湯俊，胡征宇

（1.常熟理工學院生物與食品工程學院，江蘇常熟215500；2.中國科學院水生生物研究所，湖北武漢430072）

正常情況下，機體的抗氧化系統(tǒng)可以精確的調控自由基的產(chǎn)生和清除，使之處于動態(tài)平衡中，但很多因素，如輻射、污染以及機體健康狀態(tài)等都可以影響或打破這個平衡，使機體內的自由基過量積累而造成傷害，如引起脂質過氧化而改變生物膜結構及功能、損傷DNA、使蛋白質變性及酶活力喪失等，這些危害都直接或間接的導致了炎癥、衰老、心血管疾病及腫瘤的發(fā)生[1-2]。

研究證明，一些來源于高等植物或藻類的天然化合物，特別是天然多糖，具有優(yōu)良的抗氧化活性[3-4]，在預防心腦血管疾病、癌癥以及帕金森氏癥等神經(jīng)退行性疾病方面起著非常重要的作用，因此尋找新的安全、有效、經(jīng)濟的天然抗氧化劑成為人們關注的熱點[5-7]。

地木耳，學名為普通念珠藻（Nostoc commune），隸屬藍藻門念珠藻屬，是一種分布很廣的食用念珠藻。地木耳富含有多種人體所必需氨基酸、微量元素和維生素，而且蛋白質的含量高，具有很高的保健價值。本文采用體外清除超氧自由基、羥自由基、脂質自由基及對人胚腎細胞293 的超氧化歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）和谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）活性的影響等模型來評價其多糖的抗氧化活性，以期為地木耳的功用開發(fā)提供數(shù)據(jù)支持和理論參考。

1 材料與方法

1.1 多糖提取物的制備

地木耳藻體粉碎后用80%乙醇浸泡24 h，索氏提取器提取至浸出液無色。藻體懸于蒸餾水中，95 ℃水提3 h，收集上清液，濃縮后加乙醇得絮狀沉淀，離心收集并用乙醇和丙酮重復洗滌3 次，冷凍干燥，得多糖提取物。

1.2 清除超氧陰離子自由基

采用氮藍四唑還原法測定提取物對超氧自由基的清除作用。超氧自由基由還原性輔酶I/吩嗪硫酸甲酯體系產(chǎn)生[8]。反應體系：Tris-HCl 緩沖液（20 μmol/mL，pH 8.0）中，含有還原性輔酶I，吩嗪硫酸甲酯，氮藍四唑以及不同濃度的多糖提取物（2 μg/mL～40 μg/mL）。搖勻，室溫反應5 min，于560 nm 波長處測定吸光度值（A）并根據(jù)下列公式計算清除率。

清除率= [（A 對照－A 樣品）/A 對照]×100%

1.3 清除羥自由基活性測定

羥自由基由Fe3+/H2O2/脫氧核糖體系產(chǎn)生[9]。磷酸緩沖液（20 μmol/mL，pH 7.4）中，包含EDTA、FeCl3·6H2O、抗壞血酸、H2O2、脫氧核糖及不同濃度（6 μg/mL～30 μg/mL）的多糖溶液，37 ℃水浴1 h，加10%三氯乙酸及1%硫代巴比妥酸，沸水浴15 min，測定532 nm波長處吸光值，計算清除率。在不含EDTA 體系中，EDTA 由等體積的磷酸緩沖液代替[10]。

1.4 抑制蛋黃勻漿脂質過氧化活性

采用硫代巴比妥酸法測定[11]。以1.15%的氯化鉀稀釋成10%的蛋黃勻漿，現(xiàn)配現(xiàn)用。蛋黃勻漿與FeSO4（100 μmol/L），H2O（250 μmol/L）及不同濃度的提取物混勻，加蒸餾水調整體積至1 mL，37 ℃水浴1 h。然后加三氯乙酸（20%，pH 3.5）和硫代巴比妥酸（0.67%）各1.5 mL 并繼續(xù)水浴15 min。離心取上清液在532 nm處測定光吸收值，計算清除率。

