祖立闖 ，王金良 ，肖躍強(qiáng) ，沈志強(qiáng) ，

（1.山東綠都生物科技有限公司，濱州 256600；2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，濱州 256600）

兔病毒性出血癥（rabbit hemorrhagic disease，RHD）又名兔瘟，是由兔病毒性出血癥病毒（rabbit hemorrhagic disease virus，RHDV）引起的兔的一種急性、高度致死性、高度傳染性疾病，其發(fā)病率和致死率都很高，是危害養(yǎng)兔業(yè)和實(shí)驗(yàn)兔的一種烈性、毀滅性傳染?。?－3］。該病于1984年春在江蘇無(wú)錫、江陰等縣市首次暴發(fā)，現(xiàn)在已蔓延至世界各地，呈世界性分布，給全球養(yǎng)兔業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失［4－8］。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織將其列為B類傳染病，我國(guó)農(nóng)業(yè)部也將其列為二類動(dòng)物疫病。由于RHDV在體外組織細(xì)胞的培養(yǎng)方法尚未建立，現(xiàn)行RHD的診斷和預(yù)防制劑一直利用來(lái)自感染兔的肝臟組織，成本高，抗原不易純化，也不符合動(dòng)物福利的要求。目前，研究者更傾向于利用分子生物學(xué)手段進(jìn)行新型診斷試劑及疫苗的研制和開(kāi)發(fā)。VP60為病毒衣殼蛋白，是RHDV唯一的結(jié)構(gòu)蛋白，與誘導(dǎo)抗病毒感染免疫反應(yīng)直接相關(guān)，是病毒免疫保護(hù)性抗原［9－11］。鑒于此，本研究對(duì) VP60基因主要抗原區(qū)域（長(zhǎng)度為510 bp）進(jìn)行了截短表達(dá)，并研制了間接ELISA診斷試劑盒。

1 材料與方法

1.1 菌株、病毒與血清

克隆菌株DH5α、表達(dá)菌株BL21、表達(dá)載體PGEX－4T－1、RHDV毒株及參考陽(yáng)性、陰性血清，均由山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑

Ex Taq酶、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、T4 DNA連接酶、pMD18-T克隆載體及限制性內(nèi)切酶，購(gòu)自寶生物（大連）工程有限公司；山羊抗兔IgG辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記抗體，購(gòu)自上海研卉生物科技有限公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank公布的RHDV基因組序列，利用oligo6.2設(shè)計(jì)合成了 1對(duì)特異性引物：P1 5’-3’CCGGAATTCGAGGGCAAAACC CGCAC；P2 5’-3’CCGCTCGAGT TGGGACGCAAGTCTGG。引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。

1.4 病毒基因組RNA的提取

將兔瘟肝臟組織毒反復(fù)凍融3次，經(jīng)3 000 r/min離心15 min，吸取上清作為病毒液，按Trizol試劑使用說(shuō)明提取病毒基因組RNA。

1.5 VP60基因的RT-PCR擴(kuò)增

以提取的病毒基因組RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性 5 min；94℃ l min、58℃ l min、72℃ l min，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min，4℃終止反應(yīng)。取擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL，在10 g/L的瓊脂糖凝膠上電泳，利用凝膠成像系統(tǒng)掃描進(jìn)行初步鑒定。

1.6 VP60基因表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

利用EcoRI/XhoI雙酶切VP60，回收VP60基因片段，定向克隆到經(jīng)EcoRI/XhoI雙酶切的PGEX-4T-1表達(dá)載體中，取連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)PCR及EcoRI/XhoI雙酶切鑒定后獲得重組表達(dá)載體PGEX-VP60。將鑒定為陽(yáng)性的克隆送生工生物工程（上海）有限公司測(cè)序，以驗(yàn)證其閱讀框架。

1.7 VP60重組蛋白的表達(dá)與純化

將鑒定正確的PGEX-VP60重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)菌BL21感受態(tài)細(xì)胞誘導(dǎo)表達(dá)后，超聲破碎細(xì)胞，12 000 r/min離心15 min，分別收集上清及沉淀進(jìn)行SDS-PAGE分析，對(duì)以包涵體形式存在于沉淀中的重組蛋白用尿素進(jìn)行變性處理，包涵體溶解后采用親和層析法純化，純化后的蛋白進(jìn)行透析復(fù)性。

