張 輝，崔煥忠，鄭 鑫

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春130118）

單核細(xì)胞增生性李斯特菌（Listeriamonocytogenes，LM）是重要的人獸共患食源性病原菌，可引起人、多種動(dòng)物感染發(fā)病，病死率高達(dá)20%～30%。近年來(lái)，李斯特菌病在世界范圍內(nèi)都有發(fā)生，并且發(fā)病具有上升趨勢(shì)。由于該菌在自然界中廣泛存在，并可形成生物被膜，增強(qiáng)了該菌對(duì)外界環(huán)境的抵抗力。李斯特菌病的發(fā)生80%是由生物被膜引起，由于生物被膜的多重耐藥性，給臨床治療帶來(lái)巨大困難［1］，嚴(yán)重的危害了人們健康，影響畜牧業(yè)發(fā)展。深入了解生物被膜形成調(diào)控機(jī)制，將有助于尋找生物被膜形成的抑制劑，降低人和動(dòng)物感染發(fā)病的幾率［2］。

生物被膜（biofilm，簡(jiǎn)稱(chēng)BF）的概念最初是由加拿大微生物學(xué)家J.William Costerton提出來(lái)的，是指細(xì)菌粘附于接觸表面，分泌胞外多聚物，將自身包繞而形成的微生物群落。細(xì)菌生物被膜形成及成熟過(guò)程涉及復(fù)雜的細(xì)胞間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，目前證實(shí)有3種信號(hào)分子參與機(jī)制的調(diào)節(jié)。革蘭陰性菌具有?；呓z氨酸內(nèi)酯自身誘導(dǎo)劑，革蘭陽(yáng)性菌和革蘭陰性菌均具有自身誘導(dǎo)劑2（Autoinducer－2，AI－2），AI－2是惟一一個(gè)在革蘭陽(yáng)性菌與陰性菌中同時(shí)存在的群感效應(yīng)系統(tǒng)，而革蘭陽(yáng)性菌則利用縮氨酸介導(dǎo)的信號(hào)通路進(jìn)行信號(hào)調(diào)節(jié)［3］。

1 正向調(diào)控機(jī)制

1.1 轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子PrfA對(duì)生物被膜形成的調(diào)控PrfA是正向調(diào)控生物被膜形成的因子之一。研究發(fā)現(xiàn)與野生型菌株EGD相比，PrfA基因突變菌株（ΔPrfA）形成生物被膜的能力明顯降低，倒置顯微鏡下觀察到EGD株能形成致密的鏈網(wǎng)狀膜結(jié)構(gòu)，交聯(lián)度較高，而ΔPrfA株形成的鏈網(wǎng)狀膜結(jié)構(gòu)相對(duì)比較疏松，交聯(lián)度稍低。統(tǒng)計(jì)分析表明，EGD株與無(wú)害李斯特菌之間形成生物被膜的差異顯著。而無(wú)害李斯特菌幾乎沒(méi)有成型的鏈網(wǎng)狀膜結(jié)構(gòu)形成，暗示生物被膜的形成可能與LM的致病性有關(guān)［4］。

PrfA蛋白是轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子CRP－FNR家族的成員之一，小分子輔助因子調(diào)控許多家族成員蛋白的活性狀態(tài)［5］。利用點(diǎn)突變構(gòu)建兩個(gè)基因突變菌株，研究其對(duì)生物被膜形成的影響。在基因突變菌株prfA＊中，變異PrfA蛋白的功能被限定在細(xì)胞內(nèi)活力狀態(tài)，即在宿主細(xì)胞漿內(nèi)能夠持續(xù)表達(dá)毒力因子ActA蛋白，并可通過(guò)激活PplcA，增加PrfA蛋白的表達(dá)；而在基因突變菌株P(guān)rfA（Y154C）中，變異的PrfA蛋白不能完全轉(zhuǎn)變?yōu)榘麅?nèi)活力狀態(tài)，即在胞內(nèi)感染階段不能正向調(diào)控ActA蛋白表達(dá)，雖然可以進(jìn)入宿主細(xì)胞漿但是不能完成細(xì)胞間的擴(kuò)散。prfA＊在室溫和30℃下形成的生物被膜量與野生型相同，但是在36℃下比野生型要少。PrfA（Y154C）在30℃和36℃下形成生物被膜的量均增加，但是在室溫下與野生型菌相同。不能完全轉(zhuǎn)變?yōu)榘麅?nèi)活力狀態(tài)的突變菌株有利于生物被膜的形成，生物被膜形成能力的增加可能是由于PrfA蛋白變構(gòu)調(diào)節(jié)的結(jié)果［4］。

