■ 劉曉慶 朱曉鳴 韓 冬，3 金俊琰 楊云霞 解綬啟

（1.安徽大學(xué)資源與環(huán)境工程學(xué)院，安徽合肥 230601；2.中國科學(xué)院水生生物研究所淡水生態(tài)與生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢 430072；3.淡水水產(chǎn)健康養(yǎng)殖湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北武漢 430070）

隨著世界漁業(yè)的發(fā)展，用于水產(chǎn)飼料的魚粉供應(yīng)嚴(yán)重不足。在養(yǎng)殖成本上，飼料通常占70%左右，而蛋白源占飼料成本的比例超過60%，因此，使用廉價(jià)的植物蛋白源替代魚粉將有利于降低養(yǎng)殖成本[1]。大豆蛋白質(zhì)含量高、氨基酸組成平衡、市場供給穩(wěn)定，被認(rèn)為是水產(chǎn)動(dòng)物的優(yōu)質(zhì)飼料原料[2]。大豆原產(chǎn)于我國，主產(chǎn)地東北是世界上最適宜種植大豆的地區(qū)之一，被稱為大豆種植的黃金地帶，國產(chǎn)大豆多為非轉(zhuǎn)基因大豆。在農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域，轉(zhuǎn)基因作物研究與開發(fā)在全球范圍內(nèi)取得舉世矚目進(jìn)展[3]，進(jìn)口轉(zhuǎn)基因大豆因其出油率比國產(chǎn)大豆高5%左右，能帶來更多經(jīng)濟(jì)效益并逐漸進(jìn)入中國大豆市場。1996年至2004年，跨國公司對(duì)中國的大豆出口占中國大豆進(jìn)口的90%[4]。然而轉(zhuǎn)基因大豆和非轉(zhuǎn)基因大豆的胰蛋白酶抑制劑鈍化方法的對(duì)比研究至今未見報(bào)道。

但是豆類植物的種子均廣泛存在多種類型的抗?fàn)I養(yǎng)因子，如胰蛋白酶抑制劑、植物凝集素和植酸等，限制了大豆的應(yīng)用[5]。大豆胰蛋白酶抑制劑（trypsin inhibitor，TI）或稱抗胰蛋白酶因子（anti?trypsin），是一種廣泛存在于自然界的多肽類或蛋白質(zhì)。它對(duì)植物本身具有保護(hù)作用，可防止大豆籽粒自身發(fā)生分解代謝，使種子處于休眠狀態(tài)，能調(diào)節(jié)大豆蛋白質(zhì)的合成與分解，并具有抗蟲作用，因而是大豆必需成分。然而其對(duì)動(dòng)物胰蛋白酶的抑制作用而使其成為大豆中主要抗?fàn)I養(yǎng)因子，從而降低了大豆蛋白的營養(yǎng)價(jià)值[6]。Westfall等研究發(fā)現(xiàn)，胰蛋白酶抑制劑是導(dǎo)致豆類蛋白質(zhì)利用率下降的最根本原因[7]。飼料中的大豆胰蛋白酶抑制劑會(huì)導(dǎo)致魚類氮的內(nèi)源性虧損，從而對(duì)魚類產(chǎn)生消極影響。因此，大豆胰蛋白酶抑制劑的鈍化對(duì)提高飼料的營養(yǎng)價(jià)值和食用安全性具有重大的意義。

眾多學(xué)者對(duì)大豆胰蛋白酶抑制因子的鈍化方法進(jìn)行過廣泛研究，加熱（蒸汽烘烤大豆粉）是目前最常用的降低胰蛋白酶抑制劑活性的方法[8]。胰蛋白酶抑制劑活性的降低程度與加熱溫度、加熱時(shí)間、顆粒大小以及水分情況相關(guān)。實(shí)際生產(chǎn)中，這些因素均要小心控制，以免大豆加熱不足或加熱過熟[9]。

