陳麗華，潘自紅，曹云麗，馬慶一

（平頂山學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，河南平頂山467000）

據(jù)專家預(yù)測到2025年全球糖尿病患者將達(dá)3 億[1]，而目前糖尿病在中國正處于爆發(fā)期，每天以至少3 000人的速度增長，已成為繼心血管疾病和腦瘤之后的第三位“健康殺手”，預(yù)防和治療該病已經(jīng)成為全球醫(yī)藥和食品領(lǐng)域日益關(guān)注的研究課題之一。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)發(fā)現(xiàn)高血糖是引發(fā)糖尿病并發(fā)癥的重要因素，糖尿病并發(fā)癥又是引起糖尿病死亡率增大的一個重要原因[2]，研究還表明，餐后高血糖對心腦血管并發(fā)癥的發(fā)生有著重要的影響，所以降低餐后血糖，是預(yù)防糖尿病，減少并發(fā)癥和降低死亡率的重要措施之一。

食物中碳水化合物等在唾液和胰α－淀粉酶作用下先水解為寡糖，然后經(jīng)小腸上皮絨毛膜刷狀緣上α－葡萄糖苷酶的作用生成單糖再進(jìn)入血液。這一控制血糖生成的關(guān)鍵酶活性的抑制可以阻滯寡糖水解，延緩糖的吸收，避免血糖的峰值，使其平穩(wěn)且緩慢地維持在一定水平上[3]。

地榆是中國藥典收載的良種藥用之一[4]，有多種藥用價值，能夠涼血，止血，抗菌，降糖，解毒，止吐，治療燙傷等。地榆中含有主要化學(xué)成分為多糖，皂甙，鞣質(zhì)和黃酮等[5]。本研究旨在從中藥地榆中分離提取α-葡萄糖苷酶抑制劑活性成分，對所得活性成分的α－葡萄糖苷酶抑制活性和其性質(zhì)進(jìn)行初步研究與探討，其中我們主要考察的特征是：1）抑制強(qiáng)度，以IC50和Ki等參數(shù)來衡量；2）與酶的絡(luò)合機(jī)制（是否競爭性）；3）穩(wěn)定性。文中詳細(xì)闡述和對比了兩組分各特征參數(shù)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。這些數(shù)值將會成為新產(chǎn)品研發(fā)的重要依據(jù)，這將為進(jìn)一步充分研究其構(gòu)效關(guān)系，對發(fā)現(xiàn)高效、安全的降低餐后血糖新藥物具有重要作用。

1 儀器和試劑

ZFQ85A 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海醫(yī)械專機(jī)廠；80-1 離心沉淀器：上海手術(shù)器械廠；TGL-18C 高速臺式離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；85-2 磁力攪拌器：江蘇中大儀器廠；ZF-C 三用紫外燈：上海康禾光電儀器有限公司；756 紫外可見分光光度計：上海分析儀器廠；QYQ 微量移液器：北京表云航空儀表有限公司；α－葡萄糖苷酶：SIGMA；4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷（PNPG）：E.Merck 公司；對硝基苯酚（PNP）：儀征市鼎信化工有限公司；APD-600 大孔樹脂：西安樹脂廠；地榆：鄭州中藥城；拜糖平：鄭州藥店；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

2 方法

2.1 地榆中各成分的提取

2.1.1 地榆藥材的預(yù)處理

將地榆根在不超過40 ℃的烘箱中烘干，粉碎，過40 目篩，備用。

2.1.2 地榆總物質(zhì)水粗提液的提取

稱取地榆粗粉20 g 置于200 mL 蒸餾水中，50 ℃下攪拌提取2 h，趁熱抽濾，濾渣再加水160 mL，重復(fù)上述操作。所得濾液與上次合并，減壓濃縮至100 mL左右，先加入活性炭和硅藻土各5 g，脫色，抽濾，濾液再加聚酰胺樹脂15 g 放置過夜。抽濾，濾液濃縮并定容為50 mL，即得總物質(zhì)，避光，冷藏，待用做組分定性檢測及酶動力學(xué)測定。

