周天浩，徐 京，牟艷英，解素花，李晉生，*

（1.北京中研同仁堂醫(yī)藥研發(fā)有限公司，北京100079；2.北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司，北京100079）

葛根玉芪膠囊為保健食品，具有輔助降血糖功能。該產(chǎn)品選用葛根、黃芪、玉竹、桑白皮、胡蘆巴、枸杞子、丹參七味藥材合理配伍組方。糖尿病屬于中醫(yī)消渴的范疇，現(xiàn)代中醫(yī)學(xué)將糖尿病稱為消渴病，所以中醫(yī)常用補(bǔ)氣、補(bǔ)血、清熱來調(diào)節(jié)臟腑功能，從而達(dá)到治療目的[1]。葛根[2]功能主治解肌退熱，生津，透疹，升陽止瀉，用于外感發(fā)熱、頭痛項(xiàng)強(qiáng)，口渴，消喝等癥；桑白皮具有瀉肺平喘，利水消腫，用于肺熱咳喘，面目浮腫，小便不利等癥；胡蘆巴用于補(bǔ)腎陽，祛寒濕，腎虛腰酸等癥；丹參用于祛瘀止痛，活血通經(jīng)，清心除煩。枸杞子為傳統(tǒng)中醫(yī)常用的補(bǔ)益藥；黃芪[2]具補(bǔ)氣固表，托毒排膿，利尿生肌功能[2]。玉竹在《神農(nóng)本草經(jīng)》中被列為上品，是中醫(yī)學(xué)治療“消渴”的常用藥物，是我國常用中藥材。

根據(jù)配方藥材飲片有效成分的性質(zhì)及藥理作用，采用醇提和水提分別提取。配方中葛根[3-5]、桑白皮[6-7]、胡蘆巴[8]、丹參[9-11]四味藥材均以脂溶性成分為主，采用乙醇提取可取得較好效果。其中葛根是配方中的君藥，故以葛根素[3-5]作為醇提正交實(shí)驗(yàn)考察指標(biāo)。配方中枸杞子、黃芪、玉竹所含成分都以多糖類為主，采用水提取可取得較好效果，水提部分以粗多糖作為水提正交實(shí)驗(yàn)考察指標(biāo)[12-14]。這些成分可作為藥用和保健食品生產(chǎn)的功能性組分，以葛根素和粗多糖為考察指標(biāo)，通過正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，對工藝條件進(jìn)行優(yōu)選，為工業(yè)生產(chǎn)提供工藝參數(shù)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

葛根、桑白皮、胡蘆巴、丹參、枸杞子、黃芪、玉竹 安國市羅深行中藥材有限責(zé)任公司；甲醇 色譜純；純凈水 用微孔濾膜濾過0.45μm；乙醇、冰醋酸、濃硫酸、蒽酮 分析純。

Agilent 1100 series型高效液相色譜儀 安捷倫科技（中國）有限公司；UV 757CRT型紫外可見光分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；DZF06050型真空干燥箱 上海一恒科技有限公司；AB135-S型電光分析天平 梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 配方藥材提取工藝流程

1.2.1.1 葛根素提取工藝流程 葛根、桑白皮、胡蘆巴、丹參→乙醇溶劑提取（80℃）→過濾（120目）→真空濃縮（70℃）→真空干燥（70℃）→醇提干膏。

1.2.1.2 粗多糖提取工藝流程 枸杞子、黃芪、玉竹→純凈水提?。?0℃）→過濾（120目）→真空濃縮（70℃）→真空干燥（70℃）→水提干膏。

1.2.2 提取工藝參數(shù)的確定

1.2.2.1 醇提工藝參數(shù)的確定 醇提工藝采取正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，提取方法及因素水平的確定，將葛根、桑白皮、胡蘆巴、丹參按照配方比例稱取配方藥材共120g，置圓底燒瓶中回流提取。根據(jù)文獻(xiàn)[3-11]和預(yù)實(shí)驗(yàn)，確定提取因素（A）溶劑倍數(shù)、（B）乙醇濃度、（C）提取時(shí)間、（D）提取次數(shù)為考察因素，選用L9（34）正交表，設(shè)計(jì)四因素三水平正交實(shí)驗(yàn)。以每克配方藥材中葛根素含量作考察指標(biāo)，并對每項(xiàng)實(shí)驗(yàn)均做2個(gè)平行，取平均值進(jìn)行分析。因素水平表如表1所示：