本試驗(yàn)采用干熱法處理轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因大豆粉，測定不同熱處理溫度和時(shí)間對(duì)大豆胰蛋白酶抑制劑的鈍化效果以及對(duì)大豆蛋白質(zhì)溶解度的影響，以探討大豆粉適宜的熱處理溫度和時(shí)間，為大豆的加工處理和水產(chǎn)配合飼料中大豆的廣泛應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)原料

轉(zhuǎn)基因大豆來自阿根廷，水分含量8.36%；非轉(zhuǎn)基因大豆購自湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所，中油35號(hào)，水分含量8.66%。

1.2 大豆處理

非轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)基因大豆經(jīng)粉碎機(jī)粉碎后過80目篩，用四分法取樣。每種大豆粉分別取9份樣品，其中一份作為未處理大豆，其余8份放入鼓風(fēng)干燥箱中進(jìn)行熱處理，加熱溫度分別為60、80、100、120℃，加熱時(shí)間分別為1 h和2 h。每種大豆粉共9個(gè)處理，每個(gè)處理3個(gè)平行，加熱完畢后放入干燥器中冷卻備用。

1.3 胰蛋白酶抑制劑測試方法

1.3.1 用于胰蛋白酶抑制劑測定的樣品制備

稱取(1.000±0.001)g大豆粉樣品放入燒杯，加入0.01 mol/l NaOH溶液50 ml，將燒杯置于磁力攪拌器上，攪拌20 min后調(diào)節(jié)pH值到9.5，放入4℃冰箱中過夜。從冰箱取出后加4℃蒸餾水至100 ml，靜置15 min后開始試驗(yàn)。

1.3.2 胰蛋白酶溶液的配制

準(zhǔn)確稱取牛胰蛋白酶6.3 mg，溶于50 ml 0.001 mol/l HCl，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3.3 牛胰蛋白酶底物N-α-苯甲酰-DL-精氨酰-4-硝基苯胺鹽酸鹽（BAPNA）配制

稱取60 mg BAPNA，加入2 ml二甲基亞砜，5 min后BAPNA完全溶解，加37℃的Tris緩沖液定容到200 ml，37℃保存在棕色試劑瓶中，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3.4 胰蛋白酶抑制劑活性（TIA）的測定及計(jì)算方法

1.3.4.1 TIA測試方法

TIA的測定原理參照AACC 71-10法[10]，即胰蛋白酶作用于反應(yīng)底物BAPNA，釋放出黃色的對(duì)硝基苯胺，在410 nm波長有最大吸收峰;當(dāng)有胰蛋白酶抑制劑存在時(shí)，可以抑制這一反應(yīng)，使最大吸收峰值下降，其下降程度與TIA呈正比。

試驗(yàn)操作包括4個(gè)組，即試劑對(duì)照組、樣品對(duì)照組、非抑制組、樣品組。樣品對(duì)照組和樣品組分別取制備好的大豆樣品50、100、200 μl加入試管，試劑對(duì)照組及非抑制組不加入大豆樣品，所有試管再依次加入50 μl已溫育到37℃的胰蛋白酶液，再分別加入950、900、850、750 μl的反應(yīng)緩沖液Tris，隨即樣品對(duì)照組及試劑對(duì)照組分別各加入500 μl 30%冰醋酸溶液搖勻，所有試管37℃水浴20 min，結(jié)束后按順序依次加入2.5 ml BAPNA搖勻，非抑制組和樣品組在加入BAPNA后計(jì)時(shí)20 min，依次加入500 μl 30%醋酸，搖勻。當(dāng)反應(yīng)停止后，3 500 r/min離心10 min，在410 nm下使用多功能酶標(biāo)儀測定OD值。

