李銀平,王 進(jìn),于 源,王 鵬
(中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東青島266003)
滸苔(Enteromorpha prolifera)分類學(xué)上屬綠藻門(Chlorophyta),石莼目(Ulvales),石莼科(Ulvaleae),滸苔屬(Enteromorpha)[1]。由于近年來海水營養(yǎng)成分發(fā)生變化,滸苔泛濫,影響海洋生態(tài)環(huán)境,國家每年投入大量的人力財(cái)力來處理這種“海洋垃圾”。當(dāng)今,滸苔的防治與應(yīng)急處理已經(jīng)成為海洋國家亟待解決的難題,同時(shí)滸苔的無害化、高值化利用成為當(dāng)今研究的熱點(diǎn)。
滸苔含有作物所需的豐富營養(yǎng)物質(zhì)和多種活性物質(zhì),其中蛋白含量為9%~14%,脂肪1.04%,灰分32%~36%[2-3]。另外,還含有滸苔活性多糖、藻朊酸和脂肪酸等小分子有機(jī)物及鈣、鎂、碘、鋅等微量元素[4]。滸苔已經(jīng)在農(nóng)業(yè)、飼料、食品、醫(yī)藥得到研究和應(yīng)用。滸苔的營養(yǎng)成分豐富,能夠?qū)⑵浣到庾鳛榉柿蠎?yīng)用到農(nóng)業(yè)中,即解決了“海洋垃圾”,又為現(xiàn)代農(nóng)業(yè)增加了一種高效有機(jī)類肥料。如何才能將滸苔降解,菌種的選擇是關(guān)鍵因素。目前廣泛研究的發(fā)酵肥料菌屬有:放線菌、固氮菌、芽孢桿菌、酵母菌、光合細(xì)菌、霉菌等。降解的底物一般為纖維素、蛋白質(zhì)、碳水化合物、礦物質(zhì)復(fù)合物等。例如,顏霞等[5]從堆腐過程中的雙孢菇培養(yǎng)基質(zhì)中分離出了高溫降解纖維素的放線菌;劉紅艷等[6]從土壤中分離篩選出強(qiáng)解磷細(xì)菌和強(qiáng)解鉀細(xì)菌;牛四坤等[7]從魚池塘泥中篩選出了可高效降解水體中蛋白質(zhì)的菌株;趙妍嫣等[8]從土壤中篩選出多個(gè)降解淀粉的菌株。從以上研究可知,要想獲得良好的發(fā)酵效果,篩選出具有較強(qiáng)降解能力的目的菌株尤為重要。本文從腐爛滸苔中篩選出三株降解菌,為進(jìn)一步研究滸苔發(fā)酵并應(yīng)用于農(nóng)業(yè)肥料奠定了基礎(chǔ)。
近年來,過量無機(jī)肥料的施入,導(dǎo)致土壤肥力大幅度下降,有機(jī)質(zhì)降低,微生物菌群數(shù)量降低等一系列問題[9]。為改善土壤結(jié)構(gòu),綠色肥料的概念漸漸深入到農(nóng)業(yè)之中,并越來越受到國家的重視。新興的海藻肥料是繼化肥、秸稈糞便生物肥、有機(jī)肥之后的第四代肥料[10]。國內(nèi)對于海藻肥料的研究還處在未成熟階段,市場上海藻肥品種較少。本文利用自主篩選的混合微生物菌劑,將滸苔降解成易于作物吸收的小分子物質(zhì),并配合有機(jī)輔料配制成一種營養(yǎng)元素多樣,有效成分含量豐富的滸苔生物有機(jī)肥。本文在滸苔發(fā)酵及其對作物品質(zhì)方面的研究,為海藻肥料的廣泛使用提供科學(xué)的依據(jù)和參考。
初篩培養(yǎng)基 孟加拉紅和牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基;復(fù)篩培養(yǎng)基 新鮮滸苔5g,酵母膏1g,磷酸氫二鉀2g,硫酸鎂0.5g,氯化鈣0.1g,氯化鈉10g,水1000m L,pH 7.0;腐爛滸苔 山東青島棧橋附近收集;新鮮滸苔 中國海洋大學(xué)生物工程開發(fā)有限公司提供;黃腐酸鉀、硅藻土、腐植酸、膨潤土、酵母發(fā)酵液干燥粉等輔料、櫻桃蘿卜種及供試土地 青島海夢圓有機(jī)農(nóng)場提供,經(jīng)測定其土壤農(nóng)化成分含量為:總氮0.21%,總磷0.18%,總鉀0.30%,有機(jī)質(zhì)2.4%,pH 7.1。
