王保江，羅 衛(wèi)，沈 冰

腺病毒介導(dǎo)的rHSG對大鼠遲發(fā)性腦血管痙攣作用的實驗研究

王保江1，羅 衛(wèi)2，沈 冰3

目的 探討重組腺病毒介導(dǎo)的大鼠增殖抑制基因(rHSG)對大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血(SAH)后基底動脈(BA)遲發(fā)型腦血管痙攣(DCV)的影響。方法 SD大鼠156只隨機(jī)分為5組:SAH組(A組，36只)、SAH+AdvrHSG－GFP組(B組，36只)、SAH+Adv－GFP組(C組，36只)、假手術(shù)組(D組，36只)和正常對照組(E組，12只)。采用枕大池二次注血法建立大鼠SAH模型，假手術(shù)組注射等量生理鹽水。將重組腺病毒Adv－rHSG－GFP及空載腺病毒Adv－GFP分別轉(zhuǎn)染B、C組大鼠BA。設(shè)立4d、7d、10d 3個觀測點，HE染色后測量BA內(nèi)徑周長及血管壁厚度，觀察血管結(jié)構(gòu)改變;免疫組化染色后檢測BA中rHSG蛋白表達(dá);用RT－PCR法檢測BA中rHSG mRNA表達(dá)。結(jié)果A﹑C組各時相BA有不同程度的內(nèi)膜增厚皺折、平滑肌層增厚等增殖性改變。與A組及C組相比，B組7d、10d時BA血管痙攣明顯緩解，且rHSG蛋白及mRNA表達(dá)明顯增強(P＜0.01)。結(jié)論 rHSG的過表達(dá)可以減輕SAH后血管壁的增殖和DCV，為外源性rHSG基因治療DCV提供了實驗依據(jù)。

大鼠; 蛛網(wǎng)膜下腔出血; 遲發(fā)性腦血管痙攣; 大鼠增殖抑制基因; 增殖細(xì)胞核抗原

腦血管痙攣(cerebral vasospasm，CVS)呈雙相性，一種為早發(fā)性，多見于蛛網(wǎng)膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage，SAH)后0.5h～3d內(nèi)，常于4h內(nèi)緩解，也稱急性CVS;另一種發(fā)生于SAH后4d～15d，7d～10d為高峰期，2～4w逐漸緩解，稱為遲發(fā)性腦血管痙攣(delayed cerebral vasospasm，DCV)。DCV對血管擴(kuò)張劑的反應(yīng)性較差，難于逆轉(zhuǎn)，是遲發(fā)性腦缺血最常見的原因，可使SAH后前2w的死亡率增加1.5～2倍［1］。SAH后DCV的發(fā)生究竟是腦血管平滑肌持續(xù)主動收縮的結(jié)果，還是腦血管壁結(jié)構(gòu)破壞、血管平滑肌細(xì)胞增殖導(dǎo)致的器質(zhì)性管腔狹窄所致尚無定論。預(yù)防和治療DCV已是治療SAH患者的主要目標(biāo)，也是目前研究的熱點。大鼠增殖抑制基因1(rat hyperplasia suppressor gene－1，rHSG)是近年發(fā)現(xiàn)的一種新的與細(xì)胞增殖相關(guān)的信息傳遞分子，它對血管平滑肌細(xì)胞的增殖有抑制作用［2］。前期研究表明，SAH后DCV的發(fā)生和嚴(yán)重程度與血管壁增殖程度及大鼠增殖抑制基因1(rat hyperplasia suppressor gene－1，rHSG)低表達(dá)密切相關(guān)［3～5］。本實驗運用腺病毒載體在大鼠體內(nèi)過表達(dá)rHSG，觀察rHSG對大鼠SAH后基底動脈(basilar arteries，BA)血管壁增殖和DCV的作用。

1 材料與方法

1.1 試劑 HSG/MFN2多克隆抗體購自SANTA公司;小鼠抗大鼠增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cellnuclear antigen，PCNA)單克隆抗體購自武漢博士德;SP免疫組織化學(xué)試劑盒購自北京博奧森公司; DAB顯色試劑盒購自北京天根生化科技公司;rHSG和β－actin上下游引物由上海生工生物合成;SV Total RNA Isolation System及Access RT－PCR Introductory System均購自Promega公司。