1.3.4.2 TIA及相對(duì)抑制率值的計(jì)算

以未添加胰蛋白酶抑制劑樣品組數(shù)據(jù)為0刻度，將數(shù)據(jù)做回歸曲線，TIA值計(jì)算公式：

TIA（mg/g）=回歸曲線系數(shù)（OD/ml）×胰蛋白酶質(zhì)量（mg）×添加的NaOH體積（ml）/[胰蛋白酶抑制劑樣品質(zhì)量（g）×非抑制組OD值]；

相對(duì)抑制率（%）=（熱處理后大豆測定TIA/相應(yīng)未處理大豆測定TIA）×100。

每個(gè)樣品測定3次作為平行。

1.3.5 蛋白質(zhì)溶解度測試方法及結(jié)果計(jì)算

1.3.5.1 蛋白質(zhì)溶解度（PS）測定[11]

稱取1.5 g粉碎過篩處理后的大豆粉，放入燒杯中，加入75 ml 0.2%的KOH溶液，在磁力攪拌器中攪拌20 min。將攪拌好的液體轉(zhuǎn)入離心管中，以2 700 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min。離心停止以后，吸取上清液15 ml，放入消化管中，用凱氏定氮法測定其中蛋白質(zhì)含量，此含量相當(dāng)于0.3 g試樣中溶解在0.2%KOH里的蛋白質(zhì)的量。

1.3.5.2 蛋白質(zhì)溶解度（PS）的結(jié)果計(jì)算

蛋白質(zhì)溶解度（%）=15 ml上清液中粗蛋白質(zhì)的質(zhì)量/0.3 g樣品中粗蛋白含量×100。

每個(gè)樣品測定3次作為平行。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 加熱對(duì)大豆胰蛋白酶抑制劑活性的影響

胰蛋白酶抑制劑在大豆中的各部位均有分布，但主要存在于大豆的種子中。大豆種子中胰蛋白酶抑制劑的含量可達(dá)總蛋白的6%～8%[12]。經(jīng)過60～120℃不同加熱處理后大豆中胰蛋白酶抑制劑的活性變化如圖1～圖3及表1、表2所示。

圖1 1 h不同加熱溫度對(duì)胰蛋白酶抑制劑活性的影響

圖1表明，同一處理?xiàng)l件下，非轉(zhuǎn)基因大豆的胰蛋白酶抑制劑活性（TIA）均較轉(zhuǎn)基因大豆的低，未處理組非轉(zhuǎn)基因大豆的胰蛋白酶抑制劑活性比轉(zhuǎn)基因大豆的低9.91%。干熱處理可以降低轉(zhuǎn)基因及非轉(zhuǎn)基因大豆的TIA值（P＜0.05）。轉(zhuǎn)基因大豆在60℃和80℃的加熱溫度下加熱1 h，胰蛋白酶抑制劑活性（TIA）降低的不是很快（如圖3所示，相對(duì)抑制率分別為7.99%和11.1%），與未處理組無顯著性差異(P＞0.05)。由圖1可知，當(dāng)溫度升至100℃，甚至120℃時(shí)，其活性迅速下降，與未處理組存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。經(jīng)過1 h加熱，轉(zhuǎn)基因大豆的TIA總體仍維持在較高水平，120℃熱處理組的TIA為未處理組的56.43%。非轉(zhuǎn)基因大豆經(jīng)各處理溫度1 h加熱后，大豆胰蛋白酶抑制劑活性亦迅速降低（P＜0.05）。除60℃組與未處理組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異外(P＞0.05)，其它各組與未處理組相比差異顯著(P＜0.05)。非轉(zhuǎn)基因大豆經(jīng)120℃、1 h加熱后，TIA已降至未處理時(shí)的28.80%。

圖2 2 h不同加熱溫度對(duì)胰蛋白酶抑制劑活性的影響

圖3 不同熱處理對(duì)胰蛋白酶抑制劑相對(duì)抑制率的影響

表1 不同加熱溫度和時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆胰蛋白酶抑制劑活性影響的方差分析