1.5 人胚腎細胞293 抗氧化酶活力的測定

1.5.1 細胞存活率的測定

采用四甲基偶氮唑鹽（MTT）微量酶反應比色法測定細胞存活率[12]。人胚腎細胞293（HEK293）以4×104個/孔的密度接種于96 孔板，37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h 后加入不同濃度（0.5 μg/mL～30 μg/mL）的多糖提取物。繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h。在孵育的最后4 h，加入5 mg/mL 的MTT。孵育結束后，除去MTT 溶液，加入DMSO 以溶解形成的甲瓚顆粒，在570 nm 處測定光吸收值。

1.5.2 細胞SOD，CAT 和GPx 酶的制備及活力測定

將HEK293 細胞接種于細胞培養(yǎng)板。24 h 后，吸除培養(yǎng)液，加入含有不同濃度提取物（1、5、25 μg/mL）的新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育24 h。細胞經(jīng)胰酶消化、PBS 清洗，離心后用超聲波破碎，14 000 g 離心15 min 收集上清，采用試劑盒測定SOD，CAT 和GPx 的酶活力。

1.6 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)用Origin 7.0 處理，數(shù)據(jù)表示為平均值±標準差，P＜0.05 為差異顯著。

2 結果

2.1 清除超氧陰離子自由基

在輔酶I 和吩嗪硫酸甲酯體系產(chǎn)生的超氧陰離子自由基的清除實驗中，地木耳多糖提取物表現(xiàn)出顯著的清除超氧自由基的活性，并且隨濃度的升高清除作用增強見圖1。

圖1 地木耳及多糖提取物清除超氧陰離子自由基Fig.1 Superoxide radical scavenging effect of polysaccharide extracts from N.commune

由圖1 可知，在提取物濃度為6 μg/mL 處，清除作用有非常顯著的上升趨勢，清除率由2 μg/mL 處的3.9%上升到44.1%。隨后，隨著多糖濃度的升高，清除活性呈現(xiàn)緩慢增強的趨勢，在40 μg/mL 時，清除作用達到53.9%。

2.2 清除羥自由基

地木耳多糖提取物清除不同體系產(chǎn)生的羥自由基，見圖2。

圖2 地木耳多糖提取物清除不同體系產(chǎn)生的羥自由基Fig.2 Scavenging effect of polysaccharide extract of N.commune on hydroxyl radical generated in different systems

如圖2 所示，地木耳多糖提取物對兩個體系產(chǎn)生的羥自由基均具有清除作用且呈現(xiàn)量效關系，最高清除率分別為30 μg/mL 濃度處的23.5%和24.2%。但在6 μg/mL～18 μg/mL 濃度范圍內，地木耳多糖提取物對非特異體系產(chǎn)生的羥自由基清除活性明顯高于特異體系。

2.3 抑制脂質過氧化

地木耳多糖提取物抑制脂質過氧化，見圖3。

圖3 地木耳多糖提取物抑制脂質過氧化Fig.3 Inhibition effect on lipid peroxidation of polysaccharide extracts from N.commune

圖3 顯示，地木耳多糖提取物對蛋黃勻漿作為介質的脂質過氧化有較顯著的抑制作用。在10 μg/mL的濃度下，脂質過氧化抑制率為3.7%，作用不顯著。但隨提取物濃度的升高，清除率顯著增強，在100 μg/mL的最高測試濃度下，清除率達到17.4%。

2.4 HEK293 細胞存活率的測定

細胞和不同濃度的多糖提取物共同孵育24、48、72 h，將對照組光吸收值設定為100%，測定細胞存活率，見圖4。

圖4 地木耳多糖提取物對人胚腎細胞293 存活率的影響Fig.4 Effect of N.commune polysaccharide extract on the viability of HEK 293cells

