林奇泗，李京華，楊冬芝，王慧

（1.徐州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，江蘇徐州221004；2.沈陽藥科大學(xué)藥學(xué)院，遼寧沈陽110016）

中藥玉竹別名萎蕤、玉參、尾參，為百合科植物玉竹Polygonatum odoratum（Mill.）Druce 的干燥根莖[1]。全國大部分地區(qū)有分布，主產(chǎn)河南、江蘇、遼寧、湖南、浙江。玉竹最早載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品，其味甘性平，入肺、胃經(jīng)，功能養(yǎng)陰，潤燥，除煩，止渴，用于治熱病陰傷，咳嗽煩渴，虛勞發(fā)熱，消谷易饑，小便頻數(shù)。

玉竹中含有具有揮發(fā)性的脂溶性成分[2]，本研究用GC-MS 法對玉竹脂溶性成分進(jìn)行鑒別，以譜庫對照進(jìn)行組分定性。并計算各組分峰的保留指數(shù)[3]。玉竹的水提液已被證實具有抗氧化活性[4]，其黃酮類和糖類成分的抗氧化活性已有報道[5-7]。本研究提取玉竹脂溶性、多酚類及皂苷類成分進(jìn)行體外抗氧化活性研究，為玉竹開發(fā)應(yīng)用提供實驗參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

QP5050A 氣質(zhì)聯(lián)用儀、UV-1700 型可見-紫外分光光度計：日本SHIMADZU 公司；H-2 數(shù)顯恒溫水浴鍋：浙江省嘉興市俊思儀器設(shè)備廠；SC-97 自動三重純水蒸餾器、RE-52AA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；BS110 電子天平：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司。

1.2 材料

實驗用水為沈陽藥科大學(xué)實驗室自制三重蒸餾水；C8-C30正 構(gòu) 烷 烴、2，4，6-反 式2-吡 啶 基 三 嗪（TPTZ）、福林酚（FC）試劑、2，6-二叔丁基對甲酚（BHT）、購自上海阿拉丁試劑有限公司；其它試劑均為分析純，購自山東禹王實業(yè)有限公司。玉竹藥材購自沈陽南塔大藥房，經(jīng)沈陽藥科大學(xué)中藥學(xué)院賈景明教授鑒定，為百合科黃精屬植物玉竹[Polygonatum odoratum（Mill.）Druce]的干燥根莖，將藥材粉碎，過二目篩備用。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品制備

2.1.1 脂溶性提取物制備

取20 g 玉竹粉末，加入石油醚溶液500 mL，回流提取3 次，每次提取1 h。過濾，合并提取液。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至近干，轉(zhuǎn)至氮?dú)庀麓蹈桑玫街苄蕴崛∥?，稱定重量，計算得率。臨用時用適量甲醇溶解定容，即得。

2.1.2 總酚酸提取物制備

準(zhǔn)確稱取干燥玉竹粗粉20 g 加入12 倍量70 %乙醇溶液，80 ℃水浴加熱提取1 h，再以10 倍量的一定濃度的乙醇溶液，同樣條件提取2 次。提取液過濾合并，50 ℃減壓濃縮至無醇味。加入蒸餾水稀釋至50 mL，用等量乙酸乙酯萃取5 次，收集乙酸乙酯萃取液。將乙酸乙酯萃取液50 ℃減壓濃縮至干，加入蒸餾水20 mL 溶解，再以10%Na2CO3溶液調(diào)節(jié)pH 至10，在2 000 r/min下離心30 min，取上清液以1%鹽酸調(diào)pH 至中性，濃縮得到總酚酸提取物，稱定重量，計算得率。臨用時用適量甲醇溶解定容，即得。

2.1.3 總皂苷提取物制備

準(zhǔn)確稱取干燥玉竹粗粉20 g 加入12 倍量70 %乙醇溶液，80 ℃水浴加熱提取1 h，再以10 倍量的一定濃度的乙醇溶液，同樣條件提取2 次。提取液過濾合并，50 ℃減壓濃縮至無醇味。加入蒸餾水稀釋至50 mL，用等量正丁醇萃取5 次，收集正丁醇萃取液。將正丁醇萃取液揮干，殘渣用10 mL 乙醇溶解，加入200 mL丙酮，靜置過夜。將溶液過濾，收集沉淀得到總皂苷提取物，稱定重量，計算得率。臨用時用適量甲醇溶解定容，即得。