2.1.3 地榆中皂甙的提取

稱取地榆粗粉20 g，95%乙醇提取[6]，甲醇溶乙醚沉淀初步純化[7]，再用大孔吸附樹脂分離純化[8]，將純組分濃縮至3 mL 為皂甙液，冷藏，待用做組分定性檢測及酶動力學(xué)測定。

2.1.4 地榆中鞣質(zhì)的提取[9]

稱取地榆粗粉20 g，置于帶塞三角瓶內(nèi)，加入體積比為1 ∶1 丙酮/水混和溶液100 mL，置于暗處，室溫冷浸24 h，減壓抽濾，濾渣再加入體積比為1 ∶1 丙酮/水混和溶液80 mL 重復(fù)上述操作，合并兩次的濾液，濾液用石油醚萃取2 次～3 次，再用二氯甲烷萃取2 次～3次，萃取后的水相中加入4%的明膠，離心，上清液中繼續(xù)加入4%的明膠直至無白色沉淀生成，離心，合并離心后的沉淀物。沉淀用體積比為1 ∶1 丙酮/水混和溶液50 mL 浸提，浸提時控制水浴溫度于30 ℃～40 ℃之間，重復(fù)3 次～4 次，將浸提液減壓濃縮除去丙酮，濃縮時嚴(yán)格控制溫度不超過40 ℃，濃縮后高速離心（9 000 r/min），所得液體應(yīng)澄清透明，少量水溶解，待檢測確認(rèn)其成分。

2.1.5 地榆中多糖的提取[10]

稱取地榆粗粉20 g，用95%乙醇200 mL 加熱回流2 h，趁熱抽濾，濾渣再用95%乙醇160 mL 加熱回流2 h，趁熱抽濾，濾渣用水160 mL 在50 ℃～60 ℃水浴下攪拌提取2 h，趁熱抽濾，濾渣再用水120 mL 在同條件提取2 h，趁熱減壓抽濾，合并兩次濾液，減壓濃縮，濃縮后的濾液中加入聚酰胺脫色過夜，減壓抽濾，真空濃縮，少量水溶解，避光，冷藏，待進(jìn)行其組分的定性檢測，備用，待進(jìn)行酶抑制動力學(xué)測定。

2.1.6 地榆中黃酮的提取

稱取地榆粗粉20 g，用95%乙醇200 mL 加熱回流2 h，趁熱抽濾，濾渣再用95%乙醇160 mL（加熱回流2 h，趁熱抽濾，合并兩次濾液.將濾液減壓濃縮至浸膏狀，用100 mL 水溶解，過濾，向?yàn)V液中滴加4%的明膠[11]，至不再產(chǎn)生沉淀為止。離心，上清液濃縮至少量，用石油醚（100 mL×3）萃取。水層加0.1 mol/L 鹽酸調(diào)pH 等于1，并加入食鹽飽和，用乙酸乙酯萃取，至乙酸乙酯層無黃酮檢出，減壓濃縮乙酸乙酯層至干，用少量水溶解，即得黃酮提取液，定容，避光，冷藏，待進(jìn)行其組分的定性檢測，備用，待進(jìn)行酶抑制動力學(xué)測定。

2.2 地榆中各提取物的定性檢測[12]

檢測多糖：α－萘酚試驗(yàn)（Molisch 紫環(huán)反應(yīng)）；檢測鞣質(zhì)：三氯化鐵試驗(yàn)；明膠試驗(yàn)：香草醛-鹽酸試驗(yàn)；檢測皂甙：泡沫試驗(yàn)、醋酐濃硫酸試驗(yàn)（Liebrmann Burchard）、氯仿-濃硫酸實(shí)驗(yàn)（Tschugaeff）；檢測黃酮：鹽酸-鎂粉試驗(yàn)。

2.3 地榆中各成分抑制效果的測定

2.3.1 實(shí)驗(yàn)條件的確定和α－葡萄糖苷酶活性的測定[4]

方法1：在帶塞的試管中加入3 mL pH6.81 的緩沖液和0.75 mL 的PNPG（2 mmol/L），在37 ℃下保溫10 min后，加入15μL 的α-葡萄糖苷酶（酶的濃度為5.0 mg/mL），在37 ℃下分別反應(yīng)2、4、6、8、10、15 min 后，以4 %Na2CO3終止反應(yīng)，在400 nm 處測定其吸光度。同時選未加酶的反應(yīng)液為空白，以消除PNPG 自身水解產(chǎn)生的對硝基苯酚（PNP）對測定波長下吸光度的貢獻(xiàn)所造成的偏差。