表2 不同加熱溫度和時(shí)間對(duì)非轉(zhuǎn)基因大豆胰蛋白酶抑制劑活性影響的方差分析

如圖2所示，加熱時(shí)間延長至2 h時(shí)，60℃處理即可使轉(zhuǎn)基因大豆TIA迅速降低至較低水平，胰蛋白酶抑制劑的相對(duì)抑制率達(dá)到42.19%。之后，隨著溫度的上升，大豆胰蛋白酶抑制劑活性繼續(xù)降低，但降低幅度有所減小。除80℃和100℃熱處理組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異外(P＞0.05)，其它各組間均存在顯著性差異(P＜0.05)。與轉(zhuǎn)基因大豆相似，非轉(zhuǎn)基因大豆經(jīng)過60℃、2 h加熱，TIA亦迅速降低至較低水平。之后，隨著溫度的升高，大豆TIA下降幅度均較小，60、80、100℃熱處理組間均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。120℃、2 h可有效抑制大豆TIA，在該條件下轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因大豆的胰蛋白酶抑制劑活性的相對(duì)抑制率分別為73.64%和78.79%。

如圖3所示，胰蛋白酶抑制因子的相對(duì)抑制率隨著加熱時(shí)間和溫度的變化而變化。由表1、2可知，不同加熱溫度和時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆和非轉(zhuǎn)基因大豆胰蛋白酶抑制劑活性的影響無交互作用。轉(zhuǎn)基因大豆及非轉(zhuǎn)基因大豆經(jīng)過120℃、2 h的熱處理后相對(duì)抑制率均達(dá)到70%以上，非轉(zhuǎn)基因大豆的相對(duì)抑制率幾乎每種處理下都高于轉(zhuǎn)基因大豆。

2.2 加熱對(duì)大豆蛋白質(zhì)溶解度的影響

經(jīng)過不同溫度（60～120℃）、不同加熱時(shí)間（1、2 h）處理后大豆中蛋白質(zhì)溶解度的變化如圖4及表3、表4所示。隨著加熱溫度的升高，轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因大豆的蛋白質(zhì)溶解度均發(fā)生波動(dòng)，且呈現(xiàn)出無規(guī)則的變化趨勢。試驗(yàn)結(jié)果顯示，各組大豆的蛋白質(zhì)溶解度均在69.85%至78.06%之間。由表3、4可知，不同加熱溫度和時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆和非轉(zhuǎn)基因大豆蛋白質(zhì)溶解度的影響有交互作用。

圖4 不同熱處理對(duì)蛋白質(zhì)溶解度的影響

表3 不同加熱溫度和時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆蛋白質(zhì)溶解度影響的方差分析

表4 不同加熱溫度和時(shí)間對(duì)非轉(zhuǎn)基因大豆蛋白質(zhì)溶解度影響的方差分析

3 討論

3.1 大豆胰蛋白酶抑制劑及其鈍化方法探討

國內(nèi)外大豆胰蛋白酶抑制劑的研究有較長歷史[13]，目前國外研究較多地集中在胰蛋白酶抑制劑的結(jié)構(gòu)及其與靶酶的作用機(jī)理、胰蛋白酶抑制劑的基因表達(dá)等方面。國內(nèi)近年對(duì)飼料中胰蛋白酶抑制劑的去除方法及其效果開展了一些研究，對(duì)生產(chǎn)實(shí)踐起到了指導(dǎo)作用[14]。大豆胰蛋白酶抑制劑等抗?fàn)I養(yǎng)因子的鈍化方法有物理方法、化學(xué)方法和生物學(xué)方法?；瘜W(xué)處理方法的原理為化學(xué)物質(zhì)與抗?fàn)I養(yǎng)因子中的二硫鍵結(jié)合，使其分子結(jié)構(gòu)改變而失去活性，但是具有藥品殘留的問題。理論上講，生物學(xué)方法是降解大豆抗?fàn)I養(yǎng)因子最徹底的手段，但是酶制劑的耐受性、穩(wěn)定性以及影響酶制劑作用的外在因素等問題有待進(jìn)一步深入研究[15]。物理方法是最常用的方法，利用胰蛋白酶抑制劑的熱敏感性對(duì)抑制劑進(jìn)行鈍化處理。在未來的研究中我們需注重不同鈍化方法的交叉結(jié)合工藝創(chuàng)新，做到在不影響大豆及其制品營養(yǎng)成分流失的前提下，最大限度去除抗?fàn)I養(yǎng)因子。