1.2 DegU LM具有17個(gè)編碼二組分系統(tǒng)的基因簇，枯草桿菌DegS/DegU系統(tǒng)在控制細(xì)菌靜止期適應(yīng)性反應(yīng)方面起著重要作用［6］。研究表明LM不存在DegS激酶的同源基因，但具有DegU（降解酶調(diào)節(jié)因子）反應(yīng)調(diào)節(jié)同系物，DegU作為孤立的反應(yīng)調(diào)節(jié)器，在調(diào)控細(xì)菌一些重要的適應(yīng)性反應(yīng)方面發(fā)揮著重要的作用［7］。滅活DegU基因表明，DegU通過(guò)直接與DegU基因啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合，從而負(fù)調(diào)控自身合成。DegU基因與其下游的yviA基因共轉(zhuǎn)錄。DegU為L(zhǎng)M鞭毛合成及細(xì)菌運(yùn)動(dòng)性所必需，也是細(xì)菌在高溫條件下生長(zhǎng)，粘附到塑料表面并有效形成生物被膜所需要的因子［8］。

1.3 Agr操縱子 Agr操縱子可以調(diào)控毒力因子的表達(dá)，并與生物被膜的形成相關(guān)。Agr操縱子為L(zhǎng)M的群感效應(yīng)系統(tǒng)，正向調(diào)控生物被膜的形成［9］。Agr操縱子包括agrB、agrD、agrC和agrA四個(gè)因子，Aurélie等分別構(gòu)建了agrA和agrD框內(nèi)缺失菌株，研究了Agr操縱子對(duì)生物被膜形成的影響，結(jié)果表明，基因缺失菌株ΔagrA和ΔagrD對(duì)玻璃片的粘附能力均顯著降低，表明Agr操縱子參與生物被膜形成的粘附過(guò)程。在生物被膜形成的早期，突變體ΔagrA和ΔagrD在聚苯乙烯上形成生物被膜的能力明顯低于親本菌株［10］。agrA和agrD雙基因缺失菌株對(duì)靜止或動(dòng)態(tài)培養(yǎng)LM生物被膜的形成都有影響。Agr操縱子可以直接調(diào)控生物被膜形成，還可通過(guò)調(diào)控LM毒力因子的表達(dá)間接調(diào)生物被膜形成［11］。

1.4 其他正向調(diào)控因子 壓力調(diào)控因子sigma B與LM生物被膜的形成有關(guān)，張強(qiáng)等比較了EGD、基因缺失菌株Δsigma B以及無(wú)害李斯特菌生物被膜的形成能力，結(jié)果表明3種菌株形成生物被膜的能力具有一定的差異，暗示sigma B對(duì)生物被膜的形成具有一定的影響［12］。

LM的胞外DNA是細(xì)菌最初粘附和生物被膜形成的必要物質(zhì)，胞外DNA通過(guò)某種特定的方式與肽聚糖的N－乙酰葡萄糖氨相互作用，參與生物被膜形成的粘附過(guò)程，這種粘附過(guò)程需要高分子質(zhì)量的DNA參與，而且細(xì)菌表面的粘附位點(diǎn)可以被DNA 飽和［13］。

LM需要借助鞭毛的趨化運(yùn)動(dòng)使浮游的細(xì)菌向有營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的表面游動(dòng)，并克服表面張力到達(dá)并粘附到物體表面，使粘附的細(xì)菌個(gè)體從載體表面播散出去，與細(xì)菌的胞外基質(zhì)相互作用，在生物被膜中起橋梁作用，形成穩(wěn)定生物被膜結(jié)構(gòu)［14－15］。

2 負(fù)向分子調(diào)控機(jī)制

2.1 ABC轉(zhuǎn)輸通透酶對(duì)生物被膜形成的調(diào)控Zhu等采用轉(zhuǎn)座子誘變構(gòu)建基因缺失菌株，該基因缺失菌株Δ1771形成生物被膜能力增強(qiáng)，lm.G_1771基因可能編碼ABC轉(zhuǎn)運(yùn)通透酶，表明ABC轉(zhuǎn)輸通透酶負(fù)調(diào)控生物被膜的形成［16］。轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究表明，lm.G_1771基因通過(guò)調(diào)節(jié)編碼Dlt表面蛋白、細(xì)胞表面錨定蛋白SrtA以及轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子GntR等參與生物被膜形成的候選基因來(lái)調(diào)控生物被膜的形成。基因缺失菌株Δ1771對(duì)曲拉通－100敏感性和陽(yáng)離子抗生素增加。dlt基因參與將丙氨酸殘基合并為脂磷壁酸過(guò)程，由于基因缺失菌株Δ1771中Dlt操縱子基因的下調(diào)，導(dǎo)致磷壁酸表面帶正電荷，使突變菌株對(duì)陽(yáng)離子抗生素的抵抗力降低［17］。通過(guò)同源重組獲得的回復(fù)體形成生物被膜的量與野生型菌株相同。

