白雪松，張晶瑩，李善姬

（1.吉林醫(yī)藥學(xué)院營養(yǎng)教研室，吉林吉林132013；2.吉林省衛(wèi)生檢測檢驗中心，吉林長春130062）

萱草又名金針菜，黃花菜、忘憂草，為百合科萱草屬多年生草本植物，原產(chǎn)于中國南部及日本，其根、葉、莖、花在東亞地區(qū)作為食品和傳統(tǒng)的藥品已有幾千年的歷史[1]。萱草營養(yǎng)豐富，含有糖類、蛋白質(zhì)、維生素、無機鹽及多種人體必需的氨基酸。在現(xiàn)代生活中，萱草與香菇、木耳、冬筍一起被稱為蔬菜類中的四大珍品[2]?！侗静菥V目》記載黃花菜有利胸膈、五臟、輕身明目、治小便赤澀、解煩熱、除酒瘟、令人好歡無憂等藥效。黃酮乃植物中廣泛存在的一種有效成分，具有保肝抗炎、鎮(zhèn)定補腦、延緩衰老、抗氧化自由基活性作用，此外還有降壓、降血脂、提高機體免疫力等藥理活性[3]。因此近年來黃酮類化合物成為了新藥開發(fā)研究中的一個非常重要的資源，具有廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景。

目前對萱草總黃酮的研究主要集中在提取工藝的研究，關(guān)于其抗氧化活性的研究尚未見到報道。本文對萱草總黃酮體外抗氧化作用進(jìn)行了初步研究，以期為萱草資源在抗氧化功能食品、藥品及天然抗氧化劑的研究及開發(fā)領(lǐng)域服務(wù)。

1 材料與儀器

1.1 材料

萱草：購自吉林市；2-D-脫氧核糖（2-Deoxy-Dribose，購自Sigma 公司，CAS：533-67-5）；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（中國藥品生物制品檢定所，CAS：153-18-4）；無水乙醇、乙醚、硫酸亞鐵、磷酸氫二鈉、磷酸氫二鉀、氯化鉀、三氯乙酸、2-硫代巴比妥酸蔗糖、抗壞血酸、過氧化氫等試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器

UV-1800 紫外分光光度計：日本島津；ZN-500A高速中藥粉碎機：長沙市岳麓區(qū)中南制藥機械廠；KQ-100DB 數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；TD5A 臺式低速離心機：湖南省凱達(dá)實業(yè)發(fā)展有限公司；HHS 電熱恒溫水浴鍋：上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；SHB-111A 循環(huán)水式多用真空泵：上海豫康科教儀器設(shè)備有限公司；202-1 電熱恒溫干燥箱：天津市泰斯特儀器有限公司。

2 方法

2.1 萱草總黃酮的提取

稱取干燥粉碎的萱草粉100 g，用乙醚在60 ℃下脫脂脫色4 h，脫脂后的萱草粉按料液比1 ∶20 加入60 %乙醇，60 ℃超聲浸取40 min，提取液離心10 min（3 000 r/min）上清液即為黃酮提取液，將黃酮提取液置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮并用60%乙醇定容至50 mL，稀釋500 倍，取1 mL 稀釋液于360 nm 處的吸光度，按下列公式計算黃花菜總黃酮含量：總黃酮含量=[樣品中相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)蘆丁濃度（μg/mL）×稀釋倍數(shù)×100]/[萱草樣品質(zhì)量（g）×測定用樣品的體積（mL）×1 000]×100%。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精確稱取10 mg 已烘至恒重蘆丁標(biāo)樣，以60%乙醇溶液溶解并定容至50 mL，搖勻即得濃度為0.2 mg/mL 標(biāo)樣儲備液。取蘆丁標(biāo)樣儲備液5.00 mL 于25 mL 容量瓶中，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)60%乙醇溶液定容，用紫外分光光度計在190 nm～400 nm 范圍內(nèi)進(jìn)行吸光度掃描，2 次掃描重復(fù)平均，最大特征吸收峰為360 nm。分別移取0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL 蘆丁標(biāo)樣儲備液于6 個10 mL 容量瓶中，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)60%的乙醇溶液定容，在360 nm 處測定吸光度。以濃度對吸光度進(jìn)行回歸，計算回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

2.2 抑制DPPH·作用測定

采用改進(jìn)的Nagai 法[4]，樣品組取各濃度黃酮樣品提取液（20.0、40.0、60.0、80.0、100.0 μg/mL）2.0 mL，分別加入4.0 mL DPPH·60%乙醇溶液，混勻，放置30 min。于波長517 nm 處測定吸光度值，記為A樣品，對照組以60%乙醇代替黃酮提取液，加DPPH·60%乙醇溶液4.0 mL，混勻，測吸光度值，記為A對照，同時設(shè)立空白組，取各濃度黃酮樣品提取液2.0 mL，加入60%乙醇溶液4.0 mL，混勻，測吸光度值，記為A空白。每個試樣做3 次平行，取平均值，根據(jù)如下公式計算抑制率。