DNP-9052型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;LDZX-40B I型立式蒸汽滅菌鍋上海申安醫(yī)療器械廠;2720ThermalCycler型PCR擴(kuò)增儀 Eppendorf Inc;DYY-2C型核酸電泳儀 北京市六一儀器廠;Tanon-4200型紫外凝膠成像儀 上海天能科技有限公司;Adventuer電子精密天平 奧克斯國際貿(mào)易公司;電子游標(biāo)卡尺 臺灣寶工實(shí)業(yè)有限公司;722型可見分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司;HH.S21-4電熱恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市宏華儀器廠。
1.2.1 發(fā)酵菌種的篩選和鑒定
1.2.1.1 發(fā)酵菌種的初篩 將收集的腐爛滸苔用無菌水進(jìn)行梯度稀釋至10-3、10-4、10-5、10-6,并涂布于初篩培養(yǎng)基上,30℃恒溫倒置培養(yǎng)。挑選出在平板上生長快,菌落大的單菌落。將分離的單菌落進(jìn)行劃線分離,進(jìn)一步鏡檢并保存初篩菌株。
1.2.1.2 發(fā)酵菌種的復(fù)篩 將初篩后的菌種接種至復(fù)篩培養(yǎng)基中,30℃培養(yǎng)。觀察滸苔的斷裂情況。并對菌種進(jìn)行連續(xù)傳代培養(yǎng),將具有較高活性的菌種進(jìn)行斜面保存。
1.2.1.3 堆肥實(shí)驗(yàn) 以滸苔為原料,通過添加尿素調(diào)節(jié)發(fā)酵用物料的C/N為30∶1,利用復(fù)篩后的菌劑與本實(shí)驗(yàn)室已有的米曲霉對物料共同進(jìn)行復(fù)合發(fā)酵。以未接復(fù)合菌群堆肥作為對照。定時(shí)觀察兩組的組織狀態(tài)。
1.2.1.4 菌種鑒定 a.16S rRNA基因分析:DNA的提取方法依據(jù)Li等[11]的方法擴(kuò)增,使用的16S通用引物為27F:5’-AGAGTTGATCATGGGTCAG-3’;1492R:5’-AAGGAGGTGATCCAACGCA-3’;b.18S rRNA基因分析:DNA的提取方法依據(jù)張亮[12]的方法擴(kuò)增,使用的18S通用引物為ITS-1:5’-CGTAACAAGGTTTCC GTAGG-3’;ITS-4:5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’。測序由上海生工公司完成,序列比對在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行。
1.2.2 滸苔生物有機(jī)肥的制備 以滸苔為原料,通過添加尿素調(diào)節(jié)發(fā)酵用物料的C/N為30∶1,利用EM-L菌劑對物料進(jìn)行發(fā)酵。首先將配好的待發(fā)酵物轉(zhuǎn)入發(fā)酵池,再將預(yù)先培養(yǎng)的EM-L菌劑倒入池中,接種量為發(fā)酵物料總量的3%~5%,物料要充分混勻。發(fā)酵過程中,定期翻堆取樣檢測,翻堆要迅速、充分,整個(gè)周期為14d。將發(fā)酵完全的物料和有機(jī)輔料按一定比例充分混勻,即滸苔生物有機(jī)肥。同時(shí)將滸苔生物有機(jī)肥中的各輔料按照相同比例配制成對照組肥料,以下統(tǒng)稱為對照有機(jī)肥。
