胚接種在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，進(jìn)行愈傷誘導(dǎo)，培養(yǎng)2周后轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)基進(jìn)行繼代培養(yǎng)2?3 d。輻照處理在安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院輻照中心進(jìn)行，輻射源為60Co γ射線，將樣品隨機(jī)分為六組，其中五組分別進(jìn)行5 Gy、10 Gy、15 Gy、20 Gy、30 Gy的輻照處理，劑量率為10 Gy·min?1；另一組不輻照，作為對照組。愈傷組織經(jīng)2周的恢復(fù)培養(yǎng)后轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基進(jìn)行分化培養(yǎng)。將高為2?4 cm的小苗移植于生根培養(yǎng)基，經(jīng)過20 d左右生根培養(yǎng)，煉苗后移栽于大田生長。至M2代群體中，田間觀察株型、穗型、葉色等各種變異性狀。

2 結(jié)果與分析

2.160Co γ射線對愈傷組織誘導(dǎo)和分化的影響

小麥幼胚愈傷組織在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上的正常誘導(dǎo)率可達(dá)95%以上。經(jīng)過60Co γ射線處理后，愈傷組織的生長受到限制，分化率明顯降低(圖1)。與對照組相比，20 Gy輻照處理組的愈傷組織的顏色變暗淡明顯。選取較好的胚性愈傷組織置于分化培養(yǎng)基上進(jìn)行分化培養(yǎng)，結(jié)果顯示，隨輻照劑量增大，愈傷組織的分化生長情況呈下降趨勢(圖2)。

圖1 不同輻照處理?xiàng)l件下小麥幼胚的愈傷分化率Fig.1 Differentiation rates of the callus at different irradiation doses.

圖2 不同輻照處理?xiàng)l件下愈傷組織的分化情況Fig.2 Differentiation of callus at different irradiation doses. (a) Control, (b) 5 Gy, (c) 10 Gy, (d) 15 Gy, (e) 20 Gy, (f) 30 Gy

2.260Co γ射線對再生苗生根培養(yǎng)的影響

發(fā)達(dá)的根系是組培苗能夠移栽成活的關(guān)鍵。然而，與對照組相比，各劑量組的組培苗生根效率并無顯著變化，其生根時間也無明顯改變。

圖3 輻照處理?xiàng)l件下再生苗變異情況Fig.3 Variations of regrowth at different irradiation doses. (a) Control, (b) 15 Gy, (c) 20 Gy

2.3再生苗變異植株的初步篩選

從植株發(fā)生變異的角度出發(fā)，發(fā)現(xiàn)當(dāng)劑量達(dá)到15 Gy以上時，再生苗出現(xiàn)變異的幾率相對較大。最明顯的性狀為：葉片扭曲、顏色變深、節(jié)間變短等(圖3)。

2.4輻照處理對后代農(nóng)藝性狀的影響

由表1，不同輻照劑量對后代性狀變異的影響不同。30 Gy組的后代性狀的總變異率最高(25.17%)，5 Gy組最低；同時發(fā)現(xiàn)，在不同劑量處理后代中，以葉片、矮化及穗型變異數(shù)最多，可能γ射線處理后代更容易產(chǎn)生上述性狀的突變。

2.4.1 穗部性狀變化

輻照處理對穗部性狀的變化主要有：大穗型、小穗型、密穗型、稀穗型、包頸穗等。同時，也發(fā)現(xiàn)一些無芒穗和結(jié)實(shí)率降低的育性較差穗等(圖4)。

表1 不同輻照劑量處理對M2代植株性狀變異的影響Table 1 Various mutant types obtained in M2 populations derived from different irradiation doses.