方法2：在本法中，α－葡萄糖苷酶活性測定實(shí)驗(yàn)于室溫下直接在比色皿中進(jìn)行（其它皆與方法1 同），每分鐘讀一次吸光度值并記錄。

2.3.2 拜堂平抑制活性的測定

反應(yīng)體系組成的設(shè)計結(jié)果見表1。

表1 拜堂平抑制活性檢測反應(yīng)體系的組成Table 1 Reactant system for evaluate the effects of Glucobay on the activity of a-glucosidase

將拜堂平、PNPG，緩沖液混合置于比色皿中，靜置10 min 后加入15 μL α-葡萄糖苷酶，快速激烈振蕩后開始計時，在400 nm 下每分鐘讀取一次吸光度值，以不加酶的相同混合液為空白，以消除PNPG 和拜堂平本身對吸光度的影響。

2.3.3 地榆中各成分抑制活性的測定

反應(yīng)體系見表2，操作同2.3.2，以反應(yīng)15 min 時的吸光值為基準(zhǔn)計算各組分的抑制率，并與拜堂平相比較。抑制率計算公式：

表2 各提取液抑制活性的反應(yīng)體系Table 2 Reactant system for evaluate the effects of extracts on the activity of a-glucosidase

2.4 抑制劑用量對酶活性的影響

2.4.1 不同濃度地榆黃酮對酶活性的影響

試驗(yàn)設(shè)計見表3（每個濃度下都以不加酶的相同混合液作為對照），然后作抑制率－抑制劑濃度圖確定最大半抑制濃度IC50[13-14]。

表3 不同濃度黃酮時的反應(yīng)體系組成Table 3 Reactant system for evaluate the effects of flavone on the activity of a-glucosidase

2.4.2 不同濃度地榆鞣質(zhì)提取液對酶活性的影響

試驗(yàn)設(shè)計見表4（每個濃度下都以不加酶的相同混合液作為對照），然后作抑制劑濃度－抑制率圖確定最大半抑制濃度IC50。

表4 不同濃度鞣質(zhì)時的反應(yīng)體系Table 4 Reactant system for evaluate the effects of tanins on the activity of a-glucosidase

2.5 溫度對抑制劑活性的影響

先將抑制劑溶液（0.400 mg/mL）分別于40、50、60、70、80、90、100 ℃保溫10 min，迅速冷卻至室溫，然后各取1 mL，與0.75 mL PNPG（濃度為10 mmol/L）和2 mL 緩沖溶液混合（每個溫度下都以不加酶的相同混合液作為對照），測定對α-葡萄糖苷酶的抑制活性[15]。每個溫度下都以不加酶的相同混合液作為對照，測定對α－葡萄糖苷酶的抑制活性[5]。

2.6 抑制劑的抑制動力學(xué)試驗(yàn)

2.6.1 α-葡萄糖苷酶的抑制動力學(xué)試驗(yàn)

改變底物濃度，在400 nm 下測定不同底物濃度（0.25、1.00、2.00、2.50、3.075、5.00 mmol/L） 時 酶 的 活性，保證反應(yīng)總體積和酶用量不變，且每個濃度下都以不加酶的相同混合液作為對照），可得到一系列不同底物濃度條件下的酶活力，按Lineweave-Burk 作圖法，求出米氏常數(shù)[16]。

2.6.2 地榆中黃酮和鞣質(zhì)的抑制動力學(xué)試驗(yàn)

每種抑制劑選兩個濃度，各濃度抑制劑所對應(yīng)的反應(yīng)體系見表5（每個底物濃度下都以不加酶的相同混合液作為對照），由系列不同底物濃度條件下的酶活力，按Lineweave-Burk 作圖法，確定抑制類型和抑制常數(shù)[17-18]。黃酮終濃度分別選擇為1.333 mg/mL 和2.667 mg/mL，鞣質(zhì)濃度為0.400 mg/mL 和0.133 mg/mL。