1.2.3 滸苔生物有機(jī)肥對櫻桃蘿卜的品質(zhì)影響 本實(shí)驗(yàn)設(shè)不施肥料的空白組為處理組1,施4t/hm2對照有機(jī)肥的對照組為處理組2,施滸苔生物有機(jī)肥1t/hm2(低施肥量實(shí)驗(yàn)組)、4t/hm2(中施肥量實(shí)驗(yàn)組)、7t/hm2(高施肥量實(shí)驗(yàn)組)三個(gè)實(shí)驗(yàn)組分別為處理組3、4、5。每個(gè)處理組設(shè)置3個(gè)平行,每個(gè)平行450棵櫻桃蘿卜。5月3號種植,6月5號采收,整個(gè)生長期為33d通過對櫻桃蘿卜的單棵重、單顆直徑、還原糖含量和葉綠素含量等指標(biāo)進(jìn)行檢測,并以此判斷滸苔生物有機(jī)肥的肥效。
1.2.4 指標(biāo)測定方法 櫻桃蘿卜的單棵重用電子天平直接稱量,單顆直徑用游標(biāo)卡尺直接測量,還原糖含量采用3,5-二硝基水楊酸法[13],葉綠素含量采用分光光度比色法[14],腐熟過程中的物料C/N按照國家NY 525-2002有機(jī)肥料標(biāo)準(zhǔn)中所述方法進(jìn)行測定。
實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2003軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的圖表處理和單因素方差分析。并用Excel 2003軟件進(jìn)行SSR多重比較檢驗(yàn)法[15]檢驗(yàn)處理組間的差異程度,以p<0.05作為差異顯著水平。
2.1.1 發(fā)酵菌種的篩選 在初篩過程中,共篩選出13株細(xì)菌和7株酵母菌。將初篩得到的菌株分別接種到復(fù)篩培養(yǎng)基中,大部分菌株由于對新鮮滸苔的降解能力較差而被淘汰;經(jīng)過反復(fù)復(fù)篩,最終獲得3株降解能力較強(qiáng)且穩(wěn)定的菌株。
2.1.2 發(fā)酵菌種的鑒定及命名 分別對細(xì)菌的16S rRNA和真菌的18S rRNA擴(kuò)增后,將測序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫中的基因序列進(jìn)行比對。比對結(jié)果表明本次篩選的3個(gè)菌株分別為:米根霉、枯草芽孢桿菌和蠟狀芽孢桿菌。菌株比對結(jié)果如下表1所示。將這三個(gè)菌株同實(shí)驗(yàn)室已有的發(fā)酵菌株“米曲霉”共同命名為EM-L菌劑。
以EM-L菌劑發(fā)酵滸苔,在發(fā)酵過程中定期觀察取樣并測定發(fā)酵物料的溫度、高度和C/N等指標(biāo),測定結(jié)果如圖1所示。觀察發(fā)酵后滸苔,其顏色發(fā)黑,組織腐爛,呈流體狀。而無添加EM-L菌劑的對照組滸苔在發(fā)酵周期結(jié)束后,其原滸苔綠色變淺,組織基本無斷裂,仍保持完整。滸苔在EM-L菌劑的作用下,在14d的發(fā)酵周期中,物料的溫度變化明顯,第2d即升到50℃以上,在第3d溫度達(dá)到最高為65℃。之后溫度緩慢下降,第8d溫度達(dá)到40℃,并保持平穩(wěn)。物料高度在整個(gè)發(fā)酵期逐漸下降,前3d下降較快,11d之后維持在19cm高度,并保持穩(wěn)定。物料C/N值從30逐漸下降到16,后期保持穩(wěn)定。