1.2 重組腺病毒載體的構(gòu)建 含有rHSG編碼序列的重組腺病毒載體Adv－rHSG－GFP和含有綠色熒光蛋白基因的對照載體Adv－GFP由本研究組構(gòu)建，并經(jīng)測序鑒定。以293細(xì)胞擴(kuò)增腺病毒，氯化銫密度梯度離心以純化病毒［6，7］。

1.3 實驗動物及分組 Sprague－Dawley大鼠156只，由寧夏醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，雌雄不拘，體重320g±80g，隨機(jī)分為4組:SAH組(A組，36只)、SAH+Adv－rHSG－GFP組(B組，36只)、SAH +Adv－GFP組(C組，36只)、假手術(shù)組(D組，36只)和正常對照組(E組，12只)。A組采用枕大池二次注血法誘發(fā)制成SAH，B、C組手術(shù)方法同上，注血同時混合50μl滴度為2.5×109pfu/ml的AdvrHSG－GFP或Adv－GFP病毒懸液，注入枕大池，D組僅注射等量生理鹽水。各組分別于首次注血(或生理鹽水)后4d、7d、10d各處死12只，6只用于形態(tài)學(xué)檢測，6只用于rHSG mRNA檢測。E組不做任何處理。

1.4 DCV模型的制作 大鼠用10%水合氯醛(350mg/kg)腹腔注射麻醉，暴露環(huán)枕膜，A組抽取自體股動脈血0.3ml，以0.lml/min的速度緩慢注入枕大池，俯臥位頭低30度約30min，使血液進(jìn)入基底池，48h后二次注血。B、C組手術(shù)方法同上，以等量自體血混合50μL滴度為2.5×109pfu/ml的 Adv－rHSG－GFP或Adv－GFP病毒懸液，注入枕大池。

1.5 標(biāo)本獲取 A、B、C組分別在首次注血(和/或病毒懸液)后4d、7d、10d各處死12只大鼠。形態(tài)學(xué)檢測標(biāo)本采用斷頭法處死，獲得完整BA的腦干，先截取1/3長度的BA冷凍切片后在倒置熒光顯微鏡下觀察GFP表達(dá)，剩余標(biāo)本置于10%福爾馬林液內(nèi)固定，石蠟包埋、切片、HE染色;采用SP法分別行PCNA和rHSG免疫組織化學(xué)染色。RTPCR檢測標(biāo)本采用快速斷頭取腦，取完整BA，剔除蛛網(wǎng)膜組織，用無菌生理鹽水沖洗后迅速置－86℃冰箱保存。

1.6 光鏡下BA形態(tài)學(xué)檢查 BA橫斷面石蠟切片行HE染色，Motic BA400生物顯微鏡400倍下拍照，參照文獻(xiàn)方法［8］用Motic ImagesPlus 2.0計算機(jī)圖像分析系統(tǒng)計算BA血管內(nèi)徑周長及血管壁厚度，并觀察血管結(jié)構(gòu)變化。

1.7 rHSG基因轉(zhuǎn)染BA血管壁細(xì)胞及其表達(dá)

1.7.1 倒置熒光顯微鏡觀察GFP表達(dá) 大鼠BA組織冰凍切片，層厚10μM，空氣中烘干30min，直接在倒置相差顯微鏡下觀察血管壁中GFP表達(dá)所產(chǎn)生的綠色熒光，以確定轉(zhuǎn)染是否成功。

1.7.2 免疫組織化學(xué)染色及計算機(jī)圖像分析采用SP法，PBS代替一抗作陰性對照，以已知陽性片作陽性對照，DAB顯色，鏡下控制反應(yīng)時間，蘇木素復(fù)染。以胞核或胞漿出現(xiàn)棕黃色或棕褐色為陽性信號。PCNA及rHSG蛋白染色標(biāo)本在高倍鏡(× 400)下照相，按照參考文獻(xiàn)［9，10］的方法，將圖片導(dǎo)入Image－Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)，計算每張切片陽性區(qū)域的平均光密度(Mean density)和積分光密度(integrated optical density，IOD)。