2.4.2 育性突變

育性變異主要為全不育和半不育。在突變?nèi)后w中發(fā)現(xiàn)大量育性發(fā)生變化的突變體。其中，大部分為完全不育突變，占整個不育突變體的98%，僅有1株為半不育突變體(圖5)。

2.4.3 葉片性狀突變

葉片性狀突變主要包括葉型突變和葉色突變兩種類型。在突變后代群體中發(fā)現(xiàn)的葉型變異主要有窄葉、寬葉、卷型葉等。突變?nèi)后w后代中發(fā)現(xiàn)最多的是葉色突變，特別在幼苗期出現(xiàn)較多的白化苗，由于缺乏葉綠素，后期陸續(xù)逐漸死亡；另外，我們發(fā)現(xiàn)一些部分葉片呈現(xiàn)黃綠條紋、白綠相間或白中帶紅的葉色突變嵌合體。部分植株在苗期黃化現(xiàn)象不是特別明顯，但至抽穗期，其旗葉會發(fā)生部分黃化現(xiàn)象(圖6)。

圖5 輻照處理后代不育突變體Fig.5 Male sterile lines after radiation treatments. (a) Control, (b) and (c) The mutants of male sterile

圖6 輻射處理后代葉片性狀變異情況Fig.6 Variations of leaf traits after radiation treatments. (a) Control, (b)?(f) The mutants of leaf traits

2.4.4 感病性狀突變

感病突變體是進(jìn)行抗病相關(guān)基因克隆和功能研究的很好材料。經(jīng)不同劑量處理后，與對照組相比，我們獲得一些高感小麥白粉病和條銹病的感病突變體。這些突變體材料田間自然發(fā)病情況較為嚴(yán)重，感病性較強(qiáng)(圖7)。

圖7 輻射處理后代感病性狀變異情況Fig.7 Variations of susceptible mutant after radiation treatments. (a) Control, (b) and (c) The mutants of susceptible line

2.4.5 株型性狀突變

在輻射誘變后代群體中，發(fā)現(xiàn)多種類型的株型突變體材料(圖8)。主要包括匍匐型、半匍匐型、散生型、多分蘗型等。其中，半匍匐型突變體占主要部分，分蘗角度與對照組相比明顯增加。另外，在群體中還發(fā)現(xiàn)一株單稈突變體，可以作為研究小麥分蘗的優(yōu)良材料。

圖8 輻射處理后代株型性狀變異情況Fig.8 Variations of plant types after radiation treatments. (a) Control, (b) and (c) The mutants of plant type

3 討論

輻射誘變是創(chuàng)造植物新的種質(zhì)資源快速有效的方法之一，它不僅可以快速創(chuàng)造新的種質(zhì)材料，而且不存在任何的生物安全隱患問題[10]。植物組織培養(yǎng)在離體培養(yǎng)過程中會產(chǎn)生體細(xì)胞無性系變異，輻照處理離體培養(yǎng)物可以大幅提高變異頻率。因此，將輻射誘變與離體培養(yǎng)相結(jié)合可以獲得更加豐富的變異[11]。輻射誘變首先要確定適合不同外植體的最佳適宜劑量，在一定范圍內(nèi)增加輻照劑量可有效提高外植體的突變率，但劑量過高會對外植體造成很大的傷害以致成活率下降[12]。本研究表明，隨著劑量增大，小麥幼胚愈傷組織的分化效率和生長狀態(tài)逐漸降低。20 Gy和30 Gy組的再生苗生長狀況和變異情況發(fā)生較大改變，主要表現(xiàn)為苗高、葉型等突變性狀增多，說明這兩種輻射劑量比較合適，可能誘發(fā)后代產(chǎn)生各種突變體。溫之雨等研究結(jié)果表明，用10 Gy劑量處理小麥品種石4185、石5093幼胚愈傷組織，可以獲得較多的突變體[13]；詹亞光等研究表明，用不同劑量的γ射線對白樺組培苗葉片愈傷組織分化率進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)最佳劑量為20 Gy[14]；Bovi等研究發(fā)現(xiàn)，用10 Gy的低劑量處理胡蘿卜種子，所有處理的根重都比對照高[15]。我們發(fā)現(xiàn)，適宜的劑量有利于創(chuàng)造出更加豐富的變異。同時說明，不同的植物及其外植體對輻照劑量的敏感性也存在一定的差異。

生物體在含水量較高的情況下對輻照處理的敏感性較大，含水量較高，植株對射線的敏感度也較高[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，輻照處理對愈傷組織的分化有一定的影響，對再生苗生根及移栽成活率的影響不是很大，這與劉麗強(qiáng)等的研究認(rèn)為輻照處理會嚴(yán)重影響生活力、再生苗的生根率和移栽成活率不太一致[17]。另外，通過對γ射線處理愈傷組織產(chǎn)生后代變異情況分析，發(fā)現(xiàn)輻照處理與組織培養(yǎng)相結(jié)合確實(shí)可以提高植株變異的頻率，特別是對株型、葉型及株高和成熟期等形狀的影響。這可能是體細(xì)胞無性系變異與輻射誘變相互補(bǔ)充，從而增加了變異的來源，提高了變異的頻率。

