唐玉林

大連大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 116622

近年來，隨著我國改革開放的不斷深入，我國經(jīng)濟(jì)和科技都得到快速發(fā)展，并且人們的綜合素質(zhì)水平也得到很大的提升，人們對環(huán)境保護(hù)的呼聲越來越高，且環(huán)境保護(hù)已經(jīng)成為國際共同關(guān)注的重點(diǎn)話題。而微生物作為環(huán)境凈化的主要作用者之一，研究和開發(fā)新微生物處理技術(shù)以及新工藝具有重要的作用和意義。其主要是由于微生物能將有機(jī)物質(zhì)作為營養(yǎng)源轉(zhuǎn)化為組成物質(zhì)和能量，這些物質(zhì)能有效吸附污染物，并且能有效降解環(huán)境中的污染源。DGGE技術(shù)是目前新技術(shù)研究的新產(chǎn)物，在環(huán)境生物多樣化研究中起著重要的作用，具有經(jīng)濟(jì)的推廣意義。

1 DGGE技術(shù)分析

DGGE技術(shù)主要是利用具有化學(xué)變性劑梯度的聚丙烯酰胺凝膠對DNA進(jìn)行電脈，其主要是由于聚丙烯酰胺凝膠具有將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物有區(qū)分的分解開來。一般在使用聚丙烯酰胺凝膠對PDR產(chǎn)物進(jìn)行變性梯度凝膠電脈分解時，由于長度相同而堿基序列上存在的DNA 雙鏈片段會隨著變性劑濃度的增加而在各自發(fā)生不同的變化，其空間結(jié)構(gòu)形式也會發(fā)生變化。結(jié)構(gòu)形式與濃度變化的關(guān)系為結(jié)構(gòu)形式隨著濃度的增加而由開始雙鏈DNA向正極移動，DNA中含有低G+C的序列部分就會被拆解開來，但是高G+C含量的部分卻仍然保持雙鏈。在電脈過程中，DNA雙鏈一旦發(fā)生解鏈現(xiàn)象，DNA分子形成端部的就會被漸漸的熔化。如果電脈時，聚丙烯酰胺凝膠中的電脈急速下降，直至停止在其相應(yīng)的不同的變性劑梯度位置時，染色后的DNA會被分開，并且以條狀的形狀出現(xiàn)，最終能將具有相同長度且有相互區(qū)別的DNA分子分離開來。

2 DGGE技術(shù)使用的基本工作流程

2.1 基本工作流程

首先，樣品預(yù)處理。DNA樣品提取是DGGE技術(shù)在環(huán)境微生物多樣化研究應(yīng)用的前提和基礎(chǔ)。濕地樣品種類很多，這些細(xì)菌種類含有大量的有毒物質(zhì)和腐殖質(zhì)。而如何有效的提取DNA樣品直接決定著研究效果，一般DGGE技術(shù)取樣分為直接取樣法和間接取樣化。其中直接取樣法就是在土壤中直接裂解微生物體，然后從微生物中提取DNA，這種取樣法就是將微生物懸浮在裂解緩沖中處理，提取釋放的DNA，然后還要提煉，確保試驗樣品的純度。直接取樣有SDS高鹽提取法和SDS酚氯傷抽取法，前者的主要優(yōu)勢在于提取效率高，而SDS酚氯抽提的效率比較低，并且會造成DNA分子不完整。但是SDS酚氯提取也有優(yōu)勢，這種提取方法中含有的多腐殖酸等雜質(zhì)，經(jīng)過純化后就可以用于研究。另一種間接提取的方法就是將微生物細(xì)菌與土壤分開來，然后再提取DNA，這種方法提取的純度很高，片段完整，并且能直接用于后續(xù)一般的操作。間接提取方法比直接提取方法的效率要高，并且細(xì)胞分離的效果好。