根據(jù)NY 525-2002有機(jī)肥料標(biāo)準(zhǔn)對滸苔進(jìn)行成分含量測定,滸苔成分含量(以濕基計(jì))為:總氮0.62%,全磷0.04%,全鉀0.68%,有機(jī)質(zhì)10.12%。本實(shí)驗(yàn)研究的滸苔生物有機(jī)肥主要成分為滸苔、腐植酸、膨潤土和酵母發(fā)酵液干燥粉等有機(jī)物料。根據(jù)國標(biāo)NY 525-2002對滸苔生物有機(jī)肥成分含量測定,結(jié)果見表2。從以下各指標(biāo)可以看出,本滸苔有機(jī)肥各指標(biāo)均符合國家有機(jī)肥料標(biāo)準(zhǔn),是嚴(yán)格按照該標(biāo)準(zhǔn)配制的一種新型海藻類生物有機(jī)肥。
圖1 滸苔發(fā)酵過程中各指標(biāo)變化Fig.1 The changes of each index in the the fermentation process of Enteromorpha prolifera
表1 菌種鑒定結(jié)果Table1 The identification results of selected strains
表2 滸苔生物有機(jī)肥成分含量Table2 The concentof the componentof Enteromorpha prolifera bio-organic fertilizer
通過在櫻桃蘿卜生產(chǎn)中增施滸苔生物有機(jī)肥,并在采收時(shí)隨機(jī)抽樣,測定果實(shí)重量、直徑和還原糖等。從表3中可以看出,隨著滸苔生物有機(jī)肥施肥量的增加,重量和直徑均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。中施肥量實(shí)驗(yàn)組在重量和直徑兩個(gè)指標(biāo)中表現(xiàn)出最高水平,比對照組分別增加3.29%和3.81%。但兩個(gè)處理組組間的重量和直徑指標(biāo)均無顯著差異。低施肥量實(shí)驗(yàn)組對櫻桃蘿卜的還原糖含量影響最大,比對照組增加4.11%,中施肥量實(shí)驗(yàn)組(增加0.64%)次之。綜合比較說明,4t/hm2為滸苔生物有機(jī)肥的最佳施肥量,對櫻桃蘿卜的重量及糖含量的促進(jìn)作用顯著,滸苔生物有機(jī)肥的施肥量達(dá)到7t/hm2之后對櫻桃蘿卜的生長有明顯的抑制作用。對照有機(jī)肥對櫻桃蘿卜的重量、糖含量的提高也有明顯的效果,但與最佳施肥量的滸苔生物有機(jī)肥下的櫻桃蘿卜生長情況相比,各指標(biāo)都較低。
表3 滸苔生物有機(jī)肥對櫻桃蘿卜單棵重量、單顆直徑、還原糖含量的影響Table3 The effects of Enteromorpha prolifera bio-organic fertilizer on theweight,diameter and reducing sugar of Cherry Radish
櫻桃蘿卜成熟后,進(jìn)行隨機(jī)取樣并對葉片葉綠素含量進(jìn)行檢測評定,空白組植株葉片局部有發(fā)黃現(xiàn)象,表現(xiàn)出缺肥癥狀;對照組植株葉片呈現(xiàn)出淺綠色,無發(fā)黃葉片;施用滸苔生物有機(jī)肥植株葉片深綠,無黃葉、爛葉。從圖2的數(shù)據(jù)中也可以看出,滸苔生物有機(jī)肥對于櫻桃蘿卜的葉片葉綠素含量有明顯的促進(jìn)作用,而且隨著肥施肥量的增加,葉綠素含量呈遞增趨勢。施用滸苔生物有機(jī)肥的實(shí)驗(yàn)組均高于對照組與空白組的葉綠素含量。
圖2 滸苔生物有機(jī)肥對櫻桃蘿卜葉綠素含量的影響Fig.2 The effectof Enteromorpha prolifera bio-organic fertilizer on chlorophyll content of Cherry Radish
