裴志花，曲桂娟，馬紅霞，王 開(kāi)

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春130118）

多殺性巴氏桿菌（Pm）是有莢膜的革蘭陰性短桿菌，可感染多種動(dòng)物并引起發(fā)病，如禽霍亂、豬萎縮性鼻炎、牛和水牛的出血性敗血癥、牛羊的地方流行性肺炎、兔鼻炎以及由于貓狗咬傷導(dǎo)致的人傷口膿腫和腦膜炎等。

根據(jù)Pm莢膜和脂多糖的不同，可將Pm分為A、B、D、E和F 5個(gè)血清群16個(gè)血清型。不同的血清群和血清型引起的疾病不同，如禽霍亂通常由A：1型和A：3型引起，出血性敗血癥主要由B：2型或E：5型引起，豬萎縮性鼻炎主要由產(chǎn)毒素的D型引起。Pm是很多哺乳動(dòng)物體內(nèi)普遍存在的條件性致病菌，本病的發(fā)生，源于宿主自身?xiàng)l件（物種、年齡、免疫水平）和細(xì)菌毒力因子（脂多糖、莢膜、黏附素、外膜蛋白等）相互作用的結(jié)果。

1 Pm外膜蛋白及其分類

1.1 Pm外膜蛋白 外膜蛋白（outer manbrance proteins，OMPs）是外膜中鑲嵌的多種蛋白質(zhì)的總稱。這些蛋白位于Pm和宿主細(xì)胞的接觸面上，其功能受到各種選擇壓力的影響，OMPs能從不同程度展示不同菌株間的變化，常用來(lái)評(píng)定菌株間的差異，從而確定與流行病學(xué)的關(guān)聯(lián)［1］。Pm外膜蛋白作為一種選擇性屏障，可以阻止多種有毒分子進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞，這是細(xì)菌在多種環(huán)境下得以生存的根本保障。此外，外膜蛋白還有很多其他作用，如菌體細(xì)胞養(yǎng)分的吸收、運(yùn)輸分子進(jìn)出菌體細(xì)胞、與宿主細(xì)胞的黏附等，在細(xì)菌對(duì)宿主的感染和致病過(guò)程中起著重要作用。

1.2 Pm外膜蛋白分類 Pm外膜蛋白的構(gòu)成很復(fù)雜，根據(jù)外膜蛋白在細(xì)胞內(nèi)的拷貝數(shù)不同，可分為主要蛋白和微量蛋白，主要蛋白在細(xì)胞內(nèi)的拷貝數(shù)可達(dá)2×105左右，包括外膜蛋白H（OMPH）、外膜蛋白A（OMPA）、鐵調(diào)節(jié)蛋白等。微量蛋白種類很多，在細(xì)胞內(nèi)的拷貝數(shù)為103～104。根據(jù)外膜蛋白的功能不同可分為結(jié)構(gòu)蛋白、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、結(jié)合蛋白、黏附素、蛋白質(zhì)組裝器、膜相關(guān)酶等。根據(jù)外膜蛋白的結(jié)構(gòu)特征不同可分為：小β－桶膜錨蛋白、非特異性孔蛋白、特異性通道蛋白、能量依賴性運(yùn)輸通道蛋白、蛋白質(zhì)分泌孔蛋白、外膜引導(dǎo)蛋白、蛋白質(zhì)造孔毒素等。另外，OMPs的數(shù)量及種類也因菌株和培養(yǎng)條件的不同而有所不同。