其次，PCR的擴(kuò)增及偏差和優(yōu)化，這一個步驟是整個研究中最重要的部分，其主要采用16S DNA中的保護(hù)區(qū)作為引物進(jìn)行PCR反應(yīng)。采用16S DNA的重要原因是序列分子比較短，比較適應(yīng)于分類學(xué)科的研究。再者，16S DNA是原核生物的主要成分，成分很穩(wěn)定，在不同階段基因變化的情況比較小，表現(xiàn)得很保守。并且這種16S DNA都具有自身基本的資料庫，然后通過將提取的樣品預(yù)數(shù)據(jù)庫中的進(jìn)行對比，最終得出結(jié)果。目前被廣泛應(yīng)用到微生物多樣性研究中的16S DNA主要有338f/518r（V3區(qū)）以及341f/926r(V3-V5區(qū))等。PCR技術(shù)的特點(diǎn)就是高溫變性、低溫退火以及常溫延伸等，這三個方面是主要使用的結(jié)構(gòu)，主要是將特異耐熱酶TaqDNA中的聚合酶經(jīng)過受熱發(fā)生反應(yīng)，然后DNA分子會沿著模板方向延伸，將這個過程反復(fù)幾次，最終能使得DNA中的PCE擴(kuò)增物的數(shù)目上升。一般在試驗中，的反映程序為：94!C/S、50!C/S以及72!C/S，一共有33個循環(huán)，最后就是延伸階段。從研究結(jié)果可以得知，在任何條件下試驗偏離最佳試驗條件將導(dǎo)致擴(kuò)增PCR或者非特異性產(chǎn)物等，這些物質(zhì)的產(chǎn)生很容易影響試驗結(jié)果和可靠性。所以，在實(shí)驗中一定要選擇最佳電泳條件。

最后，電泳條件的選擇在整合分析過程中是至關(guān)重要的部，因此，電泳條件的好壞直接關(guān)系著試驗研究的直接效果。一般的DGGE技術(shù)電泳條件包括變性劑梯度、電泳溫度以及時間和顯影等方面，這些方面的條件只要能達(dá)到相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，最終能通過反復(fù)的試驗確定結(jié)果。

3 DGGE技術(shù)在環(huán)境微生物多樣化研究中的應(yīng)用

3.1 PCR-DGGE技術(shù)實(shí)現(xiàn)廢水電解

廢水處理主要是對廢水中的微生物群體解耦股的動態(tài)變化進(jìn)行追蹤研究，針對兩種不同的微生物成分進(jìn)行對比分析，最終得出理想的實(shí)際效果。即在相同條件下對低溫細(xì)菌種和常溫細(xì)菌種展開對比分析，觀察在不同技術(shù)下，常溫和低溫細(xì)菌的動態(tài)變化。根據(jù)相關(guān)實(shí)驗結(jié)果顯示，環(huán)境對微生物的影響直接決定著微生物群落結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵因子的組成結(jié)構(gòu)。某單位利用DGGE技術(shù)對湖泊中中的污染的水源提取進(jìn)行試驗，最終結(jié)果顯示在16S DNA中338f/518r（V3區(qū)）以及341f/926r(V3-V5區(qū))PRC擴(kuò)增，并且在V3區(qū)-V5區(qū)中存在很多微生物特異性片段，最終使用SDS間接提取的方法，對廢水中的微生物結(jié)構(gòu)群進(jìn)行比對研究，得出在不同階段和不同時間，微生物結(jié)構(gòu)基本一致，但是優(yōu)勢細(xì)菌卻不相同。由此說明，水解酸化池的活性污泥微生物多樣性受到水深度的影響變化很大，并且其結(jié)構(gòu)也會發(fā)生種群散量上均有較大的差異。根據(jù)實(shí)驗結(jié)果顯示，DGGE技術(shù)在廢水處理中能凈化水中的污泥，講解廢水中的有害雜質(zhì)，實(shí)現(xiàn)廢水再利用的理想效果。

3.2 PCR-DGGE技術(shù)在土壤微生物研究中的應(yīng)用

通過運(yùn)用PCR-DGGE對農(nóng)田中的土壤微生物進(jìn)行分析可知，DGGE技術(shù)可以對所取用的土壤微生物中不同微生物的16SrRNA基因片段上的V3區(qū)DNA擴(kuò)增片斷進(jìn)行分離。這一應(yīng)用為DNA片段的鑒定與定性工作提供了良好條件。通過對南極中山站排污口土壤中微生物群落進(jìn)行DGGE分析得到，該處樣品中的微生物組成與周圍環(huán)境中的微生物不太一樣。