經(jīng)復(fù)配的EM-L菌劑是由多種真菌和細(xì)菌組成的微生物群系。對纖維素分解能力較強(qiáng)的菌株大多為真菌屬[16],其中屈二軍[17]、馬光[18]、管海華等[19]均報(bào)道了米曲霉可以分泌纖維素酶。此外,米曲霉具有生長快、產(chǎn)孢子量大、不產(chǎn)毒素等特點(diǎn)[16]。EM-L菌劑中的枯草芽孢桿菌[20]可以分泌蛋白酶以分解滸苔原料中的蛋白質(zhì),從而生成利于作物吸收的小分子肽類化合物。根霉是霉菌中一種具有多酶系特征的霉菌,它除了能分泌淀粉酶外,還能分泌酸性蛋白酶,酒化酶及乳酸、琥珀酸等多種有機(jī)酸及乙醇等[21]。蠟狀芽孢桿菌可產(chǎn)生抗菌物質(zhì),抑制有害微生物的繁殖,降解土壤中的營養(yǎng)成分,改善生態(tài)環(huán)境,有耐高溫、耐酸堿、耐溫度變化等特點(diǎn)[22]。綜合以上各菌株的性質(zhì),各菌株之間具有良好的協(xié)同效應(yīng)。在滸苔發(fā)酵過程中,在各微生物群系共同作用下能夠達(dá)到對滸苔的加速分解,將滸苔中的纖維素、蛋白質(zhì)、碳水化合物等有機(jī)物徹底降解成作物所能吸收的小分子物質(zhì)。
對發(fā)酵終點(diǎn)的滸苔進(jìn)行感官評定,其顏色已完全失去原有的滸苔綠色,變?yōu)樯詈谏?;組織降解充分,呈半流體狀,無明顯臭味。物料在發(fā)酵的過程中,由于各種微生物的活動(dòng)產(chǎn)熱,使得料體溫度升高,又由于本實(shí)驗(yàn)所用菌種由米曲霉、芽孢桿菌等多種屬菌種組成,具有產(chǎn)多酶類、有機(jī)物種類降解全面和產(chǎn)熱快的特點(diǎn),所以物料溫度在前期即可升到50℃以上。隨著微生物的不斷繁殖,溫度隨之升高,最高達(dá)到65℃。到了發(fā)酵后期,由于營養(yǎng)物質(zhì)和外界環(huán)境的變化,導(dǎo)致微生物活動(dòng)減弱,數(shù)量減少,進(jìn)而物料溫度下降直至達(dá)到穩(wěn)定。另外,微生物對物料的作用,使得滸苔組織降解,交聯(lián)度下降,從而表現(xiàn)出料體高度的下降。微生物在生長繁殖過程中,大量地利用物料中的碳源和氮源,并產(chǎn)生二氧化碳和氨氣排出料體之外[23]。微生物對碳源的需要量大于氮源,導(dǎo)致C/N值逐漸減小,由30降到16。根據(jù)劉更正[24]、Marco Grigatti[25]的研究,C/N是檢驗(yàn)物料發(fā)酵程度的一個(gè)重要指標(biāo),堆肥的C/N值達(dá)到20以下就認(rèn)為已發(fā)酵結(jié)束,可以直接使用。本實(shí)驗(yàn)研究的物料發(fā)酵后的C/N值為16,說明物料已經(jīng)發(fā)酵完全,能夠作為肥料原料使用。
本實(shí)驗(yàn)研究的滸苔生物有機(jī)肥成分豐富,不僅含有滸苔所特有的滸苔多糖、藻朊酸和脂肪酸等小分子有機(jī)物質(zhì),并且其氮、磷、鉀和有機(jī)質(zhì)總量高于國家NY 525-2002有機(jī)肥料標(biāo)準(zhǔn)。此外,該肥料還具有活化生物體內(nèi)多種轉(zhuǎn)化酶和過氧化物酶,促進(jìn)植物細(xì)胞分裂,刺激植物生長等多種生理活性[26]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,櫻桃蘿卜在施用了滸苔生物有機(jī)肥之后,相對于對照有機(jī)肥,其果實(shí)的重量、直徑、還原糖含量和葉片葉綠素含量都在不同程度上得到增加。