1.7.3 RT－PCR檢測rHSG mRNA表達(dá) BA總RNA提取及一步法逆轉(zhuǎn)錄均按Promega公司說明書進(jìn)行。1μg總RNA在總體積50μL中進(jìn)行cDNA合成及PCR擴(kuò)增，rHSG上游引物序列為:5’－GGA GCT GGA CAG CTG GAT TGA T－3’，下游引物序列為:5’－AGC TCC AGC TGC TTG TCC ATG A－3’，擴(kuò)增片斷長度609bp［2，11］;同時以擴(kuò)增片斷長度278bp的β－actin作為內(nèi)參照，β－actin上游引物序列為:5’－CGT AAA GAC CTC TAT GCC AA－3’，下游引物序列為:5’－GCT CAG TAA CAG TCC GCC TA－3’。RT－PCR反應(yīng)條件為:48℃45min，94℃2min，1個循環(huán);94℃30s，61℃45s，72℃80s，35個循環(huán);72℃最終延伸7min后終止反應(yīng)。產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠水平電泳，EB染色，凝膠成像儀照相，Quantity one

4.3.1凝膠分析系統(tǒng)對各電泳條帶的亮度和面積進(jìn)行分析，最后得出各條帶總信號量(adjust Volume)，結(jié)果以rHSG/β－actin的比值表示。

2 結(jié)果

2.1 動物存活情況 D組大鼠均存活，A組、B組和 C組大鼠死亡率分別為 21.4%、15.5%、23.1%;A組和C組大鼠大多于二次注血后7d內(nèi)死亡，術(shù)后存活時間超過1w時死亡率明顯下降;B組大鼠多于首次注血后3d內(nèi)死亡。

2.2 GFP在BA血管的表達(dá) 熒光顯微鏡下各組大鼠BA內(nèi)膜均見微弱自主熒光，不同時間點強度不變;B組和C組所有大鼠基因轉(zhuǎn)染均成功，枕大池注入Adv－rHSG－GFP和Adv－GFP后4d，BA外膜層可見較強烈的綠色熒光，血管中層可見中等強度綠色熒光;至7d時，血管外膜及中層綠色熒光均明顯減弱;10d時，血管外膜及中層已觀察不到綠色熒光。

2.3 光鏡下BA的大體形態(tài)學(xué)改變及內(nèi)徑周長、血管壁厚度的時相變化 A組及C組不同時相BA血管均發(fā)生血管內(nèi)徑明顯變小、管壁增厚、內(nèi)彈力纖維皺縮并向血管腔內(nèi)隆起等形態(tài)學(xué)改變，和D組相比較有明顯差異(P＜0.01)，提示DCV造模成功。B組各時相BA血管雖有輕微DCV表現(xiàn)，但和A、C組相響應(yīng)時間點比較，已明顯減輕(P＜0.01)。正常對照組及假手術(shù)組大鼠BA血管結(jié)構(gòu)正常，管腔圓滑，平滑肌細(xì)胞排列整齊，彈力明顯(見表1)。

2.4 SAH后大鼠BA中PCNA和rHSG蛋白的表達(dá) A組及C組各時間點BA血管壁均可見PCNA表達(dá)，以7d最為顯著(P＜0.01)，B組各時相BA血管壁亦可見PCNA表達(dá)，但和A、C組響應(yīng)時間相應(yīng)時間點比較明顯降低，又以7d降低最為明顯(P＜0.01)。rHSG蛋白染色部位在胞漿，A、C組大鼠BA血管壁在首次術(shù)后均可見rHSG表達(dá)下降，B組rHSG表達(dá)在4d即有增加，7d時最強(P＜0.05) (見圖1)，到10d時恢復(fù)至4d時水平(見表2、表3)。

圖1 大鼠基底動脈免疫組化染色光鏡顯微照片(DAB顯色，×200)