如圖4 所示，存活率無顯著差異，說明提取物對HEK293 細胞沒有細胞毒性作用。

2.5 酶活力測定

酶活力測定，見表1。

由表1 可以看出，在1 μg/mL 濃度處，多糖提取物對SOD、CAT、GPx 的酶活力增強作用微弱，但是隨著多糖濃度的升高，提取物對酶活力表現(xiàn)出顯著的增強作用。 SOD 酶活力在5 μg/mL 濃度處提升最大，為18.9%。CAT 和GPx 的酶活力均在25 μg/mL 濃度處得到最大提高，提高率分別達到31.9%、39.6%。結果表明，地木耳多糖提取物對GPx 和CAT 的酶活力影響要高于對SOD 酶活力的影響。

表1 地木耳多糖提取物對HEK293 細胞超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）酶活力的影響Table 1 Effect of N.commune extract on the activities of SOD，CAT and GPx in HEK 293 cells

3 分析與討論

自從提出衰老的自由基學說以來，大量的研究發(fā)現(xiàn)人類的許多疾病都與機體的自由基氧化損傷有關[13]。在尋找抗氧劑的過程中，人們發(fā)現(xiàn)微量元素、維生素、中草藥、食品的有效成分等均具有清除自由基的作用，而抗氧化多糖因其低毒、安全、來源廣等特點備受關注[14-15]。研究發(fā)現(xiàn)，多糖的抗氧化活性可能是多糖抗腫瘤、抗病毒、抗感染、抗炎癥等其他活性的作用機理之一[16-17]。

超氧陰離子自由基和羥自由基是最具代表性的活性氧自由基。在機體的氧化反應中，超氧陰離子自由基通常最先形成，其本身活性較弱，但可通過形成其他多種有破壞作用的自由基而使其功能放大。羥自由基是毒性最強的自由基，它幾乎能與所有的功能性生物大分子起反應，造成生物體的巨大傷害，例如攻擊膜質，引發(fā)脂質過氧化[18-19]。脂質過氧化則是由于不飽和脂肪酸鏈的氫被抽掉而引發(fā)的特征性鏈式反應，是導致細胞膜損傷的主要原因。

本實驗結果表明，地木耳多糖提取物能有效的清除超氧自由基、羥自由基、抑制蛋黃勻漿過氧化反應，還可顯著提高抗氧化酶的活性。

羥自由基的清除活性測定，一般采用位點特異和非特異兩個體系。地木耳多糖提取物對位點特異體系產(chǎn)生的羥自由基的清除活性高于非特異體系，分析其原因，可能是由于位點非特異體系中有EDTA 的存在，對體系中的二價鐵離起到螯合作用，使羥自由基的產(chǎn)生受到限制。而在位點特異體系中，EDTA 被磷酸緩沖液代替，自由基的生成和提取物對金屬離子及對自由基的清除作用都不會受到限制，因而清除率要高于非特異體系。

SOD、CAT 和GPx 是生物體抗氧化酶系統(tǒng)中非常重要的三種酶。一般情況下，它們參與并介導自由基的產(chǎn)生與淬滅，維持體內自由基的正常代謝水平[20]。SOD 催化超氧陰離子發(fā)生歧化反應，生成H2O2，而H2O2和其它內源及外源的過氧化物又可被CAT 和GPx 進一步清除。實驗結果表明，地木耳多糖提取物可顯著提高三種抗氧化酶的活性，有效的降低細胞所受到的自由基的危害。

黃澤波等對念珠藻多糖組分及結構進行了研究并發(fā)現(xiàn)，地木耳多糖含有半乳糖、葡萄糖、木糖、海藻糖等組分[21]。這些單糖都是有效的還原劑，其抗氧化作用可能與其組分的還原性質有關。

綜上所述，地木耳多糖提取物抗氧化活性顯著，可以作為天然抗氧化劑的優(yōu)良來源。

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