田燚，張丙龍，常亞青，董萍萍，陳百堯，伏光輝，安建

(1.大連海洋大學農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點開放實驗室，遼寧大連116023;2.連云港市海洋與水產(chǎn)科學研究所，江蘇連云港222044;3.連云港市海珍品增養(yǎng)殖試驗場，江蘇連云港 222044）

刺參Y－box基因的克隆與表達分析

田燚1，張丙龍1，常亞青1，董萍萍1，陳百堯2、3，伏光輝2、3，安建2、3

(1.大連海洋大學農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點開放實驗室，遼寧大連116023;2.連云港市海洋與水產(chǎn)科學研究所，江蘇連云港222044;3.連云港市海珍品增養(yǎng)殖試驗場，江蘇連云港 222044）

為了探究Y－box基因在刺參Apostichopus japonicus胚胎發(fā)育及性別分化中的作用，根據(jù)已有的EST序列，通過RACE技術克隆了刺參Y－box基因的cDNA全長序列，并利用實時定量PCR技術進行了表達模式分析。結果表明:刺參Y－box基因cDNA全長為1 142 bp，5'端UTR為102 bp，3'端UTR為215 bp，開放閱讀框 (ORF）為825 bp;Y－box基因cDNA全長編碼274個氨基酸的前體蛋白，預測蛋白的相對分子質量為31 100，理論等電點為9.46，是親水性蛋白;刺參Y－box氨基酸序列包含氨基酸N末端結構域、C末端結構域和冷休克結構域 (CSD），其中CSD區(qū)在Y－box結合蛋白家族中非常保守;刺參Y－box結合蛋白質的二級結構沒有α－螺旋和β－折疊，無規(guī)則卷曲占87.23%，延伸鏈占12.77%;刺參與其他物種的Y－box氨基酸的相似度為27%～41%，在冷休克區(qū)相似度很高，達到75%以上;構建的系統(tǒng)進化樹表明，刺參與加州海兔Aplysia californica、櫛孔扇貝Chlamys farreri、玻璃海鞘Ciona intestinalis聚為一支，為海洋無脊椎動物;經(jīng)實時定量PCR檢測，Y－box基因在小耳幼體中表達水平最高，且顯著高于其他各發(fā)育階段(P＜0.05），在雄性性腺中的表達量顯著高于雌性性腺 (P＜0.05）。研究表明，Y－box基因在刺參的胚胎發(fā)育及性別分化中發(fā)揮重要作用。

刺參;Y－box基因克隆;序列分析;基因表達

Y－box結合蛋白是從細菌到人類都高度保守的多功能蛋白家族，在轉錄調節(jié)、選擇性剪接、DNA修復、翻譯調控、細胞增殖和再生等多方面具有重要作用［1－5］。關于Y－box結合蛋白家族生物學功能的研究很多，其中包括冷適應功能、轉錄調節(jié)功能和蛋白質翻譯調控功能等。真核生物中Y－box結合蛋白在轉錄激活和抑制兩個方面發(fā)揮其轉錄調節(jié)功能。低溫下，Y－box基因mRNA能夠成功合成冷休克蛋白，而其他蛋白質的翻譯過程則被阻止［6］。有研究表明，在多數(shù)動物組織中均能檢測到Y－box基因的表達，高表達量出現(xiàn)在肝臟、卵巢和睪丸組織中［7］。