表1 大鼠基底動脈內(nèi)徑周長及基底動脈壁厚(n=6，μm，±s)

表1 大鼠基底動脈內(nèi)徑周長及基底動脈壁厚(n=6，μm，±s)

與A、C組各時間點分別比較▲P＜0.01;與各組內(nèi)其他時間點及正常組比較▽P＜0.01;與A、C組相應(yīng)時間點比較★P＜0.01

組別BA 壁厚BA 內(nèi)徑周長4d 7d 10d 4d 7d 10d A組B組C組D組E組16.09±0.20 15.82±0.20 15.9±0.1 13.77±2.80▲14.00±2.00▲25.90±0.36▽15.08±0.10★24.80±0.40▽14.05±2.07▲23.59±0.60 17.35±0.20★21.01±0.70 13.89±1.47▲596.00±12.00 599.00±8.00 604.00±21.00 615.30±5.78▲612.88±7.15▲511.00±14.00▽605.00±11.00★501.00±19.00▽613.87±7.42▲547.00±12.00 597.00±8.00★562±10.46 614.10±6.07▲

表2 PCNA和rHSG的表達(dá)(±s，n=6)

表2 PCNA和rHSG的表達(dá)(±s，n=6)

與A、C組對應(yīng)時間點比較▽P＜0.01;與各組內(nèi)其他時間點比較★P＜0.01

組別平均光密度積分光密度4d 7d 10d 4d 7d 10d A組B組C組D組E組0.212±0.044 0.185±0.044▽0.235±0.030 0 0 0.310±0.026★0.246±0.026▽★0.290±0.015★0 0.300±0.029 0.253±0.029▽0.285±0.020 0 14.862±1.820 11.352±1.820▽14.052±1.250 0 0 22.493±2.543★17.420±2.543▽★21.950±1.980★0 19.927±1.995 14.356±1.085▽19.050±1.742 0

表3 rHSG的表達(dá)(±s，n=6)

表3 rHSG的表達(dá)(±s，n=6)

與A、C組對應(yīng)時間點比較▽P＜0.01;與各組內(nèi)其他時間點比較★P＜0.01

組別平均光密度積分光密度4d 7d 10d 4d 7d 10d A組B組C組D組E組0.24±0.02 0.27±0.04▽0.24±0.03 0.25±0.03 0.25±0.04 0.18±0.01★0.38±0.03▽★0.18±0.10★0.26±0.01 0.21±0.02 0.32±0.03▽0.21±0.01 0.24±0.09 10.81±0.90 12.58±1.30▽10.19±1.20 11.95±0.37 11.70±0.40 8.07±0.70★20.70±1.00▽★7.95±0.80★12.09±0.41 8.45±0.50 13.49±1.60▽8.70±0.50 12.41±0.69

表4 BA基底動脈中rHSG/β－actin的相對表達(dá)量(±s，n=6)

表4 BA基底動脈中rHSG/β－actin的相對表達(dá)量(±s，n=6)

與D組及A、C組相應(yīng)時間點比較▲P＜0.01

組別adjust Volume(rHSG/β－actin) 4d 7d 10d A組B組C組D組E組0.2744±0.231 0.2841±0.057 0.2731±0.005 0.290±0.010 0.283±0.017 0.2394±0.017 0.3667±0.013▲0.232±0.013 0.289±0.013 0.2849±0.06 0.3094±0.016▲0.2863±0.013 0.291±0.020

2.5 大鼠BA血管壁rHSG mRNA的表達(dá) A、C組大鼠BA rHSG mRNA表達(dá)在首次術(shù)后均明顯下降，B組rHSGmRNA表達(dá)在各時相均與不同程度增加，以7d時最為明顯(P＜0.05)(見圖2、表4)。

圖2 4組大鼠BA血管壁rHSG mRNA表達(dá)