櫻桃蘿卜的塊莖膨大主要依靠氮源,滸苔生物有機(jī)肥氮源豐富,為其提供了大量的生長營養(yǎng)元素。葉綠素是植物進(jìn)行光合作用的重要物質(zhì),也是衡量植物光合作用能力的重要指標(biāo)之一[27]。葉綠素有兩部分組成,卟啉環(huán)和葉綠醇,卟啉環(huán)的結(jié)構(gòu)中包含鎂元素。此外,葉綠素的前體為鋅卟啉,需要鋅元素來合成[28]。滸苔生物有機(jī)肥含有大量的鎂、鋅等礦質(zhì)元素[3,26],為葉綠素的合成提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。從實(shí)驗(yàn)中得出,中、低施肥量下,櫻桃蘿卜葉的葉綠素含量與滸苔生物有機(jī)肥的施肥量呈正相關(guān)。但在高施肥量下,櫻桃蘿卜的果實(shí)較小,說明過多滸苔生物有機(jī)肥的施用會抑制櫻桃蘿卜的生長。果實(shí)的還原糖含量是衡量其口感和品質(zhì)的一個(gè)指標(biāo)[29],其含量越高,口感越好,品質(zhì)也越高。當(dāng)櫻桃蘿卜的滸苔生物有機(jī)肥的施用量為1、4t/hm2時(shí),其還原糖含量高于空白組含量,對櫻桃蘿卜的品質(zhì)有提高作用。
經(jīng)分離篩選得到的米根霉、枯草芽孢桿菌和蠟狀芽孢桿菌菌與米曲霉復(fù)配得到EM-L菌劑。各菌株之間具有良好的協(xié)同作用,能夠達(dá)到對滸苔的加速分解。以發(fā)酵滸苔作為主要原料制備得到的滸苔生物有機(jī)肥,其成分含量指標(biāo)符合相應(yīng)的國家標(biāo)準(zhǔn)。滸苔生物有機(jī)肥相對于對照有機(jī)肥對櫻桃蘿卜的重量和還原糖含量的增加作用明顯。結(jié)果表明,滸苔生物有機(jī)肥的最佳施肥量為4t/hm2,該施肥量對櫻桃蘿卜在產(chǎn)量和品質(zhì)上都有促進(jìn)作用。
[1]王曉坤,馬家海,葉道才,等.滸苔(Enteromorpha prolifera)生活史的初步研究[J].海洋通報(bào),2007,6(5):112-116.
[2]陳大倫,黃曉春,楊文鴿,等.滸苔營養(yǎng)成分分析[J].浙江海洋學(xué)院學(xué)報(bào),2003,22(4):318-320.
[3]M Aguilera-Morales.Chemicalcomposition andmicrobiological assays of marine algae Enteromorpha spp.as a potential food source[J].Journal of Food Composition and Analysis,2005,18:79-88.
[4]汪家銘.海藻肥生產(chǎn)應(yīng)用及發(fā)展建議[J].化學(xué)工業(yè),2010,2(12):14-18.
[5]顏霞,柳曉東,楊俊杰.高溫纖維素酶產(chǎn)生菌的篩選鑒定及其酶性質(zhì)研究[J].太陽能學(xué)報(bào),2011,32(6):787-791.
[6]劉紅艷,張亞蓮,常碩其,等.茶園生物菌肥高效菌株的篩選[J].茶葉通訊,2006,33(4)13-15.
[7]牛四坤,李榆梅.養(yǎng)殖水體有機(jī)污物蛋白質(zhì)高效降解菌的篩選和分離[J].太原師范學(xué)院學(xué)院學(xué)報(bào),2011,10(4):142-145.
[8]趙妍嫣,姜紹通,鄭志,等.淀粉基高吸水樹脂降解菌的篩選及初步鑒定[J].微生物學(xué)通報(bào),2004,31(6):83-86.
