劉曉丹，劉存芳，賴普輝，趙赟愷，吝 敏，陳 凱

（陜西理工學院化學與環(huán)境科學學院，陜西漢中723000）

野菊花（Chrysanthemum indicum L.）是菊科菊屬的一種多年生草本植物[1]，俗稱山菊花、野黃菊花、甘菊花等，在我國大部分地區(qū)均有分布，資源十分豐富，陜西南部盛產(chǎn)野菊花。中國藥典中記載野菊花有清熱解毒、平肝明目、降低血壓等功效。本草綱目中匯載，野菊花能治療癰腫、瘡毒等?，F(xiàn)代藥理學研究表明，野菊花具有廣譜抗菌活性[2]，有保護心臟，降壓，解熱，抑制血小板聚集，增強免疫，抗病毒，抗腫瘤[3]，抗炎，清除氧自由基，保肝養(yǎng)肝等作用。近年來人們對野菊花中的化學成分進行了大量研究，野菊花中含有多糖[4]、萜類物質(zhì)、黃酮類物質(zhì)[5]、蛋白質(zhì)和氨基酸、營養(yǎng)元素[6]、揮發(fā)油[7]、維生素、色素等多種活性成分，通常人們的研究多集中在野菊花的頭狀花序中化學成分的分析測試和活性研究[7]，并利用多種提取溶劑對野菊花的頭狀花序中活性成分進行提取和活性測試研究[8-10]，對野菊花揮發(fā)油成分及生物活性的研究報道也較多[7，11]，但對野菊花莖葉中揮發(fā)油開發(fā)和利用的研究報道較少。這里用普通的水蒸氣蒸餾法從秦巴山區(qū)野菊花的莖葉中提取揮發(fā)油，采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對野菊花莖葉中的揮發(fā)油化學成分進行分離和鑒定，運用峰面積歸一化法確定野菊花莖葉中的揮發(fā)油各個化學成分的相對百分含量，并對其揮發(fā)油進行植物病原真菌的抗菌活性研究，為進一步開發(fā)利用秦巴山區(qū)野菊花植物資源提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

野菊花全草 在2012年10月中旬收集于陜西省漢中市巴山山區(qū)，經(jīng)過陜西理工學院植物學科專家趙樺教授鑒定，認定是菊科菊屬的野菊花（Chrysanthemum indicum L.）植物，取其莖葉，陰干粉碎，密封保存?zhèn)溆?；油菜菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）、煙草赤星病菌（Alternaria longipes）、核桃果炭疽病菌（Pathogenic bacteria）、蘋果炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）、番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea），5種供試細菌菌種 均購自中國普通微生物菌種保藏中心；馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基；無水硫酸鈉 AR，西安化學試劑廠；丙酮、氯化鈉 AR，開封化學試劑總廠；無水乙醚 AR，西安三浦化學試劑有限公司；水 為二次蒸餾水。

Agilent 7890A-5973N型GC-MS儀 美國安捷倫公司；DOB-20003型光電分析天平 重慶實驗設(shè)備廠；LRH-250A型生化培養(yǎng)箱 廣東省醫(yī)療器械廠；FW 100型中草藥粉碎機 天津市泰斯特儀器有限公司；水蒸氣蒸餾裝置 天津化玻儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 野菊花莖葉揮發(fā)油的提取 稱取野菊花的莖葉粉末100g，用水蒸氣蒸餾法提取其揮發(fā)油10h[12]，蒸餾出來的溶液用氯化鈉飽和后，用乙醚萃取三次，上層萃取液用無水硫酸鈉干燥過夜，低溫蒸餾回收乙醚，得到一種有特殊清香氣味的黃色油狀物1.63g，實驗重復(fù)5次，其揮發(fā)油的平均收率為1.63%，低溫密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 野菊花莖葉揮發(fā)油的GC-MS分析 利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)機對野菊花莖葉揮發(fā)油進行分離和分析測定，通過數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)檢索譜圖庫，確定所得野菊花莖葉揮發(fā)油的化學成分及相對含量。

色譜條件：色譜柱型號：HP-5（30m×250μm×0.5μm）彈性石英毛細管柱；載氣為99.999%的高純氦氣，柱溫：柱溫50℃，保持1m in后，再以8℃/m in的升溫至280℃，保持3min；進樣口溫度為280℃，流速為1.0m L/m in，進樣量0.2uL，分流比為10∶1。質(zhì)譜條件：EI離子源，電離能量70電子伏特，離子源溫度230℃，掃描范圍40～550質(zhì)量單位，掃描模式：全掃描。

1.2.3 野菊花莖葉揮發(fā)油抑制植物病原真菌的作用

采用菌絲生長速率法，測定野菊花莖葉揮發(fā)油對5種供試病原菌菌絲生長的抑制作用。將野菊花莖葉揮發(fā)油用丙酮溶解，加入無菌水稀釋配制成所需濃度，在無菌條件下與PDA培養(yǎng)基混合制成含藥平板。設(shè)丙酮空白對照，每次處理重復(fù)3次。用鉆孔器打取直徑5mm的菌餅，菌絲面向下接種于含藥平板上，放入25～26℃生化培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)。用十字交叉法分別于處理后36h測定菌落生長直徑，根據(jù)式（1）和式（2）來計算菌絲生長抑制率。

