陳鋒菊 寧麗紅

（1.湖南科技大學 生命科學學院, 湖南 湘潭 411201; 2.湖南第一師范學院 教育科學系, 湖南 長沙 410205）

子宮內(nèi)膜癌（Endometrial Carcinoma，EC） 又稱子宮體癌，是由子宮內(nèi)膜腺體上皮組織發(fā)生的惡性腫瘤，為女性生殖器常見的三大惡性腫瘤之一。近年來，全球每年有約142000 女性患上此病，約42000 女性死于此??；其發(fā)病率呈直線上升，已接近甚至超過宮頸癌，且患者具有年輕化趨勢[1]。

目前，國內(nèi)外對子宮內(nèi)膜癌的研究主要集中于采用免疫組化等技術(shù)，檢測相應(yīng)物質(zhì)在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達及臨床意義[2-5]。而有關(guān)子宮內(nèi)膜癌發(fā)生的分子生物學機理和發(fā)展機制的研究鮮見報道。Liotta 等[6]報導，通過蛋白質(zhì)組學分析技術(shù)可以研究腫瘤早期的遺傳學變化，從而尋找到疾病早期可能的蛋白質(zhì)標志物。而血清在臨床上容易獲取并便于檢測，一直是篩選疾病診斷標記物的最佳研究對象。通過腫瘤患者的血清蛋白質(zhì)組學研究，已經(jīng)初步發(fā)現(xiàn)了一些腫瘤相關(guān)蛋白質(zhì)[7-12]。因此，本研究將通過血清蛋白質(zhì)組學研究技術(shù)，尋找和鑒定子宮內(nèi)膜癌相關(guān)蛋白質(zhì)，試圖為子宮內(nèi)膜癌的早期診斷和治療提供新方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 血清樣品

2011 年10 月在湖南省腫瘤醫(yī)院住院的子宮內(nèi)膜癌患者6 例（平均年齡56 歲）；同時期的女性體檢健康者6 例（平均年齡53 歲）。分別取清晨空腹靜脈血3 ml，迅速置于4 ℃靜置3 小時，3000 r/min 離心5 分鐘，提取上清液，再將上清液靜置5 分鐘，15000 r/min 離心30 分鐘，去掉白色絮狀沉淀，留上層血清。分正常組和患者組，將獲得的血清分別混合，以便消除個體差異。冰上分裝，每EP 管100ul，并于-80℃凍存?zhèn)溆茫苊夥磸蛢鋈凇?/p>

1.1.2 主要試劑

固相pH梯度（IPG）膠條（pH3-10NL，18cm）、載體兩性電解質(zhì)購自Bio-Rad公司；丙烯酰胺(Acr)、N,N′甲叉雙丙烯酰胺(Bis)、十二烷基磺酸鈉(SDS)、過硫酸銨(AP)、四甲基乙二胺(TEMED)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、甘氨酸(Gly)、二硫蘇糖醇（DTT）、3-[ 3-(膽酰氨丙基) 二甲銨基]丙磺酸內(nèi)鹽(CHAPS)、碘乙酰胺( IAA) 、瓊脂糖、尿素、乙腈、礦物油、甘油購自上海生工生物工程有限公司；考馬斯亮藍R-250、牛血清白蛋白(BSA)為Sigma公司產(chǎn)品；低分子量標準為上海伯奧生物制品公司。

1.1.3 主要儀器

IPG等電聚焦儀、垂直平板電泳槽購自Amersham Biosciences公司；掃描儀購自清華紫光總公司；PDQuest 分析軟件購自BIO-RAD公司。

1.2 方法

1.2.1 血清樣品的處理 凍融血清，4℃ 12000 r/min 離心5 min，取上清液0.5 mL 與0.5mL 乙腈混合(構(gòu)成1 倍體積倍數(shù)的乙腈)，混合后，立即震蕩混勻約15 s，置于搖床20 min( 60 轉(zhuǎn)，20℃ )然后于4℃ 12 000 r/ min 離心10 min，最后取600 uL 上清液濃縮至 100 uL。