3.3 PCR-DGGE技術(shù)在膜生物處理中的應(yīng)用

PCR-DGGE技術(shù)可以用來解析膜生物反應(yīng)器中的微生物，研究它們的群落多樣性，而這項技術(shù)在膜生物處理中的應(yīng)用說明在長期的穩(wěn)定運(yùn)行以后，會形成各自的特定群落結(jié)構(gòu)。這些群落結(jié)構(gòu)既有優(yōu)勢相同的種群同時也有具備自己獨(dú)特優(yōu)勢的種群，并且同樣的種群在不同的反應(yīng)器中所獲得的優(yōu)勢也不相同，而種群所具備的獨(dú)特優(yōu)勢則是在不同的水質(zhì)中經(jīng)過長時間的演變獲得的。利用PCRDGGE技術(shù)對生物陶粒反應(yīng)器中細(xì)菌種群的巖體情況分析可知，優(yōu)勢種群的數(shù)量與群落結(jié)構(gòu)具有一定的時序動態(tài)性，并且微生物的多樣性與廢水的處理效果有著協(xié)同變化的特性。將生物膜和水體微生物之間多樣性進(jìn)行比較以后發(fā)現(xiàn)，微生物膜越成熟，微生物群落越穩(wěn)定，生物膜上面微生物的多樣性與水體微生物的多樣性相比就會越高。

4 DGGE技術(shù)在環(huán)境微生物多樣化研究中應(yīng)用的優(yōu)勢與未來展望

DGGE技術(shù)目前在實(shí)際使用中已經(jīng)取得一定的成效，這種技術(shù)在微生物多樣化研究應(yīng)用中的還無法達(dá)到最佳效果，如DGGE技術(shù)能將微生物中的DNA分解，達(dá)到有效降解環(huán)境中的污染物，起到保護(hù)環(huán)境的作用。但是，這種技術(shù)自身還存在一些缺點(diǎn)，如只能分解較小的片段，一般都是500bp以下的DNA分子，對于相對分子較大的片段就無法達(dá)到理想的效果。所以，技術(shù)研究人員不能停止研究腳步，還需要進(jìn)一步針對當(dāng)前DGGE技術(shù)使用中的難點(diǎn)進(jìn)行研究和分析。最終找到解決方案，進(jìn)一步提升技術(shù)水平，使之能更好的為環(huán)境保護(hù)作出貢獻(xiàn)，并且能被推廣應(yīng)用到其他各個領(lǐng)域中，為構(gòu)建社會主義和諧社會以及實(shí)現(xiàn)社會可持續(xù)發(fā)展做貢獻(xiàn)。尤其是隨著信息技術(shù)的不斷發(fā)展，未來DGGE技術(shù)在微生物多樣性研究中的應(yīng)用要引進(jìn)計算機(jī)技術(shù)的數(shù)據(jù)儲存、管理以及整理分子的功能，科學(xué)規(guī)范的對微生物中的分子進(jìn)行分類鑒定，長久儲存鑒定數(shù)據(jù)資源，為以后研究人員提供豐富、大量的數(shù)據(jù)資源，進(jìn)一步推進(jìn)我國生物工程事業(yè)的發(fā)展。

結(jié)束語

綜上所述，目前DGGE技術(shù)在環(huán)境多樣化研究中已經(jīng)得到廣泛的使用，主要有廢水處理、土壤生物研究以及膜生物處理研究等方面的應(yīng)用，其在實(shí)際應(yīng)用中已經(jīng)得到良好的效果，能將微生物中具有相同長度且序列號有差異的DNA分解開來。使用DGGE技術(shù)進(jìn)行環(huán)境微生物多樣化研究時，一般采用取樣分析法，通過直接過著間接取樣，對微生物中PCE擴(kuò)增物進(jìn)行優(yōu)化，然后在最佳電泳的條件下，利用聚丙烯酰胺凝膠對DNA進(jìn)行分解。通過反復(fù)試驗最終分解微生物中的DNA鏈，達(dá)到降解環(huán)境污染物的最佳效果，實(shí)現(xiàn)社會的可持續(xù)發(fā)展。

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