表5 不同濃度底物時山茱萸中皂甙和鞣質(zhì)抑制動力學(xué)試驗(yàn)的反應(yīng)體系Table 5 Reactant system for evaluate the effects of different tannin and flavone concentrationes on the activity of a-glucosidase under different concentrations of substrate

3 結(jié)果和分析

3.1 提取率

從地榆中提取、分離并部分純化得到水粗提物、多糖、黃酮、鞣質(zhì)、皂甙。各組分的得率分別為1.45%、1.27%、1.06%、0.87%、0.88%。

3.2 各提取物的定性檢測

地榆中各組分的定性檢測結(jié)果如表6 所示。

表6 地榆各組分的定性檢測結(jié)果Table 6 The results of qualitative test for inhibitors extracted from Sanguisorba officinalis

盡管水提總物質(zhì)并無必要總是等于各組分得率之和，事實(shí)上中草藥水粗提液的得率常小于各組分得率之和，這是由于某些組分中還有非水溶性物質(zhì)的存在。但與水溶性組分相比，地榆水粗提物的得率仍然偏低，這主要是脫色過程中的嚴(yán)重?fù)p失造成的。

3.3 實(shí)驗(yàn)條件的確定和α－葡萄糖苷酶活性的測定

分別計算37 ℃和室溫26 ℃下測得的吸光度隨時間的變化數(shù)值，并共同繪制成A-t 曲線，如圖1。

圖1 兩種溫度下A-t 曲線圖Fig.1 The absorb value curves depending on time at different temperatures

從圖1 中可以看出，雖然在兩個溫度下吸光度在某一特定時間點(diǎn)的數(shù)值以及其隨時間變化曲線的斜率均隨溫度的升高而增加，但兩曲線的形狀和變化趨勢十分相像（即在同樣的時間點(diǎn)上完成從直線到上翹弧線至平臺的過渡），僅有的差別是絕對數(shù)值的不同，因此可以將傳統(tǒng)的Tremblay[19]測定法改為在室溫下比色皿中直接測定。

3.4 各組分對α－葡萄糖苷酶活性的作用效果及其與拜堂平的比較

底物濃度為2 mmol/L，各成分濃度均為0.400 mg/mL時各成分與酶作用的結(jié)果，繪制吸光度與時間的關(guān)系見圖2。

圖2 各成份對酶作用的時間與吸光度曲線圖Fig.2 The absorb value curves depending on time of all αglucosidase inhibitors extracted from Sanguisorba officinalis

從圖2 中可看出，地榆多糖對α-葡萄糖苷酶有激活作用（本實(shí)驗(yàn)暫不作詳細(xì)探究），地榆水粗提物和皂甙提取液有些許激活作用，而黃酮和鞣質(zhì)具有顯著的抑制效果。以第15 分鐘的吸光度計算抑制率，結(jié)果如圖3 所示。

圖3 不同抑制劑的抑制率Fig.3 The inhibit ratio of all α-glucosidase inhibitors extracted from Sanguisorba officinalis and Acarbose

由上述的實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明：1）地榆黃酮和鞣質(zhì)的抑制率分別為75.10%和92.23%（濃度為0.400 mg/mL），高于拜唐蘋（2.667 mg/mL 時的抑制率68.51%）；2）地榆多糖具很強(qiáng)的激活作用，皂甙提取液有些許的激活作用；3）總物質(zhì)水提液有些許的激活作用，這是因?yàn)樗饕猩腔钚缘亩嗵恰?/p>

3.5 抑制劑性質(zhì)的研究

3.5.1 地榆黃酮、鞣質(zhì)不同濃度對酶活性的影響

選用底物濃度為2 mmol/mL，反應(yīng)時間15 min 為基準(zhǔn)。測定不同濃度的地榆黃酮與酶反應(yīng)液的吸光度，從而計算出濃度分別為0.400、1.333、2.000、2.667 mg/mL時的抑制率分別為：75.10%、81.03%、92.09%、96.97%，作抑制率－抑制劑濃度圖，如圖4 所示。