刺參Apostichopus japonicus又名仿刺參，在中國主要分布于黃渤海海域，屬典型的溫帶種，是經(jīng)濟價值很高的海產(chǎn)品，現(xiàn)已成為中國北方沿海重要的養(yǎng)殖品種之一［8－9］。目前，關于刺參性別分化及決定相關功能基因的研究相對較少。龐振國等［10］研究了二硫蘇糖醇對刺參卵母細胞體外成熟的影響;田燚等［11］克隆了刺參性別相關基因P450c17并進行了序列分析;臧云鵬［12］進行了刺參性別差異的研究;隋娟等［13］研究了刺參vasa－1ike基因在組織中的表達。為了進一步了解刺參的性別決定和分化的分子機制，本研究中克隆了刺參Y－box基因，分析其氨基酸序列，預測蛋白質的性質及結構，探討其在不同組織、不同發(fā)育時間和性腺中的表達情況，旨在為刺參的性別決定機制提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用刺參取自大連市瓦房店海區(qū)，在大連海洋大學農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點開放實驗室暫養(yǎng)一周后開始試驗。刺參體質量為 (24.15±0.17）g，養(yǎng)殖用水為沙濾海水，pH為7.98，鹽度為31。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取與反轉錄 利用Trizol法提取刺參體腔液的總RNA，RNA的濃度及完整性利用紫外分光光度計與10 g/L瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，符合要求后于－80℃下保存?zhèn)溆?，并按照BD SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit試劑盒說明書的方法合成SMART cDNA。反轉錄體系:總RNA 100 ng，5×M－MLV Buffer 2 μL，RTase MMLV(200U/μL）0.25 μL，oligo(dT）1 μL，dNTP 0.5 μL，RNase Inhibitor(40 U/μL）0.25 μL，用水定容至10 μL。將RNA于65℃下變性后冰浴，在冰上迅速加入上述成分后于42℃下水浴，于70℃下保溫后冰上冷卻，獲得cDNA第一條鏈。1.2.2 RACE擴增及產(chǎn)物的克隆和測序 根據(jù)本實驗室已獲得的EST序列 (GH550810.1），應用Primer Premier 5.0軟件設計RACE的特異性引物F、R(表1）。利用SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit試劑盒，進行刺參Y－box基因cDNA全長的克隆。反應體系共25 μL，包括cDNA 1 μL，引物各 0.5 μL，10×Ex Taq Buffer 2.5 μL，dNTP 2 μL，ExDNA聚合酶0.25 μL。PCR反應條件:94℃下預變性3 min;94℃下變性60 s，54℃下退火60 s，72℃下延伸10 min，共進行35個循環(huán);最后于72℃下再延伸10 min，4℃下保存。5'RACE以oligo(dT）為引物，合成cDNA第一鏈，用R引物擴增基因的5'末端。PCR反應體系同上。將cDNA片段回收后，將與載體連接好的質粒轉化至感受態(tài)DH5α中，通過藍白斑篩選和菌落PCR鑒定，為陽性的克隆送寶生物工程 (大連）有限公司進行測序。

表1 基因克隆及表達所用引物序列Tab.1 Sequences of the primers used in the gene clone and expression

1.2.3 序列分析 采用Blast軟件進行序列同源性比對和相似性搜索;用DNAman軟件進行序列拼接，用NCBI上的 ORF Finder尋找開放閱讀框(ORF）;利用Tmhmm軟件預測跨膜域;用Target P 1.1 Server程序進行信號肽查找;用Bioedit軟件分析Y－box結合蛋白的氨基酸組成，采用Smart軟件查找蛋白特征模體;用ExPASy server軟件分析蛋白質性質;用 DNAman開展多序列比對，用Psipred預測蛋白的二級結構，用I－TASSER Server預測蛋白的3D結構;用Mega 4.0軟件的鄰接法構建系統(tǒng)進化樹，1 000次重復計算自展分析值。

1.2.4 實時定量PCR檢測刺參Y－box基因的時空表達 采用RT－PCR方法，檢測Y－box基因在不同發(fā)育階段的定量表達情況。利用Trizol法分別提取刺參的受精卵、囊胚、原腸胚、小耳幼體、中耳幼體、大耳幼體、樽形幼體、五觸手幼體、稚參、雌性性腺和雄性性腺的RNA，并反轉錄成cDNA。每組樣品均設3個平行，利用引物Y－box－R和Y－box－F對樣品進行擴增，以cytb為內參基因，設計的引物為cytb－F和cytb－R(表1）。PCR反應條件:94℃下預變性5 min;94℃下變性30 s，60℃下退火30 s，72℃下延伸30 s，共進行28個循環(huán);最后在72℃下再延伸5 min，4℃下保存。

