■ 稅朝毅 吳力克 張 娟 陳丙波

(1.第三軍醫(yī)大學(xué)微生態(tài)研發(fā)中心，重慶 400038；2.第三軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心，重慶 400038)

白酒丟糟是白酒釀造工藝中的主要副產(chǎn)物。初步分析，白酒丟糟中除了含有蛋白質(zhì)外，還含有豐富的纖維素、木質(zhì)素、脂肪、磷、鈣以及豐富的B族維生素和生長素等物質(zhì)，營養(yǎng)價值比較豐富[1-2]。為了提高白酒丟糟的利用價值，可運用現(xiàn)代生物技術(shù)對其進行處理，將內(nèi)含的纖維素、木質(zhì)素降解[3-4]，并通過增加其中的益生菌及其代謝產(chǎn)物，改變白酒丟糟的營養(yǎng)成分及其含量，轉(zhuǎn)化為動物生長可利用的物質(zhì)。

本試驗是以白酒丟糟為基料，先運用木質(zhì)素酶和纖維素酶兩種粗酶液進行酶解[5-6]，進而以益生菌單菌（分別為納豆芽孢桿菌、啤酒酵母菌、米根霉菌）、益生菌兩菌組合以及三菌組合，對酶解處理后的白酒丟糟產(chǎn)物進行固態(tài)發(fā)酵[7]。通過分析比較白酒丟糟原料、其酶解產(chǎn)物和固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物中的營養(yǎng)成分及其含量變化（包括粗蛋白、粗脂肪、粗纖維、氨基酸等項目），為利用白酒釀制的副產(chǎn)物——白酒丟糟開發(fā)生產(chǎn)優(yōu)良的生物飼料和/或微生態(tài)制劑類飼料添加劑產(chǎn)品提供相關(guān)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與儀器

1.1.1 主要原料

白酒丟糟：重慶江津酒廠提供，使用前經(jīng)曬干、粉碎，20目過篩；麩皮：石家莊市禾惠食品公司提供；豆粕：石家莊牧樂商貿(mào)有限公司提供；尿素：成都市科龍化工試劑廠提供。

1.1.2 主要試劑

牛肉膏、蛋白胨：北京奧博星生物技術(shù)有限公司；葡萄糖、氯化鈉、氫氧化鈉：成都市科龍化工試劑廠；磷酸二氫鉀：重慶北碚化學(xué)試劑廠；硫酸鎂：重慶博藝化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 主要儀器

電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；高壓蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；超凈工作臺：蘇州凈化設(shè)備有限公司；恒溫?fù)u床：上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；電子天平：上海光正醫(yī)療儀器有限公司；實驗型固態(tài)發(fā)酵裝置：第三軍醫(yī)大學(xué)微生態(tài)研發(fā)中心自制。

1.1.4 試驗菌種

啤酒酵母菌、米根霉菌、納豆芽孢桿菌、云芝菌、綠色木霉菌由第三軍醫(yī)大學(xué)微生態(tài)研發(fā)中心菌種庫保存。

1.1.5 試驗用菌種培養(yǎng)基

普通培養(yǎng)基：牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、氯化鈉5 g、蒸餾水 1 000 ml，pH 值7.0～7.2，121 ℃滅菌20 min，冷卻備用。

沙氏培養(yǎng)基：葡萄糖20 g、蛋白胨10 g、蒸餾水 1 000 ml，pH值6.8～7.0，115 ℃滅菌20 min，冷卻備用。

綜合PDA培養(yǎng)基：20%馬鈴薯汁1 000 ml、葡萄糖20 g、磷酸二氫鉀3 g、硫酸鎂1.5 g，pH值5.8～6.0，115℃滅菌20 min,冷卻備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 酶解液制備及白酒丟糟酶解過程

1.2.1.1 云芝和綠色木霉的復(fù)蘇

配制綜合PDA培養(yǎng)基，121℃滅菌20 min，冷卻至30℃?zhèn)溆?。分別取云芝和綠色木霉斜面菌種各一支在超凈工作臺上接種于冷卻后的綜合PDA培養(yǎng)基中，150 r/min、28℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)，其中云芝培養(yǎng)5 d，綠色木霉培養(yǎng)3 d。

1.2.1.2 木質(zhì)素酶和纖維素酶的制備

將復(fù)蘇后的液體菌種分別接種于滅菌冷卻后的綜合PDA培養(yǎng)基中，接種量為2%,150 r/min、28℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)，木質(zhì)素酶生產(chǎn)菌培養(yǎng)12 d[8]，纖維素酶生產(chǎn)菌培養(yǎng)5 d[9]，發(fā)酵終止后，離心發(fā)酵液，所得上清液即為木質(zhì)素酶和纖維素酶粗酶液。