2 結(jié)果與討論

2.1 野菊花莖葉揮發(fā)油的成分分析

每一個色譜峰對應(yīng)的質(zhì)譜圖經(jīng)過GC-MS聯(lián)用儀的計算機譜庫檢索進行定性，質(zhì)譜庫為NIST庫，版本為Library version 2.0，質(zhì)譜圖與其對應(yīng)圖譜的相似度（SI）均在85%以上。野菊花莖葉揮發(fā)油中的各個化學成分的相對含量依據(jù)總離子流圖由計算機采用峰面積歸一化法統(tǒng)計[13]。野菊花莖葉揮發(fā)油中的各個化學成分確定結(jié)果列于表1中。由表1可知，從野菊花莖葉揮發(fā)油中分離出48種譜峰，鑒定出的化學成分為32種，占揮發(fā)油總量的65.75%，主要是單萜類、倍半萜類化合物及其含氧衍生物，其中相對含量較高的成分有2-（亞-2，4-已二炔基）-1，6-二氧螺[4，4]壬-3-烯（17.93%），樟腦（11.40%），7，11-二甲基-3-亞甲基-1，6，10-十二碳三烯（9.44%），桉樹腦（5.64%），冰片（3.87%）等揮發(fā)性化合物。在文獻報道的野菊花揮發(fā)油成分中，最多確定出的化合物有54種[7]，最少的有18種[11]。野菊花的莖葉揮發(fā)油中的化學成分比野菊花的花序揮發(fā)油中的化學成分更為復(fù)雜多樣，成分種類差異也較大，雖均含有樟腦、冰片、松油醇、石竹烯氧化物[14]，但含量不同，其中在野菊花揮發(fā)油中石竹烯氧化物占25.196%，樟腦占1.75%，而在其莖葉揮發(fā)油中石竹烯氧化物只占到0.78%，樟腦占了11.40%。在野菊花的莖葉揮發(fā)油中發(fā)現(xiàn)了含量較高的2-（亞-2，4-已二炔基）-1，6-二氧螺[4，4]壬-3-烯，含量高達17.93%，這種化學成分在所有對野菊花揮發(fā)油中的研究報道中均沒有被發(fā)現(xiàn)，這說明野菊花的莖葉揮發(fā)油有一些特殊的活性成分，其揮發(fā)油會具有獨特的生物活性，這還有待進一步研究和開發(fā)。

2.2 野菊花莖葉揮發(fā)油的抑菌活性

野菊花莖葉揮發(fā)油的抑菌實驗結(jié)果如表2所示，不同濃度的野菊花莖葉揮發(fā)油對5種供試菌株均表現(xiàn)出不同程度的抑制活性，特別是野菊花莖葉揮發(fā)油對油菜菌核病菌的抑制效果明顯地要強于對蘋果炭疽病菌和核桃果炭疽病菌的抑制效果，野菊花的莖葉揮發(fā)油對5種植物病原真菌的抑菌活性大小依次為：油菜菌核病菌＞蘋果炭疽病菌＞煙草赤星病菌＞番茄灰霉病菌＞核桃果炭疽病菌。實際上植物揮發(fā)油呈現(xiàn)出多種獨特的生物活性，如有抗氧化活性可清除羥基自由基、消炎、理氣、止痛、滅菌、清熱解毒等[12]，一些已用于保健、衛(wèi)生、醫(yī)療和食品工業(yè)[13]，開發(fā)野菊花莖葉揮發(fā)油有廣闊的前景。野菊花莖葉揮發(fā)油是一種具有抑菌活性的物質(zhì)，其主要抑菌成分及含量還有待進一步研究。

3 結(jié)論

從秦巴山區(qū)野菊花的莖葉中提取揮發(fā)油，用GC-MS聯(lián)用技術(shù)分離和鑒定出了32種化學成分，其主要是單萜類、倍半萜類化合物及其含氧衍生物，和文獻報道的野菊花揮發(fā)油中的成分相比較[7，11]，成分種類差異較大，但是一些主要成分是一致的[14]。在野菊花的莖葉揮發(fā)油中發(fā)現(xiàn)了含量較高的成分：2-（亞-2，4-已二炔基）-1，6-二氧螺[4，4]壬-3-烯（2-（hexa-2，4-diyn-1-ylidene）-1，6-dioxas-piro[4，4] non-3-ene），其含量高達17.93%。野菊花的莖葉揮發(fā)油在測試濃度范圍內(nèi)對5種供試菌株均有明顯的抑制作用，抑菌活性大小依次為油菜菌核病菌＞蘋果炭疽病菌＞煙草赤星病菌＞番茄灰霉病菌＞核桃果炭疽病菌，對油菜菌核病菌的抑菌作用相對最為顯著。這里也僅是對野菊花的莖葉揮發(fā)油的抗菌活性做了初步的研究，由于野菊花的莖葉揮發(fā)油化學成分種類的復(fù)雜多樣性，其抗植物病原真菌的活性機理和其他生物活性實驗還需要進一步研究。

表1 野菊花莖葉中揮發(fā)油組分分析Table1 Chrysantheinum indicum L.volatile oil from leaves and stems of componentanalysis

表2 野菊花的莖葉揮發(fā)油對5種植物病原真菌的抑菌活性Table2 Chrysantheinum indicum L.leaf volatile oil of five kinds of antibacterial activity of plant pathogenic fungi

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