本研究通過60Co γ射線誘變處理獲得了大量在育種實(shí)踐中具有特殊應(yīng)用價值的材料，如大穗、葉型、株型等，這些為進(jìn)一步研究小麥相關(guān)功能生物學(xué)提供了很好的研究材料。這些性狀在后代中能否繼續(xù)穩(wěn)定遺傳下去，還有待進(jìn)一步觀察和鑒定。

1 郭天財(cái). 我國小麥生產(chǎn)發(fā)展的對策與建議[J]. 中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào), 2001, 3(4): 27?31

GUO Tiancai. Countermeasures and suggestions for the development of wheat production in China[J]. Review of China Agricultural Science and Technology, 2001, 3(4): 27?31

2 申慧芳, 李國柱. 紅小豆γ射線輻照誘變效應(yīng)的研究[J].核技術(shù), 2012, 35(9): 686?691

SHEN Huifang, LI Guozhu. Gamma-ray mutagenic effect on adzuki bean and the optimum dose[J]. Nuclear Techniques, 2012, 35(9): 686?691

3 韋祖生, 李開綿. 作物誘變育種及突變體鑒定與篩選研究進(jìn)展[J]. 江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2007, 19(10): 38?41

WEI Zusheng, LI Kaimian. Progress in crop mutation breeding and identification and screening of mutagenesis[J]. Acta Agriculturae Jiangxi, 2007, 19(10): 38?41

4 孫繼堂, 司愛香, 尚勛武, 等. 輻射誘變選育春小麥高蛋白質(zhì)種質(zhì)資源[J]. 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 1996, 5(3): 27?30

SUN Jitang, SI Aixiang, SHANG Xunwu, et al. Developing high protein germplasm by γ-ray induction in spring wheat (T. aestivum L.)[J]. Acta Agriculturae Jiangxi, 1996, 5(3): 27?30

5 王彩萍, 許琦, 徐杰, 等.60Co γ輻射處理“農(nóng)大179”M2代性狀變異類型分析[J]. 核農(nóng)學(xué)報(bào), 2006, 20(5): 361?364

WANG Caiping, XU Qi, XU Jie, et al. Mutant type analysis in M2of common wheat “NONGDA179”induced by irradiation[J]. Journal of Nuclear Agricultural Sciences, 2006, 20(5): 361?364

6 Singh B, Datta P S. Gamma irradiation to improve plant vigour, grain development, and yield attributes of wheat[J]. Radiation Physics and Chemistry, 2010, 79(2): 139?143

7 Pang D Q, Li J, Zhang Y W, et al. Mutagenic effect of60Co γ-ray irradiation on Turf characteristics of Buchloe dactyloides (Nutt.) Engelm[J]. Agricultural Science and Technology, 2012, 13(6): 1247?1250

8 洪亞輝, 朱兆海, 黃璜, 等. 菊花組織培養(yǎng)與輻射誘變的研究[J]. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2003, 6: 457?461

HONG Yahui, ZHU Zhaohai, HUANG Huang, et al. On tissue culture and irradiation variation of chrysanthemum[J]. Journal of Hunan Agricultural University (Natural Sciences), 2003, 6: 457?461

9 宣云. γ射線輻照粳稻愈傷組織后代突變體的篩選[J].中國農(nóng)學(xué)通報(bào), 2010, 26(6): 39?42

XUAN Yun. The screening of mutants for plant progeny of Japonica rice callus induced by γ-ray irradiation[J]. Chinese Agricultural Science Bulletin, 2010, 26(6): 39?42

10 楊兆民, 張璐. 輻射誘變技術(shù)在農(nóng)業(yè)育種中的應(yīng)用與探析[J]. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué), 2011, 30(1): 87?91

YANG Zhaomin, ZHANG Lu. Radiation mutation breeding in agriculture technology application and analysis[J]. Genomics and Applied Biology, 2011, 30(1): 87?91