1.2.1.3 木質(zhì)素酶和纖維素酶對白酒丟糟的酶解過程

將白酒丟糟粗粉（20目）121℃滅菌30 min后冷卻至室溫，加入酶解液,比例為白酒丟糟∶酶解液=1∶2(其中木質(zhì)素酶∶纖維素酶=1∶1)，混勻后密封，放入30℃的環(huán)境中靜置3 d后,酶解結(jié)束。將酶解后產(chǎn)物經(jīng)40℃真空干燥后備用。

1.2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基基質(zhì)制備和發(fā)酵過程

1.2.2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基基質(zhì)制備

以上述酶解產(chǎn)物為主要基料，輔以麩皮、豆粕、尿素等，按酶解產(chǎn)物100份+麩皮2份+豆粕2份+尿素1份，加適量無菌水,pH值為6.0～6.5，作為發(fā)酵培養(yǎng)基,放入高壓滅菌鍋，在121℃下殺菌30 min,冷卻備用。

1.2.2.2 固態(tài)發(fā)酵用菌種的制備方法

啤酒酵母菌：啤酒酵母菌株在沙氏培養(yǎng)基30℃液體培養(yǎng)48 h后，用接種環(huán)取3～5環(huán)到錐形瓶，180 r/min培養(yǎng)48 h；米根霉菌：米根霉菌株在綜合PDA培養(yǎng)基30℃液體培養(yǎng)24 h后，取2%的量接種到錐形瓶，180 r/min培養(yǎng)24 h；納豆芽孢桿菌：納豆芽孢桿菌菌株在普通培養(yǎng)基37℃液體培養(yǎng)24 h后，取2%的量接種到廣口瓶靜置培養(yǎng)24 h。

1.2.2.3 固態(tài)發(fā)酵過程

將上述益生菌種子菌液按10%的接種量，接入自制的實驗型固態(tài)發(fā)酵器(發(fā)酵基質(zhì)100份+麩皮2份+豆粕2份+尿素1份)中，無菌條件下拌勻，使含水量在65%～70%，于（30±1）℃培養(yǎng)96 h，期間翻曲。于發(fā)酵終點收集發(fā)酵產(chǎn)物，40℃通風(fēng)干燥后包裝收藏（酶解及固態(tài)發(fā)酵過程見圖1）。

圖1 酶解及固態(tài)發(fā)酵過程

1.2.3 營養(yǎng)成分分析方法

粗蛋白、粗脂肪、粗纖維測定分析分別采用GB/T 6432—94、GB/T 6433—2006、GB/T 6434—2006等規(guī)定的方法。氨基酸定量分析采用日立L—8800型全自動氨基酸分析儀測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 酶解處理對粗纖維含量的影響

白酒丟糟雖然是經(jīng)提取后的棄渣，但是其中仍含有大量的營養(yǎng)成分，很多成分被包裹在渣體原料的細(xì)胞壁內(nèi)。細(xì)胞壁是由纖維素、半纖維素、果膠質(zhì)、木質(zhì)素等物質(zhì)構(gòu)成的致密結(jié)構(gòu)，對其進行破除有利于營養(yǎng)成分的析出以及被益生菌充分利用。本試驗在上述確定的酶解條件及過程下，對白酒丟糟進行酶解。經(jīng)測定，白酒丟糟酶解前后的粗纖維含量結(jié)果如表1所示。

表1 白酒丟糟酶解前后的粗纖維含量（g/100 g）

表1結(jié)果表明,酶解后的白酒丟糟酶解產(chǎn)物中，粗纖維含量降低了11.2 g/100 g，降低幅度達50.9%。上述結(jié)果提示，選用纖維素酶、木質(zhì)素酶液對白酒丟糟進行酶解，可以使細(xì)胞壁及細(xì)胞間質(zhì)中的纖維素、半纖維素、木質(zhì)素等物質(zhì)發(fā)生降解，破壞細(xì)胞壁的致密構(gòu)造，減小細(xì)胞壁、細(xì)胞間質(zhì)等傳質(zhì)屏障對營養(yǎng)成分從胞內(nèi)向外的傳質(zhì)阻力，從而有利于營養(yǎng)成分的溶出。

2.2 益生菌不同組合方式固體發(fā)酵對發(fā)酵產(chǎn)物中營養(yǎng)成分含量的影響

本文將試驗用益生菌菌種分為各個單菌、每兩菌組合、三菌組合共7組，各組配比見表2。

表2 試驗益生菌菌種分組

利用已制備的發(fā)酵培養(yǎng)基，按表2進行分組接種各組益生菌菌液，按照上述確定的發(fā)酵過程進行發(fā)酵，對發(fā)酵產(chǎn)物和原始白酒丟糟進行營養(yǎng)成分測定和比較，結(jié)果如表3～表4所示。