2.2 luxS對(duì)生物被膜形成的調(diào)控luxS基因編碼S－核糖基高半胱氨酸酶，該酶可將S－核糖基高半胱氨酸（S－ribosyl homocysteine，SRH）催化水解為高半胱氨酸和4，5－二羥基－2，3－戊二酮（DPD），DPD經(jīng)過(guò)化學(xué)修飾形成自身誘導(dǎo)物－2（AI－2），AI－2是細(xì)菌種間信息傳遞的因子。luxS參與多種致病菌生物被膜的形成［18］。研究發(fā)現(xiàn)，luxS基因缺失菌株的粘附能力比親本菌株高19倍，并且形成生物被膜的量也相應(yīng)增加。但是外源的AI－2不能使突變菌株恢復(fù)野生型表型，推斷l(xiāng)uxS基因可能通過(guò)三維復(fù)合構(gòu)造參與抑制細(xì)胞粘附及生物被膜的形成過(guò)程，這一調(diào)控機(jī)制與可能 AI－2無(wú)關(guān)。Challan等［19］通過(guò)比較luxS基因缺失菌株與EDG株之間的浮游生長(zhǎng)、浮游運(yùn)動(dòng)性、磷脂酶活性、溶血活性以及生物被膜形成的差異，研究luxS對(duì)生物被膜形成的調(diào)控，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，連續(xù)培養(yǎng)48h，luxS基因缺失菌株形成生物被膜的密度比野生型菌株EDG高17倍，并且在細(xì)菌培養(yǎng)上清液中S－腺苷高半胱氨酸（S－adenosyl homocysteine，SAH）和SRH的含量均高于親本菌株，并證實(shí)了生物被膜的形成與AI－2和SAH無(wú)關(guān)，而是通過(guò)SRH調(diào)節(jié)粘附細(xì)胞的數(shù)量，調(diào)控生物被膜的形成，但是其確切調(diào)控機(jī)制尚不清楚。

3 理化因素對(duì)生物被膜形成的影響

生物被膜的形成受營(yíng)養(yǎng)條件、溫度、生長(zhǎng)環(huán)境及粘附材料種類(lèi)等因素的影響［20］。Begley等［21］發(fā)現(xiàn)，在膽汁的存在下，細(xì)菌通過(guò)調(diào)整多種代謝途徑來(lái)加快其生長(zhǎng)速度，增強(qiáng)生物被膜的形成能力。劉彤等［22］研究了溫度對(duì)生物被膜形成的影響，結(jié)果表明，隨著培養(yǎng)溫度下降生物被膜形成顯著減少。添加適量的葡萄糖可以提高形成生物被膜的能力，表明富含營(yíng)養(yǎng)的環(huán)境有利于LM形成生物被膜［23］。低濃度的NaCl（低于0.5%）可促進(jìn)生物被膜的形成，高濃度NaCl則會(huì)抑制生物被膜的形成。

4 問(wèn)題與展望

生物被膜的形成受調(diào)控因子的調(diào)控，目前對(duì)LM生物被膜形成相關(guān)調(diào)控因子的研究，主要是發(fā)現(xiàn)未知的與生物被膜形成相關(guān)的基因以及驗(yàn)證一些已知功能基因在其生物被膜形成中的作用［24］。而有關(guān)調(diào)控生物被膜形成的確切分子機(jī)制以及生物被膜分子間信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面的研究還不是非常深入，因此今后研究方向應(yīng)集中于生物膜形成分子調(diào)節(jié)機(jī)制、相關(guān)基因之間的表達(dá)調(diào)控，以及一些控制技術(shù)領(lǐng)域。詳細(xì)了解生物被膜形成的機(jī)制，對(duì)于尋找生物被膜形成抑制劑，以及有效地控制生物被膜的形成具有重要意義。

［1］ de la Fuente－Nú?ez C，Korolik V，Bains M，etal.Inhibition of bacterial biofilm formation and swarming motility by a small synthetic cationic peptide［J］.Antimicrob Agents Chemother.2012Feb 21.［Epub ahead of print］.

［2］ Marsh E J，Luo H，Wang H.A three－tiered approach to differentiateListeriamonocytogenesbiofilm－forming abilities［J］.FEMS Microbiol Lett，2003，228（2）：203－210.

［3］ 陳偉.細(xì)菌QS系統(tǒng)LuxS功能研究進(jìn)展［J］.中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2011，30（7）：120－123.

［4］ Lemon K P，F(xiàn)reitag N E，Kolter R.The virulence regulator PrfA promotes biofilm formation byListeriamonocytogenes［J］.J Bacteriol，2010，192（15）：3969－3676.