1.2.2 血清蛋白含量測定 蛋白質(zhì)含量測定采用bradford 法[13]。

1.2.3 雙向凝膠電泳及染色 取處理過的子宮內(nèi)膜癌患者血清樣品和健康者血清樣品進行雙向凝膠電泳。操作步驟參照IPG 使用指南。電泳完成后，對所得凝膠進行考染。

1.2.4 圖像分析 用清華紫光掃描儀掃描2-DE 膠，PDQuest 軟件對圖像進行比較、分析，以確定差異蛋白質(zhì)點。

2 結(jié)果

2.1 高豐度蛋白的去除

在樣品處理時，根據(jù)本實驗室之前在對去除子宮內(nèi)膜癌血清高豐度蛋白的比較研究中得出的結(jié)論，采用1倍體積的乙腈對樣品進行預處理,SDS-PAGE 后,考馬斯亮藍R-250 染色，結(jié)果見圖1。結(jié)果表明，1倍體積的乙腈能有效去除血清中的絕大部分高、中豐度蛋白，同時保留較多的小分子量蛋白。

圖1 子宮內(nèi)膜癌血清樣品SDS-PAGE 電泳圖

2.2 2-DE 圖譜分析

本研究采用pH 3-10 的膠條和12 %的分離膠對子宮內(nèi)膜癌患者血清和健康者血清進行雙向電泳，考馬斯亮藍R-250染色后，得到了子宮內(nèi)膜癌患者與健康者血清蛋白的2-DE圖譜。

PDQuest 軟件分析圖譜發(fā)現(xiàn)，兩組的差異蛋白質(zhì)點（表達量相差2倍及以上）共15個，相對于健康組，子宮內(nèi)膜癌患者組表達量下調(diào)的蛋白質(zhì)點2個，表達量上調(diào)的蛋白質(zhì)點11個，在健康組缺失而只在患者組表達的蛋白質(zhì)點2個，具體差異點見圖2。圖3是部分差異蛋白的局部放大圖。

圖2 子宮內(nèi)膜癌患者和健康者血清蛋白雙向電泳圖譜

圖3 部分差異蛋白的局部放大圖

3 討論

目前大于80%的子宮內(nèi)膜癌患者診斷時為早期, 預后較好, 而晚期子宮內(nèi)膜癌治療困難, 預后較差[14-15]。因此，子宮內(nèi)膜癌的早期診斷尤為重要。其診斷除傳統(tǒng)的診斷性刮宮外, 還包括子宮內(nèi)膜活檢、宮腔鏡檢查、宮頸管和宮腔毛刷等。由此可見，子宮內(nèi)膜癌一直以來缺乏一種簡單、準確、損傷性小的診斷方法。因此有必要找到一種簡單、準確而又無創(chuàng)性的診斷手段，以減少患者的身心痛苦。本研究通過抽取患者的外周靜脈血獲得血清后進行檢測, 相對于檢測其他組織對患者的創(chuàng)傷性要小很多, 操作也相對簡單, 更經(jīng)濟、實惠、可行。

人血清中含有成千上萬種的蛋白質(zhì)，各種蛋白質(zhì)的含量差異很大。而生物標志物往往是在某些疾病的病理過程中分泌入血的一些低分子量蛋白。這些低分子量蛋白的含量相當少，極易被高豐度蛋白所掩蓋和干擾。本實驗采用1倍體積的乙腈對樣品進行了沉淀處理， 電泳結(jié)果顯示，經(jīng)預處理去除高豐度蛋白后，血清樣品中的低分子量蛋白得到了較好的保留和分離。