2 結果

2.1 RACE擴增

利用設計的特異性引物，以總RNA反轉錄獲得的cDNA為模板，經(jīng)RACE擴增獲得了與預期大小一致的目的片段 (圖 1），其中 Marker為DL2000。

圖15'RACE和3'RACE的擴增產(chǎn)物Fig.1 Amplification product of 5'RACE and 3'RACE

2.2 刺參Y－box基因cDNA全長序列

將刺參Y－box基因的EST(GH550810.1）片段與 RACE獲得的cDNA序列進行拼接，獲得1 142 bp的基因cDNA全長 (圖2）。在起始密碼子ATG的－3位為 A，符合Kozak規(guī)律。cDNA的5'端 UTR 為102 bp，3'端 UTR 為215 bp，ORF為825 bp。堿基A、T、C、G的偏好性分析表明，Y－box基因cDNA全長序列的堿基A占33.3%，堿基G占28.7%，堿基T占16.4%，堿基C占21.6%。將刺參Y－box基因cDNA全長與斑馬魚Danio rerio、玻璃海鞘Ciona intestinalis、大西洋鮭Salmo salar、櫛孔扇貝Chlamys farreri、虹鱒Oncorhynchus mykiss、金魚Carassius auratu、大菱鲆Scophthalmus maximus、非洲爪蟾蜍Xenopus tropicalis等物種的序列進行比較分析，結果表明，3'和5'端的UTR在不同物種中差異較大，但是刺參Y－box基因cDNA全長序列的ORF序列長度和相似度與其他物種基本一致。

圖2 刺參Y－box基因cDNA全長序列及推導的氨基酸序列Fig.2 Full－length cDNA and the deduced amino acid sequence of Y－box gene in sea cucumber Apostichopus japonicus

2.3 刺參Y－box結合蛋白的氨基酸組成特征

刺參Y－box基因cDNA全長可編碼274個氨基酸的前體蛋白，理論等電點為9.46，預測蛋白的相對分子質量為31 100。其中有54個強堿性氨基酸 (K、R），47個強酸性氨基酸 (D、E），42個疏水氨基酸 (A、I、L、F、W、V），70個不帶電荷的極性氨基酸 (N、C、Q、S、T、Y），分子式為C1302H2079N451O438S2。以 ProtScale程序對 Y－box cDNA編碼的氨基酸進行分析，結果發(fā)現(xiàn)，第21～31、53～55、76～83、226～229殘基為疏水性的，第5～18、32～37、39～52、56～72、84～94、96～225、230～270殘基為親水性的。Y－box結合蛋白疏水性最大值為1.922，親水性最大值為3.822，親水性殘基比例遠大于疏水性殘基，因此，推測其編碼蛋白是親水性的。

將刺參與大西洋鮭、櫛孔扇貝、斑馬魚、金魚、大菱鲆、玻璃海鞘、虹鱒、鮑魚Haliotis diversicolor、加州海兔Aplysia californi、青鳉Oryzias latipes等物種的Y－box結合蛋白進行了比較分析，等電點、蛋白質分子量基本一致，具有較高的同一性，尤其是CSD區(qū)相似度較高，進一步說明此區(qū)域的高度保守性。

采用Signal P軟件預測刺參的Y－box氨基酸序列，不存在信號肽，故推測Y－box不屬于分泌性蛋白。利用Tmhmm預測Y－box結合蛋白的跨膜域，Y－box無明顯跨膜區(qū)，不屬于跨膜蛋白類。對其糖基結合位點的分析發(fā)現(xiàn)，Y－box氨基酸序列存在1個糖基結合位點，推測Y－box結合蛋白可能是糖蛋白。