表3 原始白酒丟糟與各發(fā)酵產(chǎn)物中營養(yǎng)成分含量（g/100 g）

表3結(jié)果表明：與原始白酒丟糟相比，各發(fā)酵產(chǎn)物中粗蛋白、粗脂肪、氨基酸含量均增加，而粗纖維含量均下降，干物質(zhì)總量變化則不明顯。其中：粗蛋白含量分別增加了36.47%、38.45%、40.08%、58.33%、57.40%、59.77%、85.50%；粗脂肪含量分別增加了15.65%、12.24%、17.69%、46.94%、53.74%、48.30%、76.19%；粗纖維含量分別降低了51.00%、51.04%、51.09%、51.04%、50.95%、51.09%、51.14%；氨基酸含量分別增加了26.75%、27.60%、28.06%、57.53%、61.65%、60.34%、97.94%。

表4 原始白酒丟糟與各發(fā)酵產(chǎn)物中氨基酸含量（g/100 g）

分析上述各組試驗結(jié)果，表明：①綜合考慮各項指標(biāo)，A組（啤酒酵母）發(fā)酵產(chǎn)物中各營養(yǎng)組分增加幅度與其它發(fā)酵組比較最低，提示單純酵母發(fā)酵效果一般，但試驗中發(fā)現(xiàn)酵母菌在以酒糟為基礎(chǔ)培養(yǎng)基發(fā)酵過程中增殖和存活度較高（另文發(fā)表）。已知啤酒酵母菌富含蛋白質(zhì)、核酸、多種維生素和酶等特殊營養(yǎng)成分，應(yīng)用于飼料中保證飼料適口性好，可提高消化吸收率，改善腸道微生態(tài)環(huán)境[10]，故A組發(fā)酵產(chǎn)物可能具有特殊營養(yǎng)意義。②B組（米根霉）發(fā)酵產(chǎn)物中蛋白質(zhì)和氨基酸的增加幅度優(yōu)于A組發(fā)酵產(chǎn)物，提示其中的蛋白酶活躍程度高于后者。有文獻報道，米根霉菌在發(fā)酵過程中還能分泌淀粉酶[11]、糖化酶[12]和脂肪酶[13]，可降解植物性飼料中某些復(fù)雜的碳水化合物，如將淀粉轉(zhuǎn)化為葡萄糖利用，從而能夠提高飼料轉(zhuǎn)化率；還可產(chǎn)生乳酸[14]，而后者具有良好風(fēng)味，可增加家畜飼料的適口性；米根霉菌體、菌絲均為白色，使發(fā)酵后發(fā)酵產(chǎn)物的色澤外觀易于被飼喂動物接受。③對C組（納豆芽孢桿菌）發(fā)酵產(chǎn)物中的營養(yǎng)成分含量變化進行分析，發(fā)現(xiàn)其粗蛋白、粗脂肪和氨基酸的增加幅度優(yōu)于A組和B組，提示納豆芽孢桿菌較啤酒酵母和米根霉具有更強的蛋白酶和脂肪酶活性[15]，對改善發(fā)酵對象（白酒丟糟）的營養(yǎng)品質(zhì)作用更為明顯，已有文獻報道，在豬飼料中添加納豆芽孢桿菌能明顯提高仔豬生長性能和飼料轉(zhuǎn)化率。④分析D組（啤酒酵母+米根霉）發(fā)酵產(chǎn)物、E組（啤酒酵母+納豆芽孢桿菌）發(fā)酵產(chǎn)物和F組（米根霉+納豆芽孢桿菌）發(fā)酵產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)任兩種上述益生菌組合發(fā)酵白酒丟糟，其發(fā)酵產(chǎn)物中粗蛋白、粗脂肪和氨基酸的增加幅度均優(yōu)于前述的單菌種發(fā)酵，提示益生菌混合發(fā)酵對改善發(fā)酵對象（白酒丟糟）營養(yǎng)品質(zhì)的作用優(yōu)于單菌發(fā)酵。⑤最后，將三種前述益生菌共混發(fā)酵，得G組（啤酒酵母+米根霉+納豆芽孢桿菌）發(fā)酵產(chǎn)物，從表3結(jié)果可知，三菌共混發(fā)酵產(chǎn)物中粗蛋白、粗脂肪和氨基酸的增加幅度明顯優(yōu)于前述的單菌種發(fā)酵和兩菌混合發(fā)酵，提示多菌混合發(fā)酵為有效改善發(fā)酵對象（白酒丟糟）營養(yǎng)品質(zhì)的更佳方式。