2.3 清除·OH 作用測定

·OH 清除活性的測定采用2-脫氧核糖氧化法[5]，每支試管分別加入5 mmol/L FeSO4，5 mmol/L EDTA，5 mmol/L 2-D-脫氧核糖各0.2 mL，與0.2 mL 不同濃度黃酮樣品混合，加入0.1 mol/L PBS 緩沖液（pH7.4）1.0 mL，0.2 mL 的5 mmol/L H2O2，37 ℃水浴4 h，加1.4%三氯乙酸、0.5%硫代巴比妥酸各1 mL。沸水浴10 min后迅速冷卻至室溫。波長532 nm 處測定各管的吸光度值A(chǔ)樣品。與樣品組對比，空白組不加2-D-脫氧核糖，對照組60%乙醇代替樣品，測得的吸光度為A對照。

2.4 對H2O2 誘導(dǎo)肝勻漿脂質(zhì)過氧化的影響

取小鼠肝組織，用冷生理鹽水洗凈，冰浴下勻漿，制成1%（質(zhì)量體積比）的懸浮液。取1%肝勻漿2 mL，加入樣品0.4 mL，再加入6 mmol/L FeSO40.2 mL，60 mmol/L H2O20.2 mL，對照組加0.4 mL 的60%無水乙醇，陽性對照組與以各黃酮溶度一致的VC溶液代替測得的吸光度分別是A樣品，A對照，A空白。37 ℃溫育1 h 后，加入15%三氯乙酸2.0 mL，終止反應(yīng)，以3 000 r/min 離心10 min，取上清液，加0.67%硫代巴比妥酸2.0 mL，沸水浴15 min，流水冷卻，測定532 nm 處的吸光度值。

2.5 對H2O2 所致的紅細(xì)胞氧化溶血的影響

將小鼠斷頭取血，肝素抗凝，2 000 r/min 離心10 min得取沉淀即為紅細(xì)胞，用冷生理鹽水洗滌3 次，直至上層澄清無紅色，制成0.5%紅細(xì)胞懸液（質(zhì)量體積比）。取懸液4 mL 加入不同濃度的樣品0.2 mL，混勻后加入0.1 mL 100 mmol/LH2O2啟動反應(yīng)，37 ℃溫育1 h 后，2 000 r/min 離心10 min，加入4 mL 生理鹽水稀釋后于415 nm 波長下測定吸光度值。以0.1 mL 100 mmol/L H2O2+5%紅細(xì)胞+60%乙醇溶液為對照組，以與各黃酮提取液一致的溶度的VC溶液代替黃酮提取液作為陽性對照組。

2.6 數(shù)據(jù)處理

所有實驗數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)處理采用Excel 數(shù)據(jù)庫錄入數(shù)據(jù)并用SPSS11.5 軟件進(jìn)行分析，不同實驗組間采用t檢驗。

3 結(jié)果與討論

3.1 萱草總黃酮的提取

經(jīng)紫外分光光度計分析，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸方程為Y=36.121 4X+0.546 6，R=0.999 9。經(jīng)計算，萱草總黃酮含量為0.536%。

3.2 萱草總黃酮抑制DPPH·作用

DPPH·自由基是一種穩(wěn)定的自由基，其最大的吸收波長為517 nm。DPPH·自由基遇到提供質(zhì)子的物質(zhì)如抗氧化劑時就會被清除，表現(xiàn)為吸光度的降低[6]?；谶@個原理，物質(zhì)的抗氧化活性可以用其清除DPPH·自由基的能力來表示。結(jié)果見表1。

表1 萱草總黃酮對DPPH·抑制作用（±s，n=3）Table 1 Inhibition effect of DPPH·by total flavonoids from Hemerocallis fulva L（±s，n=3）

表1 萱草總黃酮對DPPH·抑制作用（±s，n=3）Table 1 Inhibition effect of DPPH·by total flavonoids from Hemerocallis fulva L（±s，n=3）

注：*萱草總黃酮組與對照組比較，P＜0.05；“—”表示空白。

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由表1 數(shù)據(jù)可知，萱草總黃酮提取液對DPPH·具有較高抑制作用，在20 μg/mL～100 μg/mL 范圍內(nèi)可見，隨濃度的增加，對DPPH·的抑制率明顯增強，且抑制率與黃酮的濃度呈一定量效關(guān)系。