3.2 轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因大豆的對(duì)比研究

大豆、菜籽和玉米都是魚粉的優(yōu)質(zhì)替代蛋白源，目前國際市場上提供的這些原料大部分都是轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品[16]。水產(chǎn)飼料中使用轉(zhuǎn)基因作物對(duì)養(yǎng)殖魚類的安全和質(zhì)量的影響需要進(jìn)行研究和評(píng)價(jià)。Sanden等（2004）[16]指出，水產(chǎn)飼料使用轉(zhuǎn)基因大豆的影響主要出于兩方面的考慮：①養(yǎng)殖魚類的安全，是否影響魚類的生理、生化指標(biāo)，尤其是生長；②食品安全，轉(zhuǎn)基因片段轉(zhuǎn)移并殘留于魚體。Hammond等(1996)[17]和 Padgette等(1995)[18]使用轉(zhuǎn)基因大豆和非轉(zhuǎn)基因大豆對(duì)鯰進(jìn)行養(yǎng)殖試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)鯰的增重和魚體成分等參數(shù)均無顯著差異。Sanden等（2004）[16]研究也發(fā)現(xiàn)，大西洋鮭攝食轉(zhuǎn)基因大豆的飼料后，生長狀態(tài)與攝食非轉(zhuǎn)基因大豆飼料的對(duì)照組一致，且轉(zhuǎn)基因片段不殘留于魚體組織。這些研究均符合轉(zhuǎn)基因食品營養(yǎng)評(píng)價(jià)原則上應(yīng)遵循“實(shí)質(zhì)等同”的判斷標(biāo)準(zhǔn)，即轉(zhuǎn)基因食品的營養(yǎng)價(jià)值應(yīng)與親本食品沒有差別。就本試驗(yàn)檢測的產(chǎn)品而言，各處理組轉(zhuǎn)基因大豆的胰蛋白酶抑制劑活性均高于非轉(zhuǎn)基因；并且大豆經(jīng)過高溫加熱處理之后胰蛋白酶抑制劑活性可被有效滅活。

3.3 加熱對(duì)胰蛋白酶抑制劑的影響

大豆胰蛋白酶抑制劑是大豆中主要的抗?fàn)I養(yǎng)因子，目前被發(fā)現(xiàn)的有7～10種，其中兩種研究的較為詳細(xì)，即 Kunitz(KTI)和 Bowman-Birk(BBI)[19]。Kunitz型抑制因子有一個(gè)活性中心，可等量結(jié)合腸道胰蛋白酶，被稱為單頭抑制；Bowman-Birk型抑制因子有兩個(gè)活性中心，可分別結(jié)合胰蛋白酶和糜蛋白酶，被稱為雙頭抑制。由于結(jié)構(gòu)上的差異，KTI對(duì)抗酸、抗熱的能力比BBI要弱。加熱會(huì)使大豆胰蛋白酶抑制劑失活，但是熱處理效果受到大豆品種、含水量、顆粒大小及加熱溫度、壓力和時(shí)間的影響。Gujska等(1991)[20]報(bào)道，加熱溫度在130～140℃之間，不論熱處理過程壓力多大、顆粒形狀大小如何，均可以有效地鈍化超過85%的胰蛋白酶抑制劑。本試驗(yàn)中，轉(zhuǎn)基因大豆和非轉(zhuǎn)基因大豆的胰蛋白酶抑制劑活性均隨著加熱溫度的升高和加熱時(shí)間的延長而降低。這與梁玉梅等（2006）[21]和 Anderson（1992）[22]的研究結(jié)果一致。加熱時(shí)間為1 h時(shí)，非轉(zhuǎn)基因大豆胰蛋白酶抑制劑活性降低的幅度大于轉(zhuǎn)基因大豆，即非轉(zhuǎn)基因大豆胰蛋白酶抑制劑活性對(duì)于熱處理更為敏感，這可能與轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因大豆中不同類型胰蛋白酶抑制劑的含量不同有關(guān)，有待進(jìn)一步研究。