［5］ Korner H，Sofia H J，Zumft W G.Phylogeny of the bacterial superfamily of Crp－Fnr transcription regulators：exploiting the metabolic spectrum by controlling alternative gene programs［J］.FEMS Microbiol Rev，2003，27（5）：559－592.

［6］ Gueriri I，Cyncynatus C，Dubrac S，etal.The DegU orphan response regulator ofListeriamonocytogenesautorepresses its own synthesis and is required for bacterial motility，virulence and biofilm formation［J］.Microbiology，2008，154（8）：2251－2264.

［7］ Knudsen G M，Olsen J E，Dons L.Characterization of DegU，a response regulator inListeriamonocytogenes，involved in regulation of motility and contributes to virulence［J］.FEMS Microbiol Lett，2004，240（2）：171－179.

［8］ Murray E J，Kiley T B，Stanley－Walln R.A pivotal role for the response regulato－r DegU in controlling multicellular be－h(huán)aviour［J］.Microbiology，2009，155（Pt1）：1－8.

［9］ Garmyn D，Gal L，Lemaitre J P，etal.Communication and auto－induction in the speciesListeriamonocytogenes：A central role for the agr system［J］.Commun Integr Biol，2009，2（4）：371－374.

［10］Aurélie R，Stéphanie W，Dominique G，etal.Agr system ofListeriamonocytogenesEGDe：role in adherence and differential expression pattern［J］.Appl Environ Microbiol，2007，73（19）：6125－6133.

［11］Reidel C U，Monk I R，Casey P G，etal.AgrD－dependent quo－rum sensing affects biofilm formation，invasion，virulence and global gene expression profiles inListeriamonocytogenes［J］.Mol Microbiol，2009，71（5）：1177－1189.

［12］Ollinger J，Bowen B，Wiedmann M，etal.Listeriamonocytogenessigma B modulates PrfA－mediated virulence factor expression［J］.Infect Immun，2009，77（5）：2113－2124.

［13］Harmsen M，Lappann M，Kn?chel S，etal.Role of Extracellular DNA during Biofilm Formation byListeriamonocytogenes［J］.Appl Environ Microbiol，2010，76（7）：2271－2279.

［14］Todhanakasem T，Young G M.Loss of flagellum－based motility byListeriamonocytogenesresults in formation of hyperbiofilms［J］.J Bacteriol，2008，190（17）：6030－6034.

［15］Lemon K P，Higgins D E，Kolter R.Flagellar motility is critical forListeriamonocytogenesbiofilm formation［J］.J Bacteriol，2007，189（12）：4418－4424.

［16］Xinna Zhu，Weibing Liu，RenéLametsch，etal.A putative ABC transporter ofListeriamonocytogenes：role in biofilm formation and differential expression profiles by proteomic and microarray［J］.Abstracts of Food Summit in China 2009 ＆6th Annual Meeting of CIFST，2009，819－823.

［17］Xinna Zhu，F(xiàn)ei Long，Yonghui Chen，etal.A putative ABC transporter is involved in negative regulation of biofilm formation byListeriamonocytogenes［J］.Appl Environ Microbiol，2008，74（24）：7675－7683.

［18］Sela S，F(xiàn)rank S，Belausov E，etal.A mutation in the luxS gene influencesListeriamonocytogenesbiofilm formation［J］.Appl Environ Microbiol，2006，72（8）：5653－5658.

［19］Challan B S，Gal L，Margiewes S，etal.Assessment of the roles of LuxS，S－ribosyl homocysteine，and autoinducer 2in cell attachment during biofilm formation byListeriamonocytogenesEGD－e［J］.Appl Environ Microbiol，2006，72（4）：2644－2650.

［20］Pan Y，Breidt F J，Gorski L.Synergistic effects of sodium chloride，glucose，and temperature on biofilm formation byListeriamonocytogenesserotype 1/2aand 4bstrains［J］.Appl Environ Microbiol，2010，76（5）：1433－1441.

［21］Begley M，Kerr C，Hill C.Exposure to bile influences biofilm formation byListeriamonocytogenes［J］.Gut Pathogens，2009，1（1）：11－14.

［22］劉彤，陳晶瑜，韓北忠，等.單核增生李斯特氏菌生物被膜的形成及控制 ［J］.食品研究與開(kāi)發(fā)，2010，31（2）：163－166.

［23］李燕杰，朱小花，夏雨.不同培養(yǎng)條件對(duì)單增李斯特菌生物被膜形成的影響研究［J］.食品研究與開(kāi)發(fā)，2010，31（11）：188－192.

［24］Chang Y，Gu W，F(xiàn)ischer N，etal.Identification of genes involved inListeriamonocytogenesbiofilm formation by marinerbased transposon mutagenesis［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2012，93（5）：2051－2062.