3.3 萱草總黃酮清除·OH 作用

·OH 是目前所知活性氧中對生物體危害最大的一種自由基，對細(xì)胞內(nèi)DNA 的破壞作用最大。活性氧所導(dǎo)致的DNA 損傷在細(xì)胞里的積累被認(rèn)為是機體老化的主要原因[7]，因此研究·OH 的清除作用具有重要的應(yīng)用價值。萱草總黃酮自身可作為優(yōu)良供氫體，向活潑自由基提供氫后，通過共振雜化與其它自由基結(jié)合成穩(wěn)定二聚體，抑制率值越大表明供氫能力越強，即還原能力越強，越能發(fā)揮抗氧化作用。結(jié)果見表2。

表2 萱草總黃酮對·OH 抑制作用（±s，n=3）Table 2 Inhibition effect of·OH by total flavonoids from Hemerocallis fulva L（±s，n=3）

表2 萱草總黃酮對·OH 抑制作用（±s，n=3）Table 2 Inhibition effect of·OH by total flavonoids from Hemerocallis fulva L（±s，n=3）

注：*萱草總黃酮組與對照組比較，P＜0.05；“—”表示空白。

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由表2 數(shù)據(jù)可知，萱草總黃酮在較低濃度20 μg/mL時，對·OH 有較弱清除作用，但隨著濃度的增加，清除率逐漸增加，且清除率與黃酮的濃度呈一定量效關(guān)系。

3.4 萱草總黃酮對H2O2 誘導(dǎo)肝勻漿脂質(zhì)過氧化的影響

硫代巴比妥酸法[8]測定脂質(zhì)過氧化物的原理是基于一分子丙二醛可與兩分子硫代巴比妥酸發(fā)生縮合反應(yīng)，在酸性條件下形成在波長532 nm 處有最大吸收的紅色化合物。丙二醛（MDA）是脂質(zhì)過氧化的降解產(chǎn)物之一，其含量變化可間接反映被測體系中發(fā)生脂質(zhì)過氧化的程度。結(jié)果見表3。

表3 萱草總黃酮對H2O2 誘導(dǎo)肝勻漿脂質(zhì)過氧化影響（±s，n=3）Table 3 Inhibition effect of H2O2 induced lipid peroxidation by total flavonoids from Hemerocallis fulva L（±s，n=3）

表3 萱草總黃酮對H2O2 誘導(dǎo)肝勻漿脂質(zhì)過氧化影響（±s，n=3）Table 3 Inhibition effect of H2O2 induced lipid peroxidation by total flavonoids from Hemerocallis fulva L（±s，n=3）

注：*與VC 組比較，P＜0.05；“—”表示空白。

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從表3 中可以看出，VC溶液和萱草黃酮溶液均能較好地抑制由Fenton 反應(yīng)產(chǎn)生的·OH 誘導(dǎo)的離體肝細(xì)胞丙二醛的生成。在試驗濃度范圍內(nèi)，各組的抑制作用隨濃度的增加而逐漸增大，表現(xiàn)一定的量效關(guān)系，且在同濃度下，萱草黃酮樣品的抑制率大于VC溶液，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

3.5 萱草總黃酮對H2O2 所致的紅細(xì)胞氧化溶血的影響

紅細(xì)胞在體外因自身氧化或者誘導(dǎo)氧化細(xì)胞膜破裂而發(fā)生溶血，當(dāng)加入抗氧化物質(zhì)時，可抑制或減緩紅細(xì)胞氧化的過程[9]。從表4 中可以看出，萱草黃酮濃度從20 mg/mL 增加到100 mg/mL 時，萱草黃酮對紅細(xì)胞的溶血有抑制作用，且隨著濃度增加，抑制率明顯提高，當(dāng)濃度為100 mg/mL 時，萱草黃酮對H2O2紅細(xì)胞氧化溶血的抑制率可達(dá)55.03%。萱草黃酮對紅細(xì)胞的溶血抑制作用低于VC溶液，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)果見表4。

4 結(jié)論

本實驗結(jié)果表明，萱草總黃酮有較強的抗氧化活性，能顯著抑DPPH·、·OH 自由基，并能有效抑制紅細(xì)胞膜的氧化損傷，保護細(xì)胞膜，顯著抑制H2O2所致的紅細(xì)胞溶血，對體外溫育和H2O2誘導(dǎo)的肝勻漿丙二醛（MDA）生成具有較強抑制作用。

表4 萱草總黃酮對H2O2 所致的紅細(xì)胞氧化溶血的影響（±s，n=3）Table 4 Inhibition effect of H2O2 induced oxidative hemolysis of red blood cells by total flavonoids from Hemerocallis fulva L（±s，n=3）

表4 萱草總黃酮對H2O2 所致的紅細(xì)胞氧化溶血的影響（±s，n=3）Table 4 Inhibition effect of H2O2 induced oxidative hemolysis of red blood cells by total flavonoids from Hemerocallis fulva L（±s，n=3）

注：*與VC 組比較，P＜0.05；“—”表示空白。

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