1.8 VP60重組蛋白的Western blot檢測(cè)

純化的重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE后，轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉4℃封閉過(guò)夜，加RHDV陽(yáng)性血清（1∶100稀釋）37℃作用1 h，TBST緩沖液洗3次；加入山羊抗兔IgG辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記抗體（1∶5 000稀釋）,37℃作用50min，TBST緩沖液洗3次，在二氨基聯(lián)苯胺（DAB）緩沖溶液中顯色10min。

1.9 RHDV間接ELISA診斷方法（VP60-ELISA）的建立

1.9.1 反應(yīng)條件的優(yōu)化 在相同反應(yīng)條件下，分別將重組抗原的不同稀釋度與血清的不同稀釋度、不同封閉液與不同封閉時(shí)間、酶標(biāo)二抗不同稀釋度與不同作用時(shí)間組成方陣滴定試驗(yàn)，以陽(yáng)性血清OD450nm≈1.0、陰性血清OD450nm＜0.2、陽(yáng)性血清/陰性血清（P/N值）最大為選擇標(biāo)準(zhǔn)，確定重組抗原最佳包被濃度與血清樣品最佳稀釋度、最佳封閉液與最佳封閉時(shí)間、酶標(biāo)二抗最佳稀釋度與最佳作用時(shí)間。在相同反應(yīng)條件下，血清樣品分別作用 30、60、90、120min，TMB 底物液分別顯色 5、10、15、20 min，以陽(yáng)性血清 OD450nm≈1.0、陰性血清OD450nm＜0.2、P/N值最大為選擇標(biāo)準(zhǔn)，分別確定血清、底物的最佳作用時(shí)間。

1.9.2 判斷標(biāo)準(zhǔn)的確定 在最佳反應(yīng)條件下，利用VP60-ELISA檢測(cè)48份已知RHDV陰性血清樣本，以樣品號(hào)為橫坐標(biāo)、OD450 nm值為縱坐標(biāo)，繪制陰性樣品OD450 nm數(shù)值分布圖，并計(jì)算出48份陰性血清的OD450 nm平均值（）和標(biāo)準(zhǔn)差（SD），本試驗(yàn)規(guī)定樣本OD450 nm≥+3SD時(shí)為陽(yáng)性，樣本OD450 nm＜+2SD時(shí)為陰性，當(dāng)+2SD≤樣本OD450 nm＜+3SD時(shí)為可疑，需重新檢測(cè)樣本，重新檢測(cè)時(shí)樣本OD450 nm≥+2SD時(shí)判為陽(yáng)性，樣本OD450 nm＜+2SD時(shí)判為陰性。

1.9.3 敏感性試驗(yàn) 將RHDV標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性對(duì)照血清分別按 1∶50、1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400、1∶12 800、1∶25 600比例稀釋，每個(gè)稀釋度平行做4個(gè)重復(fù)，用建立的RHDV VP60-ELISA檢測(cè)，測(cè)定OD450 nm值，判定其抗體效價(jià)。

1.9.4 重復(fù)性試驗(yàn) ①批內(nèi)重復(fù)性。選取6份RHDV抗體水平不同的血清，進(jìn)行RHDV VP60-ELISA檢測(cè)，每份血清平行做6個(gè)重復(fù)，對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。②批間重復(fù)性。選取6份RHDV抗體水平不同的血清，于4個(gè)不同時(shí)間用RHDV VP60-ELISA進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。

1.10 臨床應(yīng)用

應(yīng)用研制的RHDV VP60-ELISA對(duì)來(lái)自河南、山東、河北等地的426份兔血清樣本進(jìn)行檢測(cè)，確定上述地區(qū)RHDV血清抗體的陽(yáng)性率。

2 結(jié)果與分析

2.1 RHDV VP60基因的PCR擴(kuò)增及其表達(dá)載體的鑒定

RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，在約510 bp處可見(jiàn)特異性DNA擴(kuò)增條帶（圖1），與預(yù)期大小相符。構(gòu)建的PGEX-VP60重組質(zhì)粒經(jīng)PCR及EcoRI/XhoI雙酶切鑒定（圖2）后，測(cè)序結(jié)果表明其閱讀框正確。

圖1 PCR擴(kuò)增結(jié)果

圖2 重組表達(dá)載體酶切鑒定

2.2 VP60重組蛋白的表達(dá)及純化

以最佳條件對(duì)PGEX－VP60誘導(dǎo)表達(dá)后，超聲破碎細(xì)胞，可見(jiàn)目的蛋白大部分以包涵體形式存在，包涵體經(jīng)8 mol/L尿素變性、親和層析法純化后，獲得了分子質(zhì)量為42ku的VP60重組蛋白（圖3）。