2.4 刺參Y－box結合蛋白的結構預測

蛋白質的拓撲結構對于保持蛋白質的功能非常重要，不同的拓撲結構將導致不同的功能。預測刺參Y－box結合蛋白質的二級結構，無規(guī)則卷曲和延伸鏈構成了蛋白質中較大的結構元件，其中無規(guī)則卷曲占87.23%，延伸鏈占12.77%，不含α－螺旋和β－折疊。刺參Y－box結合蛋白具有氨基酸C末端結構域、N末端結構域和冷休克結構域(CSD），其中CSD是高度保守的核苷酸結合域，由68個氨基酸組成，主要負責與損傷DNA和非特異性DNA結合，參與自身或異源的聚合。結構域中包含有 RNP－1(GYGFINR）和 RNP－2(EDVFVHQS）兩個RNA結合基序 (圖3），這兩個基序與其轉錄調控功能密切相關。

圖3 刺參與其他物種Y－box氨基酸序列比對的部分結果Fig.3 The comparison of partial amino acid sequences of Y－box in sea cucumber with other species

2.5 刺參與其他物種Y－box氨基酸序列的系統(tǒng)進化樹

利用GenBank上已公布的Y－box氨基酸序列進行多序列的比對，使用Mega 4.0軟件構建系統(tǒng)進化樹。從圖4可見:刺參與加州海兔 (NP00－1191560）、櫛孔扇貝 (ACF90219.1）、玻璃海鞘(NP001072010.1）聚為一支，為海洋無脊椎動物，其聚類的結果與其進化地位一致;大西洋鮭(NP001133216.1）、虹鱒(NP001158512.1）、斑馬魚(AAI68507.1）、非洲爪蟾蜍(NP001016677.1）、原雞 (NP989745.1）、小家鼠 (AAH27785.1）、人(NP001138898）、七鰓鰻 (ACF33226.1）、金魚(BAA19850.1）聚為一支，為脊椎動物;搖蚊(AAN10049.1）與果蠅(XP002048507.1）聚為一支，為陸地無脊椎動物。

圖4 刺參與其他物種Y－box氨基酸序列的系統(tǒng)進化樹Fig.4 Phylogenetic tree of the sea cucumber and other species based on Y－box sequences

2.6 刺參與其他物種Y－box氨基酸序列的同源性

將刺參與其他物種的Y－box氨基酸序列進行同源性比對分析，結果表明，其相似度為27%～41%，在CSD區(qū)相似度很高，達到75%以上 (圖3）。研究結果表明，具有重要作用的氨基酸殘基在保持蛋白質功能方面是高度保守的，而維持結構的殘基則是相對保守的。

2.7 刺參Y－box基因在不同發(fā)育階段的表達

以cytb為內參基因，利用實時定量PCR方法檢測Y－box基因在刺參不同發(fā)育階段的表達。結果表明:Y－box基因在不同發(fā)育階段均有表達，其中小耳幼體階段表達水平最高，且顯著高于其他發(fā)育階段 (P＜0.05）;在雄性性腺中的表達量顯著高于雌性性腺 (P＜0.05）(表2）。

3 討論

3.1 刺參Y－box基因的組成特性及結構域預測

為963 bp，編碼320個氨基酸，與刺參氨基酸的相似度為66%，CSD保守結構域的相似度為75%;金魚［14］Y－box基因家族中 Y－box1全長為1 430 bp，ORF為936 bp，編碼311個氨基酸，與刺參氨基酸的相似度為66%，CSD保守結構域的相似度為75%;金魚［14］Y－box2 全長為 1 503 bp，ORF為894 bp，編碼297個氨基酸，與刺參氨基酸的相似度為60%，CSD保守結構域的相似度為75%;日本青鳉［15］Y－box1全長為1 464 bp，ORF為921 bp，編碼306個氨基酸，與刺參氨基酸的相似度為75%，CSD保守結構域的相似度為76.5%。研究結果表明，高度保守的氨基酸殘基在保持蛋白質功能方面是非常必要的，而維持其結構作用的殘基則是相對保守的。

