任學(xué)良

（煙草行業(yè)分子遺傳重點實驗室，貴州省煙草科學(xué)研究院，貴陽 550081）

優(yōu)良推廣品種的利用價值取決于其攜帶的優(yōu)異基因，通過基因組差異研究可提供這些優(yōu)異基因最基本的遺傳信息，有助于加快其研究、利用。為此，在中國煙草總公司和貴州省局（公司）的資助下，由貴州省煙草科學(xué)研究院牽頭，聯(lián)合行業(yè)內(nèi)外多個單位實施的煙草主要品種和核心種質(zhì)資源基因組差異研究工作，對100年來中國和美國育成的具有明確系譜關(guān)系的主要栽培品種進(jìn)行了基因組測序，圍繞基因組結(jié)構(gòu)變異揭示育種目標(biāo)這一核心主題，取得了顯著進(jìn)展。

1 開發(fā)出一批高質(zhì)量SNP和Indel位點

基于Hiseq2000測序平臺，對42份煙草主要栽培品種進(jìn)行了基因組測序，質(zhì)量控制和序列過濾后，總共獲得了4853.7 Gb的高質(zhì)量數(shù)據(jù)，平均每份材料133.4 G，平均覆蓋29.1倍，GC含量在37%～39%。K-mer分析表明，42份栽培品種基因組的平均大小為4.30 Gb。

以BWA軟件為序列比對工具，把42份材料的429億條序列定位到參考序列紅花大金元基因組上，占總序列數(shù)的96.17%，平均每份材料約11.6億條。以samtools為檢測工具，總計在42份材料中檢測到6,429,601個SNP和831,597個Indel位點。進(jìn)一步過濾后，分別獲得3,334,065和297,781個高質(zhì)量SNP（單核苷酸多態(tài)性）和Indel（插入缺失）位點。以參考序列大小為4.5 Gb計，栽培煙草SNP和Indel的基因組密度分別在0.074%～0.143%和0.0066%～0.0185%，低于番茄的SNP密度(0.194%-0.265%）[1]。這些SNP的鑒定，為繪制煙草高密度遺傳圖譜和開發(fā)煙草高密度SNP芯片提供了基礎(chǔ)。

對SNP和Indel的位點注釋發(fā)現(xiàn)，有150,076個SNP/Indel落在19,874個基因內(nèi)，占檢測總SNP/Indel的2.3%。Ka/Ks（非同義SNP數(shù)與同義SNP數(shù)的比值）為1.6，表明遺傳群體基因受到強(qiáng)烈正選擇。

2 繪制了煙屬物種第一張單倍體型草圖

基于發(fā)現(xiàn)的高質(zhì)量SNP位點，利用Haploview分析軟件，繪制了含有26,727個單倍型塊、覆蓋基因組46.6%的栽培煙草單倍體型草圖，初步統(tǒng)計測序材料的LD（連鎖不平衡）值超過1 Mb。通過檢測到的Tag SNPs（標(biāo)簽單核苷酸多態(tài)性），結(jié)合LD值表明，栽培煙草覆蓋整個基因組的遺傳圖譜或關(guān)聯(lián)分析至少需要8萬個SNP標(biāo)記。煙草單倍型草圖與即將完成的栽培煙草序列圖一起，使栽培煙草的基因組研究在總體框架上接近水稻、玉米等主要農(nóng)作物的水平，為高效開展煙草分子育種奠定了堅實基礎(chǔ)。

3 發(fā)現(xiàn)了高度影響煙草遺傳多樣性的基因組區(qū)段

PAC（主成分）和NJ（鄰接法）系統(tǒng)樹分析將測序的42份材料分為兩組，任意測序材料基因組間的SNP數(shù)目范圍在153,344和1,820,841之間，平均為889,300。測序材料的π值（序列多樣性)為0.00015，遠(yuǎn)小于秈稻（0.0016）和粳稻（0.0006）[2]。

雖然測序材料的遺傳多樣性總體上比較低，但序列多樣性在基因組上分布不均勻，存在遺傳多樣性非常高的區(qū)段。以總體序列多樣性估計值的10倍，0.0015為閾值，總共找到879個高變異區(qū)段，這879個高變異區(qū)段屬于93個scaffolds，雖然大小只有190 Mb，卻包含了100多萬個SNP位點，解釋了約66%的群體遺傳多樣性，表明這些區(qū)段對于煙草育種具有極端重要性。

4 確定了1604個育種選擇重要基因

群體的FST（總體差異水平）值估計為0.118，在p=0.05水平下，通過FST檢驗一共找到1635個表現(xiàn)出群體差異的區(qū)段，包含了4098個預(yù)測基因，其中有3659個來自上述的93個scaffolds（占總發(fā)現(xiàn)基因的64.1%）。這些基因中1604個存在有義等位突變，其中約400個與物質(zhì)代謝相關(guān)，350個與逆境、病蟲害抗性相關(guān)，深入研究和不斷選擇這些基因?qū)煵萦N具有重要意義。

5 追溯了栽培煙草基因組依系譜關(guān)系的選擇歷程

利用檢測的334萬個高質(zhì)量SNP標(biāo)記，采用IDB（來源同一）法，分析了從最早的Orinoco品種到最近的云煙97具有系譜關(guān)系的6代品種近百年育種進(jìn)程中基因組發(fā)生的變化。研究發(fā)現(xiàn)，育成品種基因組的親本來源比例各代分別為39.87%、23.07%、20.43%、9.80%、9.37%和4.80%。除前兩代外，其他代基因組親本來源的平均比例都高于理論值（理論比例分別為50.00%、25.00%、12.50%、6.25%、3.13%和1.56%）。此外，分析發(fā)現(xiàn)，子代約8.5%的基因組為非雙親基因組，從基因組水平揭示了雜交重組創(chuàng)造變異的深刻機(jī)制。這些是基于煙草結(jié)構(gòu)基因組研究取得的重要科學(xué)發(fā)現(xiàn)，將為通過分子育種手段選擇優(yōu)良品種提供理論支持。

[1]Shirasawa K, Fukuoka H, Matsunaga H, et al.Genome-wide association studies using single nucleotide polymorphism markers developed by re-sequencing of the genomes of cultivated tomato[J].DNA Res, 2013, dst033v1-dst033.

[2]Huang X, Kurata N, Wei X, et al.A map of rice genome variation reveals the origin of cultivated rice[J].Nature, 2012, 490:497-501.