圖3 重組蛋白的SDS－PAGE分析

2.3 VP60重組蛋白的活性鑒定

取純化后的VP60重組蛋白，經(jīng)SDS－PAGE分析后，轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，與RHDV陽(yáng)性血清作用，結(jié)果表明該重組蛋白能與RHDV陽(yáng)性血清發(fā)生特異性反應(yīng)，而空載體表達(dá)菌與RHDV陽(yáng)性血清沒(méi)有反應(yīng)（圖4）。

圖4 表達(dá)產(chǎn)物的免疫印跡分析

2.4 RHDV VP60－ELISA檢測(cè)條件的確定

2.4.1 最佳反應(yīng)條件 重組抗原的最佳包被濃度為5.88 μg/mL；最佳封閉液為含 10 g/L BSA 的 PBST，最佳封閉時(shí)間37℃1 h；血清最佳稀釋度1∶100，最佳作用時(shí)間為37℃1 h；酶標(biāo)二抗最佳工作濃度1∶4 000，最佳作用時(shí)間37℃1h；底物最佳顯色時(shí)間37℃10min。

2.4.2 判定標(biāo)準(zhǔn) 48份陰性血清樣本經(jīng)RHDV VP60－ELISA檢測(cè)后，以樣品編號(hào)為橫坐標(biāo)、OD450 nm值為縱坐標(biāo)，得到陰性樣品OD450 nm數(shù)值分布圖（圖5）。計(jì)算得出48份陰性樣本OD450nm平均值和標(biāo)準(zhǔn)差分別為x＝0.224和SD＝0.058。即當(dāng)樣本OD450 nm≥0.398時(shí)判為陽(yáng)性；當(dāng)樣本OD450nm＜0.340時(shí)判為陰性；當(dāng)0.340≤樣本OD450nm＜0.398時(shí)判為可疑。對(duì)可疑樣本必須重新檢測(cè)，重新檢測(cè)時(shí)，樣本OD450 nm≥0.340為陽(yáng)性。

圖5 RHDV VP60－ELISA檢測(cè)48份陰性樣品OD450 nm分布圖

2.5 敏感性

用建立的RHDV VP60－ELISA檢測(cè)RHDV標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性對(duì)照血清，當(dāng)血清稀釋至12 800倍時(shí)，檢測(cè)結(jié)果仍為陽(yáng)性（圖6），證明所建立的方法具有較好的敏感性。

圖6 RHDV VP60-ELISA敏感性試驗(yàn)結(jié)果

2.6 重復(fù)性

批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)樣品的變異系數(shù)小于4.9%；批間重復(fù)性試驗(yàn)樣品的變異系數(shù)均小于6.9%。說(shuō)明RHDV VP60-ELISA具有良好的重復(fù)性。

2.7 臨床應(yīng)用結(jié)果

應(yīng)用研制的RHDV VP60-ELISA試劑盒檢測(cè)了來(lái)自河南、山東、河北等地的426份血清樣本，檢測(cè)出陽(yáng)性352份、陰性74份，陽(yáng)性率82.6%。

3 討論

RHD是對(duì)兔威脅最嚴(yán)重的一種病毒性傳染病，常予兔群以毀滅性打擊，危害性極大，是養(yǎng)兔業(yè)和實(shí)驗(yàn)用兔必檢病毒之一，檢測(cè)要求血清抗體必須達(dá)到保護(hù)性水平，才可以安全地用于生產(chǎn)和實(shí)驗(yàn)。隨著我國(guó)養(yǎng)兔業(yè)的發(fā)展及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)化程度的普及和提高，RHD診斷方法的建立和標(biāo)準(zhǔn)化不可或缺。目前常用的RHDV抗體檢測(cè)方法是血凝抑制試驗(yàn)（HI），需要人“O”型紅血球，血清需經(jīng)過(guò)吸附處理，過(guò)程較為繁瑣；結(jié)果判定易受許多主、客觀因素的影響，所以在實(shí)際應(yīng)用中受到很多限制。而ELISA診斷方法具有特異性和敏感性強(qiáng)、快速、準(zhǔn)確、通量高等特點(diǎn)，是動(dòng)物傳染病檢疫、免疫抗體水平監(jiān)測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查廣泛采用的診斷技術(shù)。目前RHDV所用疫苗和診斷試劑均來(lái)源于感染兔的肝臟組織，獲得純度較高的病毒比較困難。同時(shí)這種組織毒抗原制備過(guò)程繁瑣、成本高、存在潛在的危險(xiǎn)性及不符合動(dòng)物福利的要求，一定程度上限制了全病毒間接ELISA檢測(cè)試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)化。因此，利用基因工程表達(dá)的人工抗原已逐步得到重視。VP60是RHDV唯一結(jié)構(gòu)蛋白，是病毒免疫保護(hù)性抗原，在RHDV診斷、新型疫苗的研制中具有十分重要的意義。為此，本試驗(yàn)利用PGEX-4T-1原核表達(dá)載體，表達(dá)了RHDV的VP60蛋白，經(jīng)免疫印跡試驗(yàn)證實(shí)所截短表達(dá)的重組VP60蛋白具有良好的反應(yīng)性與特異性，并以該蛋白為包被抗原建立了檢測(cè)RHDV抗體的VP60-ELISA診斷方法。