2.2 GC-MS 分析

2.2.1 氣質(zhì)條件

色譜柱：HP-5 彈性石英毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 mm）；進(jìn)樣口溫度：280 ℃；載氣：氦氣；流速：1.0 mL/min；分流比5 ∶1；進(jìn)樣量：1 μL；升溫程序：柱溫120 ℃，保持4 min，以10 ℃/min 升至180 ℃，保持10 min，繼續(xù)以5 ℃/min 升至240 ℃，保持10 min。電離方式EI，電子轟擊能量70 eV，離子源溫度200 ℃，接口溫度：230 ℃，分辨率1 000，掃描范圍（m/Z）33 amu～550 amu。

2.2.2 脂溶性成分鑒別

取2.1.1 項下制得的脂溶性提取物用甲醇定溶至2.0 mL，溶液依GC-MS 條件進(jìn)行測定。采用美國國家標(biāo)準(zhǔn)局NIST107 定性譜庫檢索，結(jié)合保留指數(shù)定性。各色譜峰的保留指數(shù)依據(jù)公式（1）進(jìn)行計算。式中t′R(Z)，t′R(X)，t′R(Z+n)分別代表待測物質(zhì)x 和具有Z 及Z+n 個碳原子數(shù)正構(gòu)烷烴的相對保留時間。

2.3 多酚含量測定

2.3.1 對照品溶液制備

精密稱取沒食子酸對照品0.050 g，用雙蒸水配制成0.1 mg/mL 的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，作為對照品溶液。

2.3.2 福林-酚法測定總酚酸含量[8]

準(zhǔn)確移取上述沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL 于10 mL 棕色容量瓶中，分別用重蒸水補(bǔ)充至2.0 mL，再加入1.0 mL 福林酚試劑，4.0 mL質(zhì)量百分?jǐn)?shù)26.7%的Na2CO3飽和溶液，充分混勻后用水定容至10 mL，室溫下靜置2 h，隨后于760 nm 波長處測定吸光度。以沒食子酸的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。

準(zhǔn)確移取2.1.2 項下一定濃度的總酚酸提取物供試品溶液500 μL，用蒸餾水補(bǔ)充至2.0 mL，再加入1.0 mL FC 試劑，4.0 mL 質(zhì)量百分?jǐn)?shù)26.7 %的Na2CO3飽和溶液，充分混勻后用蒸餾水定容至10 mL，室溫下靜置2 h，于760 nm 波長處測定吸光度。

2.4 皂苷含量測定

2.4.1 對照品溶液制備

精密稱取經(jīng)干燥至恒重的β-胡蘿卜苷對照品6.1 mg，加甲醇溶解定容至25 mL，作為對照品溶液。

2.4.2 硫酸-香草醛法測定總皂苷含量[9]

精密吸取2.1.1 項下對照品溶液0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 mL 分別加入10 mL 具塞試管中，按2.1.2 項下的香草醛-高氯酸顯色方法后測定吸光值，每個濃度平行測定3 次，以吸光度為縱坐標(biāo)，以對照品質(zhì)量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

準(zhǔn)確吸取玉竹總皂苷提取溶液適量，置于10 mL具塞試管中，沸水浴揮干溶劑，加入0.8 mL 5%香草醛-冰醋酸溶液，再加入3.2 mL 70%硫酸溶液，搖勻，于60.0 ℃水浴加熱25 min，立即取出置冰水浴2 min～3 min，加冰醋酸溶劑稀釋至5.0 mL，搖勻，以不加對照品的樣品管為空白。在544 nm 下測定其吸光度。

2.5 抗氧化活性研究

2.5.1 對DPPH 自由基的清除作用[10]

將2.1 項下玉竹揮發(fā)油提取溶液、總皂苷提取溶液、多酚提取溶液稀釋為一系列不同濃度受試樣品溶液。分別取2.0 mL 待測液與2.0 mL 0.2 mmol/L 的DPPH乙醇溶液混合，振搖均勻后放于暗處靜置30 min，于518 nm 處測定吸光度（Ai）。同時測定2.0 mL 0.2 mmol/L DPPH 溶液與2.0 mL 95%乙醇混合液的吸光度（Aj），以及2.0 mL 待測液與2.0 mL 95%乙醇混合液的吸光度（Ac）。按式（2）計算清除率，以BHT 甲醇溶液為陽性對照。根據(jù)不同濃度樣品的清除率作曲線求出半清除率（EC50），每份樣品測定3 次并取平均值。

2.5.2 FRAP 法測定總抗氧化能力[11]

2.5.2.1 TPTZ 工作液的配制

(4) 有同學(xué)建議，將本實驗使用的白熾燈改為LED燈，因為白熾燈產(chǎn)熱多，會使不同組之間的溫度產(chǎn)生差異而影響實驗結(jié)果。此建議得到了老師和同學(xué)們的一致贊同，這是因為這一改進(jìn)有利于遵循____________原則。