表1 醇提工藝因素水平表Table1 The factors and levels table of alcohol extraction process

表2 水提因素水平表Table2 The factors and levels table ofwater extraction process

1.2.2.2 水提工藝參數(shù)的確定 水提工藝采取正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，提取方法及因素水平的確定，按照配方比例稱取枸杞子、黃芪、玉竹共95g，置圓底燒瓶中回流提取。根據(jù)文獻(xiàn)[12-14]和預(yù)實(shí)驗(yàn)，提取因素選擇（A）溶劑倍數(shù)，（B）提取次數(shù)，（C）提取時(shí)間，通過選用L9（34）正交表，設(shè)計(jì)三因素三水平正交實(shí)驗(yàn)，考察提取溶劑倍數(shù)，提取時(shí)間及提取次數(shù)的參數(shù)，以每克配方藥材中粗多糖含量作為考察指標(biāo)，并對每項(xiàng)正交實(shí)驗(yàn)均做2個(gè)平行，取平均值進(jìn)行分析。因素水平表如表2所示：

1.2.3 葛根素測定方法

1.2.3.1 葛根素[15]測定色譜條件 色譜柱為waters symmetry C18柱（5μm，4.6mm×150mm）；以甲醇-水（25∶75）為流動相，柱溫30℃；檢測波長為250nm。理論板數(shù)按葛根素峰計(jì)算應(yīng)不低于4000。

1.2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密稱取葛根素1.50mg于10m L容量瓶中，加甲醇溶解，稀釋至刻度配制成儲備液。分別精密稱取儲備液0.1、0.2、0.4、0.8、1.6m L于10m L容量瓶中，加甲醇至刻度搖勻，取10μL進(jìn)樣，測定峰面積，進(jìn)行線形回歸方程計(jì)算。

1.2.3.3 供樣品溶液的制備及測定 取本品粉末（過50目篩）約0.1g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入30%乙醇50m L，稱定重量，加熱回流30m in，冷卻至室溫，再稱定重量，用30%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，按上述色譜條件測定。

1.2.4 粗多糖測定方法

1.2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 準(zhǔn)確稱取1.00g經(jīng)過98～100℃干燥至恒重的分析純葡萄糖，加水溶解稀釋至1000m L，用前稀釋10倍。稱取0.2g蒽酮置于燒杯中，緩慢加入100m L濃硫酸，配制成0.2%蒽酮硫酸溶液。標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制[15]：準(zhǔn)確吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00m L分別置于10m L比色管中，準(zhǔn)確補(bǔ)充水至1.0m L，加入蒽酮試劑5.0m L充分混勻，在沸水浴中加熱10m in，取出在流水中冷卻20m in后，在620nm波長下測定吸光度值，進(jìn)行線性回歸方程計(jì)算。

1.2.4.2 供樣品溶液的制備及測定 準(zhǔn)確稱取樣品1.00～2.00g，置于100m L容量瓶中加水溶解，在沸水中加熱30min后過濾，定容至100m L。取待測液5m L至離心管中，加入25m L無水乙醇攪拌均勻，加蓋反復(fù)傾倒管子數(shù)次。在離心機(jī)中以4000r/m in離心10m in，并小心棄去上清液，加5m L熱水溶解沉淀物，重復(fù)上述步驟加25m L無水乙醇再以4000r/min離心10m in，小心棄去上清液。然后用熱水分次溶解沉淀并稀釋定容至100m L，過濾后即為待測液，按標(biāo)準(zhǔn)曲線制備方法操作，測定吸光度，計(jì)算粗多糖含量。

1.2.4.3 提取物中粗多糖的含量 計(jì)算公式如下所示：

式中：m1—由標(biāo)準(zhǔn)曲線查得樣品液含糖質(zhì)量（mg）；m—樣品質(zhì)量（g）；n—稀釋倍數(shù)；F—換算因子。

2 結(jié)果與分析

2.1 醇提正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

2.1.1 葛根素含量的計(jì)算 采用標(biāo)準(zhǔn)曲線性回歸方程計(jì)算提取物中葛根素的含量。線性回歸方程：y= 43779x-50.504，R=0.9999，結(jié)果表明在15～240μg·m L-1范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。以線性回歸方程計(jì)算提取物中葛根素的含量，再以每克配方藥材中葛根素含量作為考察指標(biāo)。

2.1.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析 對實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇進(jìn)行極差分析，結(jié)果見表3、表4。在上述表中，四因素對葛根素提取的影響程度依次為：B＞A＞C＞D，其優(yōu)選組合為A3B2C3D3。方差分析顯示，乙醇濃度和溶劑倍數(shù)對提取葛根素含量有顯著的影響，提取時(shí)間和提取次數(shù)對提取葛根素含量的影響不明顯。結(jié)合表3、表4的結(jié)果，最后醇提優(yōu)選工藝為：加60%乙醇提取3次，每次用10倍量溶劑，提取2h。按照優(yōu)選工藝進(jìn)行2次平行提取實(shí)驗(yàn)，測得葛根素含量平均值為15.35，提取工藝基本穩(wěn)定并且優(yōu)于正交實(shí)驗(yàn)表中的最優(yōu)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表5。