目前，蛋白質(zhì)組學技術(shù)在子宮內(nèi)膜癌血清中的應(yīng)用還少有報道。本實驗通過雙向電泳技術(shù)，獲得了較清晰的子宮內(nèi)膜癌患者血清的2-DE 圖譜。圖譜軟件分析發(fā)現(xiàn)，相對于健康組，子宮內(nèi)膜癌患者組表達量下調(diào)的蛋白質(zhì)點有2個，表達量上調(diào)的蛋白質(zhì)點有11個。其下調(diào)的蛋白質(zhì)有可能是一些對腫瘤生長或轉(zhuǎn)移起到調(diào)節(jié)作用的蛋白質(zhì)，或者是某些抑癌基因作用的結(jié)果。而上調(diào)的蛋白質(zhì)以及只在患者組表達的蛋白質(zhì)有可能是腫瘤細胞分泌、釋放的蛋白質(zhì)，或者是由于癌細胞影響而引起的其他組織器官異常分泌的蛋白質(zhì)。這些差異蛋白有可能是子宮內(nèi)膜癌病理過程中的重要蛋白，也有可能是子宮內(nèi)膜癌的標志性蛋白。進一步的質(zhì)譜鑒定可以明確這些蛋白質(zhì)的種類及其功能，為進一步認識子宮內(nèi)膜癌的病理機制奠定了基礎(chǔ)，最終有可能應(yīng)用于子宮內(nèi)膜癌的臨床診斷及治療等方面。

[1] Amant F,Moerman P,Neven P,et al.Endometrial cancer[J].Lancet, 2005,366(9484):491-505.

[2]Saito M,Sato Y,Watanabe J, et al.Angiogenic factors in normal endometrium and endometrial adenocarcinoma[J].Pathol lnt,2007,57(3):140-147.

[3]朱正鵬, 賈國鳳, 馬健波等.子宮內(nèi)膜腺癌C-erbB-2 COX-2 過度表達的相關(guān)性分析[J].中國臨床腫瘤,2008,35(11):633-635.

[4]Tashiroll H,Blazes M S,Wu R,et al.Mutations in PTEN are frequent in endometrial carcinoma but rare in other common gynecological malignancies[J].Cancer Res,1997,57(18):3935-3940.

[5]Kanamori Y,Kigawa J,Itamochi H,et al.Correlation between loss of PTEN expression and Akt phosphorylation in endometrial cancinoma[J].Clin Cancer Res,2001,7:892-895.

[6]Liotta L A, Kohn E C.The microenvironment of the tumour-hostinterface [J].Nature,2001,411(6835): 375-379.

[7]Zhu W, Wang X N, Ma Y M, et al.Detection of cancer specific markers amid massive mass spectral data[J].Proc Natl Acad Sci USA,2003,100 (25):14666-14671.

[8]Watkins B, Szaro R, Ball S, et a1.Detection of early-stage cancer by serum protein analysis[J].Am Lab,2001,73: 32-36.

[9]Xiao X,Liu D,Tang Y,et al.Development of proteomic patterns for detecting lung cancer[J].Dis Markers,2004, 19(1):33-39.

[10]Cho W C, Yip T T, Yip C, et al.Identification of serum amyloid a protein as a potentially useful biomarker to monitor relapse of nasopharyngeal cancer by serum proteomic profiling[J].Clin Cancer Res,2004,10(1):43-52.

[11]Steel L F, Shumpert D, Trotter M, et al.A strategy for the comparative analysis of serum proteomes for the discovery of biomarkers for hepatocellular carcinoma[J].Proteomics,2003,3(5):601-609.

[12]李萃,肖志強,章曉鵬,等.人肺鱗癌組織的血清蛋白質(zhì)組學的比較分析[J].中國生物化學與分子生物學報,2005,21(3):357-368.

[13]陳鈞輝,陶力,李俊,等.生物化學實驗[M].科學出版社,2007:110-116.

[14]Bristow R E, Zerbe M J, Rosensh ein N B, et al. Stage IVB endometrial carcinoma: T he role of cyt- oreductive surgery and determinants of survival [J].Gynecol Oncol,2000,78( 9) :85- 91.

[15]Ayhan A,Taskiran C,Celik C,et al . The inf luence of cytoreductive surgery on survival and morbidit y in stage IVB endometrial cancer[J].Int J Gynecol Cancer 2002,12( 5) :448- 453.