將2.5 mL 20 mmol/L FeCl3·6H2O，2.5 mL 10 mmol/L TPTZ（以40 mmol/L 鹽酸溶解），25 mL 0.3 mmol/L 的醋酸緩沖液（pH3.6），臨用前混合，即得。

2.5.2.2 FeSO4標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

分別取不同質(zhì)量濃度的FeSO4溶液50 μL，各加入3.0 mL 2.1.3 項下配制的TPTZ 工作液，37 ℃水浴30 min，測定597 nm 處的吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，F(xiàn)eSO4質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.5.2.3 FRAP 值測定

準(zhǔn)確吸取2.1 項下3 種提取溶液50 μL，加入3.0 mL TPTZ 工作液，37 ℃水浴30 min，測定597 nm 處的吸光度，并計算其FRAP 值，F(xiàn)RAP 值表示為每克供試品消耗的Fe2+毫摩爾數(shù)（mmol/g）。

3 結(jié)果與討論

3.1 脂溶性成分鑒別

依2.1.1 項下方法提取玉竹脂溶性提取物，得率為0.039%。按GC-MS 條件進(jìn)行測定，總離子流圖見圖1。

圖1 玉竹提取物總離子流圖Fig.1 TIC of extraction of Polygonatum odoratum

本研究從玉竹脂溶性提取物中分離得到12 個峰，鑒定了其中6 種組分，占總峰面積的91.0%，結(jié)果見表1。

表1 玉竹提取物GC-MS 分析Table 1 Major components of extraction of Polygonatum odoratum

因加熱時間和溫度的影響，故必定有部分成分損失，與文獻(xiàn)報道的揮發(fā)性成分組成有所不同[2]。

3.2 總酚酸提取物中多酚含量

以沒食子酸質(zhì)量濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，得回歸方程y=11.690 0x+0.068 2（R=0.999 2）。總酚酸提取物得率為0.186 %，多酚含量以每克總酚酸提取物相當(dāng)于沒食子酸的毫克數(shù)計為（19.40±0.245）mg/g。

3.3 總皂苷提取物中皂苷含量

以加入的β-胡蘿卜苷質(zhì)量（mg）為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，得線性回歸方程y=7.947 5x+0.061 5，（R=0.999 1）?？傇碥仗崛∥锏寐蕿?.062%，皂苷含量以每克總皂苷提取物相當(dāng)于β-胡蘿卜苷的毫克數(shù)計為（282.63±9.789）mg/g。

3.4 3 種提取物抗氧化活性比較

3.4.1 對DPPH 自由基的清除作用

以BHT 為對照，分別測出玉竹一系列不同濃度提取物吸光度Ai，Aj，Ac，根據(jù)公式（1）計算出其相應(yīng)的自由基清除率，以清除率為縱坐標(biāo)，以質(zhì)量濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，結(jié)果見圖2。

圖2 提取物DPPH 清除率測定結(jié)果Fig.2 DPPH radical scavenging activities of the extracts from Polygonatum odoratum

從圖2 可看出，自由基清除率隨著加入量的增加而增加，但隨著抗氧劑濃度的增加，其捕獲的DPPH 自由基也越多，逐漸達(dá)到飽和狀態(tài)，變化也逐漸趨于緩慢。

半清除率（EC50）測定結(jié)果見表2。

表2 玉竹不同提取物抗氧化活性比較Tab.2 Antioxidant activity of the different extracts from Polygonatum odoratum

EC50越小，則其對DPPH 自由基的清除活性越強(qiáng)。由表2 可知，玉竹各提取物的DPPH 清除能力順序為：脂溶性提取物<總皂苷提取物<總酚酸提取物

3.4.2 FRAP 法測定抗氧化能力試驗結(jié)果

實驗確定了以FeSO4為對照品的總還原能力標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=0.195x+0.003（r=0.999 2）。由此得出玉竹各種提取物的FRAP 值結(jié)果見表2。而玉竹各提取物FRAP 值大小次序為：脂溶性提取物<總皂苷提取物<總酚酸提取物

4 結(jié)論

本研究分別提取了玉竹的脂溶性成分、多酚和總皂苷。由本研究可知，玉竹脂溶性成分、皂苷類成分和多酚類成分都具抗氧化活性。在這3 種提取物中，脂溶性成分抗氧化活性最弱，且含量最低；玉竹多酚類成分的報道較少，但抗氧化活性強(qiáng)于玉竹皂苷類成分。

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