[9]張志群,王蘭,趙延華,等.生物有機(jī)復(fù)合肥的研制及應(yīng)用[J].大連民族學(xué)院學(xué)報(bào),2003,5(3):37-38.
[10]汪家銘.海藻肥生產(chǎn)應(yīng)用及發(fā)展建議[J].化學(xué)工業(yè),2010,2(12):14-18.
[11]Li HW,Medina F,Bradleigh Vinson S,et al.Isolation,characterization,and molecular identification of bacteria from thered im ported fire ant(Solenopsis invicta)midgut[J].Journal of Invertebrate Pathology,2005,89:203-209.
[12]張亮,池振明.1株產(chǎn)纖維素酶海洋酵母菌的篩選、鑒定及發(fā)酵條件優(yōu)化[J].中國海洋大學(xué),2007,37(2):101-108.
[13]李合生.植物生理生化實(shí)驗(yàn)原理和技術(shù)[M].北京:高等教育出版社,2006:97.
[14]楊敏文.快速測定植物葉片葉綠素含量方法的探討[J].光譜實(shí)驗(yàn)室,2002,19(4):478-487.
[15]王欽德,楊堅(jiān).食品實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與統(tǒng)計(jì)分析[M].北京:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社,2008:104-121.
[16]Hart T D,De Lei FAAM,Kinsey G,et al.Strategies for the isolation of the celluolytic fungi for composting ofwheat straw[J].World Journal of Microbiology and Biotechnology,2002,18:471-480.
[17]屈二軍,王曉濤,李文建,等.一株高產(chǎn)纖維素酶的米曲霉菌種的選育[J].中國釀造,2008,191(14):47-49.
[18]馬光,郭繼平.米曲霉發(fā)酵玉米秸稈產(chǎn)纖維素酶飼料條件的優(yōu)化[J].生物技術(shù),2010,20(6);81-85.
[19]管海華,賈秉晟,王家芳,等.一株產(chǎn)纖維素酶和植酸酶的米曲霉的誘變篩選和固體發(fā)酵[J].南京師大學(xué)報(bào),2011,34(2);83-89.
[20]徐雅芫,李呂木,許發(fā)芝,等.一株產(chǎn)堿性蛋白酶芽孢桿菌的篩選、鑒定及應(yīng)用初探[J].激光生物學(xué)報(bào),2011,20(6);830-837.
[21]張鳳英,董開發(fā),涂瑾.根霉酒精發(fā)酵特性研究[J].食品科學(xué),2002,23(8):158-159.
[22]黃麗彬,陳有容,齊鳳蘭.蠟狀芽孢桿菌在飼料中的應(yīng)用[J].糧食與飼料工業(yè),2011,36(9):32-33.
[23]劉益仁,劉光榮,李祖章,等.微生物發(fā)酵菌劑對豬糞堆肥腐熟的影響[J].江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2006,18(5):36-38.
[24]劉另更.中國有機(jī)肥料[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,1991:38-59.
[25]Marco Grigatti,Luciano Cavani,Claudio Ciavatta.The evaluation of stability during the composting of different starting materials:Comparison of chemical and biological parameters[J].Chemosphere,2011,83:41-48.
[26]陳玉玲.腐植酸對植物生理活動(dòng)的影響[J].植物學(xué)通報(bào),2000,17(1):64-72.
[27]陳紹瑗,呂貞兒,董峰麗,等.響應(yīng)面分析法優(yōu)化桑葉葉綠素提取工藝[J].浙江大學(xué)學(xué)報(bào),2006,38(6):725-731.
[28]OHKI K.Effect of zinc nutrition on photosynthesis and carbonic anhydrase activity in cotton[J].Physiologia Plant arum,1976,38(4):300-304.
[29]杜新民.氮鋅肥配施對櫻桃蘿卜產(chǎn)量和品質(zhì)的影響[J].農(nóng)業(yè)與技術(shù),2009,29(6):69-72.