分析表1、表3結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，無論單菌發(fā)酵、雙菌混合發(fā)酵還是三菌共混發(fā)酵，均未對粗纖維和干物質(zhì)的含量變化產(chǎn)生明顯影響，試驗結(jié)果提示：①發(fā)酵產(chǎn)物中粗纖維的減少主要是前期酶解工藝中應(yīng)用云芝和綠色木霉的結(jié)果，即啤酒酵母、米根霉和納豆芽孢桿菌并無顯著分解纖維素和木質(zhì)素的能力，與文獻報道相符[16-17]。②發(fā)酵產(chǎn)物中的干物質(zhì)總量與原始白酒丟糟比較，并無顯著變化，提示所用益生菌主要參與了對發(fā)酵對象（白酒丟糟）的生物轉(zhuǎn)化過程，其本身的生物量并未對各發(fā)酵產(chǎn)物的構(gòu)成產(chǎn)生顯著影響。

2.3 各組發(fā)酵產(chǎn)物中基礎(chǔ)營養(yǎng)物質(zhì)——氨基酸含量比較

表4結(jié)果表明：經(jīng)過啤酒酵母、米根霉和納豆芽孢桿菌三種益生菌單菌、兩兩菌組合與三菌組合發(fā)酵后，各組白酒丟糟發(fā)酵產(chǎn)物中各類氨基酸均有增加，其中三菌組合發(fā)酵后各種氨基酸增加量優(yōu)于兩兩菌組合發(fā)酵后各種氨基酸含量，而兩兩菌組合發(fā)酵后各種氨基酸增加量又優(yōu)于單菌發(fā)酵。所測得A、B、C、D、E、F、G各組發(fā)酵產(chǎn)物中，必需氨基酸含量增加幅度分別為32.39%、33.58%、34.13%、81.24%、86.50%、81.11%、134.52%，數(shù)據(jù)提示，三菌共混發(fā)酵產(chǎn)物中的必需氨基酸含量顯著高于前述各組，營養(yǎng)價值明顯提高。

3 小結(jié)

本試驗應(yīng)用微生態(tài)工程技術(shù)，對白酒釀造產(chǎn)業(yè)中產(chǎn)出量最大、營養(yǎng)價值和利用價值最低的副產(chǎn)品——白酒丟糟(以稻殼和高粱殼為主，主要用作白酒發(fā)酵過程的通氣墊料)進行生物轉(zhuǎn)化改造，旨在通過大幅提高其基礎(chǔ)營養(yǎng)和特殊營養(yǎng)價值，使其能夠成為飼料原料和/或生物飼料。飼料的品質(zhì)不僅影響飼糧的適口性、采食量和消化率，而且影響豬對飼料的利用率、日增重和胴體的品質(zhì)。研究結(jié)果表明，應(yīng)用微生物來源的木質(zhì)素酶和纖維素酶酶解工藝，能夠有效降解白酒丟糟中的纖維素和木質(zhì)素，增加細(xì)胞及其胞壁內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)的溶出；應(yīng)用適合于固體發(fā)酵的啤酒酵母、米根霉和納豆芽孢桿菌三種益生菌進行單菌發(fā)酵、兩菌混菌發(fā)酵和三菌共混固體發(fā)酵工藝，得到不同發(fā)酵產(chǎn)物，經(jīng)與原始白酒丟糟比較分析，發(fā)酵產(chǎn)物中的主要營養(yǎng)成分——粗蛋白、粗脂肪及總氨基酸的含量明顯提高，必需氨基酸含量亦明顯增加，而營養(yǎng)抗性物質(zhì)——粗纖維的含量則大幅下降，說明本技術(shù)工藝明顯提升了白酒丟糟的營養(yǎng)價值，而其中又以多菌共混發(fā)酵效果最佳。此外，研究還發(fā)現(xiàn)各組發(fā)酵產(chǎn)物中存在大量活性益生菌及其產(chǎn)生的極其豐富的特殊營養(yǎng)和功效成分（另文發(fā)表），進一步提高了發(fā)酵產(chǎn)物的營養(yǎng)和功能價值。本文結(jié)果初步表明，白酒丟糟可通過先進的生物技術(shù)手段轉(zhuǎn)換成優(yōu)良的飼料原料、配料、添加劑或直接用作生物飼料，大幅提高該副產(chǎn)品的附加值；不僅為白酒釀造業(yè)的主要副產(chǎn)品之一——白酒丟糟找到了理想的出路，在避免環(huán)境污染問題的同時提高企業(yè)的經(jīng)濟效益，還能夠為生態(tài)養(yǎng)殖業(yè)提供成本低廉、品質(zhì)優(yōu)良的飼料來源，具有廣闊的市場前景和巨大的社會和生態(tài)效益。