11 蔡其華, 高明蔚, 梁竹青. 離體誘變改良雜交水稻的研究[J]. 核農(nóng)學(xué)報(bào), 1990, 4(3): 169?174

CAI Qihua, GAO Mingwei, LIANG Zhuqing. In vitro culture mutagenesis for hybrid rice improvement[J]. Journal of Nuclear Agricultural Sciences, 1990, 4(3): 169?174

12 廖飛雄, 潘瑞熾.60Co γ輻射對菜心種子萌發(fā)和幼苗生長的效應(yīng)[J]. 核農(nóng)學(xué)報(bào), 2001, 15(1): 6?10

LIAO Feixiong, PAN Ruichi. The effects of seeds irradiation with60Co γ-ray on seed germination and shoot growth of Brassica campetris L. ssp. Chinensis var. utilis[J]. Journal of Nuclear Agricultural Sciences, 2001, 15(1): 6?10

13 溫之雨, 張艷敏, 郭北海, 等. 小麥幼胚愈傷組織輻照后代的遺傳變異分析[J]. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2000, 23(1): 12?15 WEN Zhiyu, ZHANG Yanmin, GUO Beihai, et al. The genetic variance of plant progeny induced from the immature embryos treated with γ-rays[J]. Journal of Agricultural University of Hebei, 2000, 23(1): 12?15

14 詹亞光, 唐敬軒, 齊鳳慧, 等.60Co γ誘變對白樺愈傷組織再生的影響及再生植株染色體數(shù)量變異分析[J].東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2008, 36(1): 16?17

ZHAN Yaguang, TANG Jingxuan, QI Fenghui, et al. Effect of60Co γ ray irradiation on callus regeneration of Betula platyphylla and variation in chromosome number of its olantlets[J]. Journal of Northeast Forestry University, 2008, 36(1): 16?17

15 Bovi J E, Valter A, Neto J T. Use of low doses of cobalt-60 gamma radiation on carrot seeds and their effects on plant growth and yield[J]. Acta Hortcultural(ISHS), 2003, 607: 41?43

16 王晶, 劉錄祥, 趙世榮, 等.60Co γ射線對菊花組培苗的誘變效應(yīng)[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào), 2006, 14(2): 241?244

WANG Jing, LIU Luxiang, ZHAO Shirong, et al. Effect of60Co γ rays on in vitro mutagenesis of chrysanthemum morifolium Ramat[J]. Journal of Agricultural Biotechnology, 2006, 14(2): 241?244

17 劉麗強(qiáng), 劉軍麗, 張杰, 等.60Co γ輻射對觀賞海棠組培苗的誘變效應(yīng)[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2010, 43(20): 4255?4264

LIU Liqiang, LIU Junli, ZHANG Jie, et al. Mutagenic effects on tissue culture plants of ornamental crabapple induced by60Co γ irradiation[J]. Scientia Agricultura Sinica, 2010, 43(20): 4255?4264

CLCTL99

Mutagenic effects of wheat callus induced by60Co γ-ray irradiation

LI Minghao HOU Jinyan WU Lifang
(Key Laboratory of Ion Beam Bioengineering, Hefei Institutes of Physical Science, Chinese Academy of Sciences, Hefei 230031, China)

Background:Creation of new germplasm derived from wheat can accelerate the genetic breeding of wheat.Purpose:Samples of the callus from immature embryo were irradiated by60Co γ-ray to study their biological effects.Methods:The calluses were irradiated at the doses of 5 Gy, 10 Gy, 15 Gy, 20 Gy and 30 Gy (dose rate 10Gy/min). And the physiological characters in M2generation were observed.Results:The results showed that the rates of callus differentiation decreased with the increasing of doses. Morphological variations including leaf, stalk, plant type, panicle type and various physiological characters were observed in the M2generation.Conclusion:The mutants were helpful for gene identification and gene functional analysis, and for breeding of new wheat variety as well.

Wheat, Callus,60Co γ-ray, Mutagenic effects

TL99

10.11889/j.0253-3219.2013.hjs.36.120203

作物生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金(2012KF09)、中國科學(xué)院技術(shù)生物所聯(lián)合青年基金(Y29LH24892)資助

李明浩，男，1983年出生，2010年于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)獲碩士學(xué)位，助理研究員，研究方向?yàn)樾←溳椛湔T變遺傳育種

2013-07-03，

2013-09-11