本研究中獲得的刺參Y－box基因cDNA全長為1 142 bp，ORF為825 bp，可編碼274氨基酸的前體蛋白。刺參Y－box基因cDNA含有一個保守的CSD區(qū)域，此區(qū)域與其他物種氨基酸的相似度在75%以上。到目前為止，Y－box基因已經(jīng)在很多水產(chǎn)動物中獲得，如金魚［14］、日本青鳉［15］、加州海兔［16］、日 本 七 鰓 鰻［6］、 玻 璃 海 鞘［17］、 大 西 洋鮭［18］、櫛孔扇貝［19］、斑馬魚［20］等。其中:加州海兔［16］Y－box基因 cDNA 全長為1 723 bp，ORF為762 bp，編碼253個氨基酸，與刺參氨基酸的相似度為75%，CSD保守結構域的相似度為85%;玻璃海鞘［17］Y－box基因cDNA全長為1 852 bp，ORF

表2 刺參Y－box基因mRNA在不同發(fā)育階段的表達Tab.2 Quantitative real－time PCR analysis of Y－box gene expression in different developmental stages in sea cucumber Apostichopus japonicus

3.2 刺參Y－box結合蛋白的結構域預測

Y－box屬于多功能的DNA/RNA結合蛋白，其前體蛋白包括3個結構域［14］:富含大量的丙氨酸和脯氨酸的氨基酸N末端，負責轉錄的激活;冷休克結構域，一般包含大約70個氨基酸殘基，高度保守，含有 RNP－1(GYGFINR）和 RNP－2(EDVFVHQT）兩個RNA結合基序［1］，是其蛋白質識別RNA的結合位點;C末端結構域，其氨基酸由酸性氨基酸與堿性氨基酸交替組成，負責調節(jié)蛋白與蛋白、蛋白與RNA之間的相互作用。

刺參Y－box結合蛋白具有氨基酸N末端結構域、C末端結構域和冷休克結構域，這些結構都符合Y－box前體蛋白的氨基酸序列特征。其中冷休克結構域由68個氨基酸組成，是高度保守的核苷酸結合域，保守的冷休克結構域決定了Y－box結合蛋白的重要功能［17］。刺參高度保守的結構域也進一步證明了在進化過程中，保持蛋白質功能的殘基比維持蛋白質結構的殘基更加保守。N末端氨基酸組成的不同是Y－box結合蛋白分子間的最大區(qū)別，但N末端具體如何行使其功能目前尚不清楚［21］。刺參N－末端氨基酸組成的不同，可能負責調控刺參Y－box結合蛋白特異結合轉錄過程中的其他蛋白質，進而實現(xiàn)其特異性的轉錄調控。刺參的C末端氨基酸結構域，由酸性氨基酸與堿性氨基酸交替組成，推測此區(qū)域與蛋白以及蛋白與RNA之間的相互作用有關。目前已知C末端的親水結構域主要通過精氨酸束與鄰近分子中的酸性螺旋相互作用，實現(xiàn)結合蛋白間的聚合［14］。

3.3 刺參Y－box基因的位點分析與同源性分析

預測的刺參Y－box結合蛋白不屬于分泌性蛋白，這與人Y－box結合蛋白的功能很相似。人Y－box結合蛋白通常在細胞基質與細胞核之間穿梭，以應激顆粒的形式存在于細胞基質中，主要功能是處理加工并輸出mRNA，在細胞核中Y－box結合蛋白受到應激反應以后會發(fā)生移動，包括腺病毒感染、DNA 損傷和 PI3K－Akt信號激活等［22－25］。

刺參Y－box氨基酸序列與其他物種具有相對較高的相似性，尤其是CSD區(qū)，這種高度的保守性說明Y－box基因在刺參的生命活動中具有重要作用。正是因為具有相同的保守區(qū)和功能域才決定了刺參與其他物種的Y－box結合蛋白具有功能上的相同。Y－box結合蛋白作為重要的多功能轉錄和翻譯調控蛋白，表現(xiàn)為它在結構上高度的保守性。刺參Y－box氨基酸序列CSD區(qū)中保守的68個氨基酸，可能在刺參Y－box基因進化中起到穩(wěn)定其功能的作用。