對(duì)大豆熱處理適宜程度一般是以抗?fàn)I養(yǎng)因子的活性來判斷的。Honig等(1987)[23]、Liener(1994)[9]、林建斌等（1999）[24]的研究認(rèn)為，大豆胰蛋白酶抑制劑活性只要失活75%～85%，大豆蛋白質(zhì)的營養(yǎng)效價(jià)最高。本試驗(yàn)中，轉(zhuǎn)基因大豆和非轉(zhuǎn)基因大豆通過120℃、2 h的熱處理都達(dá)到了胰蛋白酶抑制劑活性失活73.64%～78.79%的程度，因此120℃、2 h可以作為本試驗(yàn)中最優(yōu)處理?xiàng)l件。

3.4 加熱對(duì)蛋白質(zhì)溶解度的影響

加熱程度對(duì)大豆的營養(yǎng)品質(zhì)影響較大。加熱不足，胰蛋白酶抑制劑破壞不充分，降低蛋白質(zhì)的消化率；加熱過度，雖然胰蛋白酶抑制劑已失活，但會(huì)使蛋白質(zhì)發(fā)生變性，溶解度降低，特別是引起賴氨酸、精氨酸和胱氨酸的破壞或消化率降低[25]。目前，國內(nèi)外并無以蛋白質(zhì)溶解度評(píng)價(jià)大豆的生熟度的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。楊秀文等（1995）[26]用肉雞做試驗(yàn)，以蛋白質(zhì)溶解度為判斷指標(biāo)，認(rèn)為PS＞85%時(shí)為過生，70%≤PS≤85%時(shí)為加熱正常，PS＜70%時(shí)為加熱過熟；梁邢文（1995）[27]認(rèn)為，蛋白質(zhì)溶解度在60%～80%之間為加熱適度；曹志華等（2004）[28]研究認(rèn)為，大豆加熱過生時(shí)，PS＞87%，而過熟則PS＜41%。從本試驗(yàn)的結(jié)果可看出，各組大豆的蛋白質(zhì)溶解度均在69.85%至78.06%之間，屬于正常加熱。但是隨著加熱溫度的升高，大豆蛋白質(zhì)溶解度發(fā)生無規(guī)則波動(dòng)。因此，推測蛋白質(zhì)溶解度不是評(píng)判大豆生熟度的最適指標(biāo)。

4 結(jié)論

水產(chǎn)飼料中魚粉的需求量和價(jià)格的不斷上升以及產(chǎn)量的日趨下降，尋找優(yōu)質(zhì)的替代蛋白源已成為水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵問題。大豆作為優(yōu)質(zhì)魚粉替代物被廣泛地加以研究，然而胰蛋白酶抑制劑的存在限制了其應(yīng)用。因此，對(duì)大豆胰蛋白酶抑制劑的鈍化研究十分必要。本試驗(yàn)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因大豆含有較高的胰蛋白酶抑制劑；隨著加熱溫度的提高和加熱時(shí)間的延長，轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因大豆的胰蛋白酶抑制劑的活性逐漸降低；加熱處理與大豆蛋白質(zhì)溶解度的相關(guān)性差。