3 討論

DCV是十分復(fù)雜的病理生理學(xué)過程，探索新的預(yù)防及治療方法對于降低SAH患者的死亡率、殘疾率具有重大的意義。過去研究表明DCV是多種因素如氧合血紅蛋白(oxyHb)、內(nèi)皮素－1(ET－1)、PKc激酶、免疫炎癥反應(yīng)以及補體復(fù)合物成分等綜合作用的結(jié)果［12，13］，但不能做出較為滿意的解釋。近年來，一些學(xué)者認(rèn)為SAH后DCV的發(fā)生是血管壁結(jié)構(gòu)改變的結(jié)果，其中血管平滑肌細(xì)胞增殖尤為重要［14～16］。

rHSG被證實有抑制血管細(xì)胞的增殖、遷移和重塑的作用［2］。前期實驗證明，大鼠SAH后4～16d，BA血管壁rHSGmRNA相對表達(dá)量降低，以SAH后7d最為明顯，提示rHSG和SAH后DCV有密切關(guān)系［2，3］。本實驗用重組腺病毒Adv－rHSG－GFP轉(zhuǎn)染SAH大鼠BA，旨在探討外源性rHSG對SAH后DCV的影響。結(jié)果顯示，外源性rHSG在大鼠SAH后第7d表達(dá)量最高，在SAH后第10d下降至第4d水平，明顯減輕了DCV的程度，表明外源性rHSG在BA中表達(dá)持久，采用基因治療有足夠的時間窗，為臨床預(yù)防和治療SAH后DCV提供了實驗依據(jù)。

因?qū)嶒炘O(shè)計需求，未能檢測SAH后前3d及及其它時間點rHSG的表達(dá)情況，故外源性rHSG表達(dá)峰值開始及持續(xù)時間尚需進(jìn)一步驗證。

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Adenovirus-mediated gene transfer of rHSG-1 inhibits proliferation of vascular smooth muscle cells from delayed cerebral vasospasm rats

WANG Bao－jiang，LUO Wei，SHEN Bing.(Ningxia Medical University，Yinchuan750004，China)

ObjectiveTo investigate the effect of recombinant adenovirus mediating rats hyperplasia suppresion gene(rHSG)on delayed cerebral vasospasm(DCV)after experimental subarachnoid hemorrhage(SAH)in rats.Method156 Sprague－Dawley rats were randomly divided into SAH group(A，n=36)，SAH+Adv－rHSG－GFP group(B，n= 36)，SAH+Adv－GFP group(C，n=36)，sham operation group(D，n=36)and normal control group(E，n=12).SAH were developed with two times injections of arterial blood into cisterna magna，and 0.3ml normal saline(NS)injected for sham operation group.For group B and group C，Adv－rHSG－GFP and Adv－GFP were transfected into the basilar arteries(BA)of rats.The BAs were harvested at day4，7，10 after experiments.BA were stained by hematoxylin－eosin for measurements of perimeter，wall thickness and observation of structures respectively.Proteins of rHSG in BA was evaluated by immunohistochemically stainnedstry.Expression changes of rHSG mRNA in the BA were identified by RT－PCR.ResultsFor A and C group，DCV appeared at the day4 after the first cisterna magna injection and reached the peak in the day7 and continued maintained untill the day 10.The DCV wasere significantly reduced，and the expression of rHSG protein and mRNA increased at day 4，10 of in B group compared with A group and C group(P＜0.01).ConclusionThe over expression of the rHSG can reduce the proliferation of the vascular wall after SAH and DCV，this study provided experimental evidence for treatment of DCV with exogenous rHSG.

Rats;Subarachnoid hemorrhage;Delayed cerebral vasospasm;rHSG;PCNA

R743.35

A

1003－2754(2013)03－0196－05

2012－11－28;

2013－01－20

寧夏自然科學(xué)基金資助項目(NZ10136)

(1.寧夏醫(yī)科大學(xué)，寧夏銀川750004;2.陜西中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，陜西西安712000;3.寧夏醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，寧夏銀川750004;王保江，碩士研究生，現(xiàn)在寶雞市解放軍第三醫(yī)院神經(jīng)外科研究所，陜西寶雞721000)

沈 冰，E－mail:shenbing315@sina.com.cn