3.4 刺參Y－box基因的定量表達分析

Y－box基因在刺參不同發(fā)育階段的定量表達結果表明，Y－box基因在不同發(fā)育階段均有表達，刺參Y－box基因的這種組成型表達方式也從另一個角度說明其功能的多樣性。在小耳幼體中Y－box基因的表達水平最高，且顯著高于其他發(fā)育階段，這可能是因為小耳狀幼體是刺參個體發(fā)育中第一個變態(tài)時期，也是個體發(fā)育中時間最長，形態(tài)學和組織器官初步形成的時期，在這個時期表達量高可能與其在這個階段的重要變化密切相關，同時從另一個側面反映了Y－box基因是一個多功能的轉錄及翻譯調控因子。

Y－box基因在刺參雄性性腺中的表達量顯著高于雌性性腺，推測Y－box基因可能與刺參的性別分化及決定有一定關系，此結果還需要進一步證實。有研究發(fā)現(xiàn)，Y－box結合蛋白在金魚的精細胞里表達非常高［19］，是一種特別的精子RNA結合蛋白，而在非洲爪蟾蜍中Y－box基因作為精細胞的特別轉錄因子抑制翻譯。在小鼠卵母細胞中Y－box結合蛋白占總蛋白的2%［20］，而在小鼠精子細胞中占0.7%［26］，且缺少Y－box結合蛋白的小鼠形態(tài)生長發(fā)育正常但不育［27］。本研究結果將有助于推進刺參的Y－box基因在胚胎發(fā)育及其性別調控分化的研究工作。

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Molecular cloning and expression analysis of Y－box gene in sea cucumberApostichopus japonicus

TIAN Yi1，ZHANG Bing－long1，CHANG Ya－qing1，DONG Ping－ping1，
CHEN Bai－yao2，3，F(xiàn)U Guang－h(huán)ui2，3，AN Jian2，3
(1.Key Laboratory of Mariculture＆ Stock Enhancement in North China's Sea，Ministry of Agriculture，Dalian Ocean University，Dalian 116023，China;2.Ocean and Fishery Science Research Institute of Lianyungang City，Lianyungang 222044，China;3.Seafood Breeding Farm of Lianyungang City，Lianyungang 222044，China）

The cDNA length of Y－box gene in sea cucumberApostichopus japonicuswas clones by RACE technique based on the EST sequence in the GenBank，and the expression of Y－box gene in sea cucumber was studied by fluorescent quantitative PCR to elucidate the role of Y－box gene in embryonic development and sexual differentiation in the sea cucumber.The results showed that the Y－box has cDNA length of 1 142 bp encoding 274 amino acids constituting hydrophilic precursor protein with 31 100 protein molecular weight with an isoelectric point of 9.46 and included a 825 bp open reading frame(ORF），a 215 bp 3'UTR and a 102 bp 5'UTR.The N－glycosylation site，hydrophilic C－tail end and cold shock domain CSD were evaluated，and the Y－box protein family was very conservative in CSD domain.The secondary structure of the precursor protein consisted primarily of a 12.77%strand chain and 87.23%random coil，without β folding and alpha helix.The comparison revealed that the similarity of the Y－box precursor protein was ranged from 27%to 41%with other animals.The evolutionary tree indicated that the Y－box precursor protein of sea cucumber was clustered with sea hareAplysia californica，AscidianCiona intestinalisand Zhikong scallopChlamys farreri.The Y－box gene expression in different developmental stages and gonads showed that there was significantly higher expression of the Y－box gene in early auricularia than in other stages(P＜0.05），and higher in testis than in ovary(P＜0.05），indicating that the Y－box gene play an important role in embryonic development and sexual differentiation in the sea cucumber.

Apostichopus japonicus;Y－box gene cloning;sequence analysis;gene expression

S917.4

A

2095－1388(2013）06－0535－07

2013－03－04

國家自然科學基金資助項目 (41106128）;國家“863”計劃重大項目 (2012AA10A412）;江蘇省科技支撐計劃項目(BE2012421）

田燚 (1979－），女，副教授。E－mail:tianyi@dlou.edu.cn

常亞青 (1967－），男，教授。E－mail:yqchang@dlou.edu.cn