圖4 黃酮濃度－抑制率圖Fig.4 Inhibitory ratio depending on the concentrationes of flavones

選用底物濃度為2 mmol/mL，反應(yīng)時間15 min 為基準(zhǔn)。測定不同濃度的黃酮鞣質(zhì)與酶反應(yīng)液的吸光度，從而計算出濃度分別為0.133、0.267、0.400、0.533 mg/mL 時的抑制率分別為：91%、92.36%、93.28%、94.33%。作抑制率－抑制劑濃度圖如圖5 所示。

圖5 鞣質(zhì)濃度－抑制率圖Fig.5 Inhibitory ratio dependingonthe concentrationes of tanins

從圖4 中可看出，黃酮隨著抑制劑用量的增加，其抑制活性也不斷提高，當(dāng)達(dá)到2.000 mg/mL 時，黃酮抑制劑的用量已處于“飽和狀態(tài)”，其繼續(xù)增加無助于抑制活性的增強(qiáng)。并從圖求出最大半抑制濃度IC50=0.266 mg/mL。從圖5 可知，鞣質(zhì)隨著抑制劑用量的增加，其抑制活性也不斷提高，當(dāng)達(dá)到0.267 mg/mL 時，鞣質(zhì)抑制劑的用量已處于“飽和狀態(tài)”，其繼續(xù)增加無助于抑制活性的增強(qiáng)。并從圖中求出最大半抑制濃度IC50=8.13×10-2mg/mL。

3.5.2 溫度對抑制劑活性的影響

溫度對抑制劑活性的影響的結(jié)果見圖6。

圖6 溫度對抑制劑活性的影響Fig.6 Effect of temperature on inhibitory ratio of tannins and flavones

由圖6 發(fā)現(xiàn)黃酮的抑制活性不隨溫度的改變而發(fā)生變化，即使在100 ℃下仍有明顯的抑制活性，證明此抑制劑在30 ℃～100 ℃范圍內(nèi)穩(wěn)定。鞣質(zhì)的抑制活性在50 ℃以下穩(wěn)定，在50 ℃以上隨溫度的升高而降低，這是由于鞣質(zhì)對溫度不穩(wěn)定，在高溫下會使鞣質(zhì)嚴(yán)重氧化、降解或縮聚，從而影響其抑制效果。

3.5.3 抑制劑的抑制動力學(xué)試驗(yàn)

3.5.3.1 α－葡萄糖苷酶的抑制動力學(xué)試驗(yàn)

不同底物濃度時酶反應(yīng)A-t 曲線圖（λ=400 nm）如圖7 所示。根據(jù)圖7，以直線部分求各底物濃度下酶反應(yīng)速度，繪圖8 如下所示。

圖7 不同底物濃度時酶的A-t 曲線圖Fig.7 The absorb curves depending on time when different concentration of pNPG was hydrolyzed by a-glucosidase

圖8 底物濃度與酶反應(yīng)速度的關(guān)系Fig.8 The curves of reaction speed depending on the concentration of substrates

為求Km，首先根據(jù)[s]與V 求1/[s]與1/V，所得數(shù)值繪圖9。

圖9 α-葡萄糖苷酶的Lineweave-Burk 的雙倒數(shù)曲線Fig.9 Lineweaver-Burk curve of α-glucosidase

3.5.3.2 地榆中黃酮的抑制動力學(xué)試驗(yàn)

不同底物濃度地榆黃酮濃度分別為1.333、2.667 mg/mL 時的A-t 值分別如圖10、圖11 所示。

圖10 黃酮濃度為1.333 mg/mL 時的A-t 圖Fig.10 Absorb curves depending on time for different concentration of substrate when the concentration of flavone is 1.333 mg/mL

圖11 黃酮濃度為2.667 mg/mL 時的A-t 圖Fig.11 Absorb curves depending on time for different concentration of substrate when the concentration of flavone is 2.667 mg/mL

由圖9 所得線性方程y=7.764 3x+14.581 求出其在y軸上的截距為1/Vmax=14.581，則Vmax=0.068 6 OD/min，在x 軸上的截距為－1/Km=－1.878，Km=0.532 mmol/L。Km是酶催化反應(yīng)的一個重要常數(shù)，它反映底物和酶結(jié)合的親和力，Km 值越小，說明酶與底物的親合力越大。由圖10 和圖11，并以直線部分求速度，得出兩種抑制劑濃度下S-V 圖，如圖12。