表3 正交實(shí)驗(yàn)表及結(jié)果分析Table3 Results of orthogonal test

表4 方差分析Table4 Analysis of variance

表5 實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table5 Results of experiment

2.1.3 醇提工藝條件的驗(yàn)證 為驗(yàn)證醇提優(yōu)選工藝的合理性和穩(wěn)定性，放大200倍配方用量進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，并按照醇提優(yōu)選工藝條件進(jìn)行連續(xù)3個(gè)批次提取。雖然放大實(shí)驗(yàn)在制備過程中會受到一些因素影響，但放大實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)基本達(dá)到醇提工藝的理想結(jié)果，且數(shù)據(jù)基本穩(wěn)定。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表6。

表6 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table6 Results of confirmatory experiment

2.2 水提正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

2.2.1 粗多糖含量的計(jì)算 采用標(biāo)準(zhǔn)曲線性回歸方程計(jì)算提取物中粗多糖的含量。線性回歸方程：y=5.8057x-0.0006，R2=0.9986，結(jié)果表明在20.32～101.6μg·m L-1范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)。以線性回歸方程計(jì)算提取物中粗多糖的含量，再以每克配方藥材中粗多糖含量作為考察指標(biāo)。

2.2.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析 對實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇進(jìn)行直觀分析和方差分析，結(jié)果見表7、表8。在上述表中，三因素對藥材中粗多糖提取的影響程度依次為：B＞C＞A，其優(yōu)選組合為A2B3C2。方差分析顯示，提取次數(shù)和提取時(shí)間對提取粗多糖含量有顯著的影響，溶劑倍數(shù)對提取粗多糖含量的影響不明顯。結(jié)合極差和方差分析的結(jié)果，故確定枸杞子、黃芪、玉竹的優(yōu)選提取工藝參數(shù)為：每次加水10倍量，提取3次，提取時(shí)間為每次1.5h。按照優(yōu)選工藝進(jìn)行2次平行提取實(shí)驗(yàn)，測得粗多糖含量平均值為4.45，提取工藝基本穩(wěn)定并且優(yōu)于正交實(shí)驗(yàn)表中的最優(yōu)結(jié)果，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表9。

表7 正交實(shí)驗(yàn)表及結(jié)果分析Table7 Results of orthogonal test

表8 方差分析Table8 Analysis of variance

表9 實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table9 Results of experiment

2.2.3 水提工藝條件的驗(yàn)證 為驗(yàn)證水提優(yōu)選工藝的合理性和穩(wěn)定性，放大200倍配方用量進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，并按照水提優(yōu)選工藝條件進(jìn)行連續(xù)3個(gè)批次提取。雖然放大實(shí)驗(yàn)在制備過程中會受到一些因素影響，但放大實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)基本達(dá)到水提工藝的理想結(jié)果，且數(shù)據(jù)基本穩(wěn)定。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表10。

表10 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table1 0 Results of confirmatory experiment

3 結(jié)論

根據(jù)配方中藥材的主要成分和選擇溶劑的極性大小，將以脂溶性成分為主的四味藥材葛根、桑白皮、胡蘆巴和丹參，用乙醇溶液提取[3-11]。將以多糖類為主的枸杞子、黃芪、玉竹，用純凈水提取[12-14]。分別對醇提部分和水提部分的提取液濃縮、干燥，得到干膏。

根據(jù)配方藥材飲片有效成分的性質(zhì)及藥理作用，故采用醇提和水提分別提取，以葛根素和粗多糖為考察指標(biāo)，通過正交設(shè)計(jì)法對葛根玉芪膠囊的配方藥材提取工藝進(jìn)行優(yōu)選，優(yōu)選提取工藝為：葛根、桑白皮、胡蘆巴、丹參進(jìn)行醇提，加10倍量60%乙醇，回流提取3次，每次2h；枸杞子、黃芪、玉竹進(jìn)行水提，加10倍量水溶劑，回流提取3次，提取時(shí)間為每次1.5h。按優(yōu)選工藝對醇提部分和水提部分進(jìn)行放大實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，葛根素和粗多糖的含量測定結(jié)果基本平行，穩(wěn)定性較為理想，可以作為工業(yè)化生產(chǎn)的參考依據(jù)。

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