目前，國(guó)內(nèi)各兔場(chǎng)均將兔瘟作為重點(diǎn)免疫疫病，作為重點(diǎn)防范的疫病之一，多年來(lái)未曾見(jiàn)大疫情流行報(bào)道，本次調(diào)查發(fā)現(xiàn)RHDV的平均抗體陽(yáng)性率高達(dá)82.6%，說(shuō)明我國(guó)現(xiàn)行兔瘟疫苗效果較好，但仍存在個(gè)別兔場(chǎng)免疫失敗的現(xiàn)象。總之，本試驗(yàn)所表達(dá)的重組VP60蛋白具有良好的反應(yīng)活性，以其作為包被抗原建立的間接ELISA診斷方法具有很好的敏感性和特異性，顯示出了良好的應(yīng)用前景。本實(shí)驗(yàn)室預(yù)期將其組裝成試劑盒，為我國(guó)RHDV的診斷、疫苗免疫水平監(jiān)測(cè)、流行病學(xué)調(diào)查、實(shí)驗(yàn)兔等級(jí)檢測(cè)等提供一種簡(jiǎn)便、快速的血清學(xué)檢測(cè)方法。

［1］Meyers G，Wirblich C，Thiel H J.Genomic and subgenomic RNAs of rabbit hemorrhagic disease virus are both protein-linked and packaged into particles［J］.Virology，1991，184（2）：677-686.

［2］Abrantes J，van der Loo W，Le Pendu J，et al.Rabbit haemorrhagic disease（RHD）and rabbit haemorrhagic disease virus（RHDV）：a re view［J］.Vet Res，2012，3（1）：12.

［3］金明蘭，侯繼波，鄭其升，等.兔出血癥病毒JL株分離鑒定及VP60 基因主要抗原表位分析［J］.中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2012，32（6）：833-838.

［4］劉勝江，薛華平，蒲伯清，等.一種新的家兔病毒病——兔病毒性出血癥［J］.畜牧與獸醫(yī)，1984，16：253-255.

［5］Kerr P J，Kitchen A，Holmes E C.Origin and phylodynamics of rabbit hemorrhagic disease virus［J］.J Virol，2009，83（23）：12129-12138.

［6］Gould E A.First case of rabbit haemorrhagic disease in Canada：contaminated flying insect，vs.long-term infection hypothesis［J］.Mol Ecol，2012，21（5）：1042-1047.

［7］Le Gall-Recule G，Zwingelstein F，Boucher S，et al.Detection of a new variant of rabbit haemorrhagic disease virus in France［J］.Vet Rec，2011，168（5）：137-138.

［8］Alda F，Gaitero T，Suárez M，et al.Evolutionary history and molecular epidemiology of rabbit haemorrhagic disease virus in the Iberian Peninsula and Western Europe［J］.BMC Evol Biol，2010，10：347.

［9］Ma W，Yu L.Analysis of two VP60 capsid protein genes of rabbit hemorrhagic disease virus from viruses obtained from the same farm［J］.Arch Virol，2010，155（9）：1497-501.

［10］Spibey N，McCabe V J，Greenwood N M，et al.Novel bivalent vectored vaccine for control of myxomatosis and rabbit haemorrhagic disease［J］.Vet Rec，2012，170（12）：309.

［11］Kinnear M，Linde C C.Capsid gene divergence in rabbit hemorrhagic disease virus［J］.J Gen Virol，2010，91（1）：174-181.