圖12 兩種抑制劑濃度下S-V 圖Fig.12 Reaction speed depending on the concentrations of substrates under two concentrations of flavone

根據(jù)[s]與V 求1/[s]與1/V，由1/[s]與1/V 所得數(shù)值繪圖得圖13。

圖13 地榆黃酮的Lineweave—Burk 的雙倒數(shù)曲線Fig.13 Lineweaver-Burk curve of flavone

從圖中求得地榆黃酮濃度為1.333 mg/mL 時Km′＝9.09 mmol/L，濃度為2.667 mg/mL 時Km′=20.79 mmol/L，再根據(jù)α－葡萄糖苷酶的Km=0.532 mmol/L 和Vmax=0.068 6 OD/min，可求出黃酮濃度為1.333 mg/mL 時Ki=0.082 9 mg/mL，濃度為2.667 mg/mL 時Ki=0.070 1 mg/mL。由于實(shí)驗(yàn)中存在一些誤差，Ki并不完全相等，取兩個濃度下Ki的平均值，得黃酮的Ki=0.076 5 mg/mL。

3.5.3.3 地榆中鞣質(zhì)的抑制動力學(xué)試驗(yàn)

不同底物濃度，地榆鞣質(zhì)濃度分別為0.133 和0.400 mg/mL 時的A-t 值分別如圖14 和圖15 所示。

由圖14 和圖15，并以直線部分求速度，得出兩種抑制劑濃度下S-V 圖如下圖16。

根據(jù)[s]與V 求1/[s]與1/V，由1/[s]與1/V 所得數(shù)值繪圖得圖17。

從圖17 中求得鞣質(zhì)濃度為0.133 mg/mL 時Km′＝3.12 mmol/L，濃度為0.400 mg/mL 時Km′=6.73 mmol/L，再根據(jù)α—葡萄糖苷酶的Km= 0.532 mmol/L，Vmax=0.068 6 OD/min，可求出鞣質(zhì)濃度為0.133 mg/mL 時Ki=0.027 4 mg/mL，濃度為0.400 mg/mL，Ki=0.034 4 mg/mL。由于實(shí)驗(yàn)中存在一些誤差，取兩個濃度下Ki 不完全相等，取其平均值，得鞣質(zhì)的Ki=0.030 9 mg/mL。

圖14 鞣質(zhì)濃度為0.133 mg/mL 時A-tFig.14 Absorb curves depending on time under different concentration of substrate when the concentration of tanins is 0.133 mg/mL

圖15 鞣質(zhì)濃度為0.400 mg/mL 時A-tFig.15 Absorb curves depending on time under different concentration of substrate when the concentration of tanins is 0.400 mg/mL

圖16 兩種抑制劑濃度下S-V 圖Fig.16 Rreaction speed depending on the different concentrations of substrates under two concentrations of tanins

圖17 地榆鞣質(zhì)的Lineweave—Burk 的雙倒數(shù)曲線Fig.17 Lineweaver-Burk curve of tanins

4 結(jié)論與展望

1）地榆提取分離并部分純化后得到水溶性總物質(zhì)、多糖、鞣質(zhì)、皂甙和黃酮，其得率分別為1.45 %、1.27%、0.87%、0.88%、1.06%。

2）地榆黃酮和鞣質(zhì)是優(yōu)良的α-葡萄糖苷酶抑制劑，濃度均為0.400 mg/mL，它們的抑制率分別為75.10%和92.23%，而拜唐蘋2.667 mg/mL 時的抑制率68.51%，所以地榆提取物黃酮和鞣質(zhì)的α-葡萄糖苷酶抑制活性均明顯高于拜堂平。

3）黃酮和鞣質(zhì)的抑制效果均隨著抑制劑用量的增加而增加，其IC50分別為0.266mg/mL 和8.13×10-2mg/mL。黃酮抑制活性在30 ℃～100 ℃范圍內(nèi)穩(wěn)定；鞣質(zhì)的抑制活性在50 ℃以下穩(wěn)定，在50 ℃以上隨溫度的升高而降低。

4）黃酮和鞣質(zhì)的Ki分別為Ki=0.076 5 mg/mL 和0.030 9 mg/mL，它們均屬于競爭性抑制劑。

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