2 Pm外膜蛋白的主要功能群

2.1 結(jié)構(gòu)蛋白 Pm具有代表性的結(jié)構(gòu)蛋白主要包括即外膜蛋白A（OMPA）和肽聚糖相關(guān)脂蛋白兩大類。

2.1.1 OMPA 蛋白 OMPA 蛋白屬于小β－桶膜錨蛋白，連接著細(xì)菌外膜和肽聚糖。Pm OMPA在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的拷貝數(shù)可達(dá)到105，其表達(dá)嚴(yán)格受轉(zhuǎn)錄后水平控制。OMPA蛋白的主要功能包括：（1）細(xì)胞穩(wěn)定劑的作用。OMPA蛋白通過(guò)它的C－末端與肽聚糖的相互作用來(lái)穩(wěn)定細(xì)胞結(jié)構(gòu)，并參與生物膜的生成。（2）免疫保護(hù)作用。OMPA蛋白具有較強(qiáng)的免疫保護(hù)作用，能誘導(dǎo)體液免疫和細(xì)胞免疫，能夠輔助其他抗原內(nèi)化和交叉提呈，具有潛在的免疫載體功能。免疫學(xué)分析顯示，體內(nèi)和體外表達(dá)的OMPA蛋白均有免疫原性［2］。（3）介導(dǎo)Pm對(duì)宿主細(xì)胞的黏附和侵襲作用。啟動(dòng)感染過(guò)程。另外，OMPA蛋白還是一種免疫靶標(biāo)，參與免疫逃避。

2.1.2 肽聚糖相關(guān)脂蛋白 肽聚糖相關(guān)脂蛋白主要包括肽聚糖相關(guān)脂蛋白交叉反應(yīng)蛋白（peptidoglycan－associated lipoprotein cross－reacting protein，PCP）和P6樣蛋白兩種。

Pm PCP是一種大小為15.6kDa的脂蛋白，與流感嗜血桿菌PCP具有80%的序列相似性，是血清殺菌活性的靶標(biāo)。PCP與大腸桿菌及多食醋弧菌屬的外膜脂蛋白SlyB蛋白具有相似性。Lo等采用體內(nèi)表達(dá)技術(shù)將Pm PCP編碼基因篩選出來(lái)，命名為Pm0554，經(jīng)證實(shí)該蛋白在細(xì)菌感染過(guò)程中表達(dá)。用PCP重組疫苗及大腸桿菌系統(tǒng)表達(dá)、純化的PCP蛋白免疫雞和鼠，都不能誘導(dǎo)產(chǎn)生針對(duì)同源Pm攻擊的保護(hù)力。P6樣蛋白，因其編碼基因與流感嗜血桿菌的P6外膜蛋白基因具有高度同源性而得名。研究發(fā)現(xiàn)，兔源Pm P6樣蛋白具有抗原性，能誘導(dǎo)禽類產(chǎn)生高滴度抗體，但不能保護(hù)它們免受巴氏桿菌感染。P6樣蛋白基因非常保守，雜交試驗(yàn)顯示，16種血清型的Pm均存在該基因，可用于PCR檢測(cè)和核酸雜交檢測(cè)。2008年，肖國(guó)生等從豬源5：A型Pm Ts－8株中擴(kuò)增出453bp的psl基因，與禽Pm T16株的psl基因序列只相差2個(gè)堿基，同源性高達(dá)99%，與流感嗜血桿菌編碼P6蛋白的基因序列同源性為83%［3］。

2.2 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 Pm轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白主要包括外膜蛋白H（OMPH）和TolC蛋白。

2.2.1 OMPH蛋白 OMPH是Pm最主要的外膜蛋白之一，屬于孔蛋白，是一種通道形成離子載體，其分子量為32－39ku。不同血清型的 Pm OMPH蛋白具有很高的同源性，其異源性主要源于318－333位上部分氨基酸的變異，而大部分的變異又集中在60－80aa和200－220aa兩個(gè)不連續(xù)的超變區(qū)，這兩部分分別與暴露在外表面的2個(gè)環(huán)形結(jié)構(gòu)相對(duì)應(yīng)。這些結(jié)構(gòu)可能與宿主的免疫系統(tǒng)接觸，并通過(guò)變異來(lái)逃避免疫監(jiān)測(cè)。

Pm OMPH蛋白能誘導(dǎo)動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生高水平的保護(hù)性抗體。Garrido等從A血清群中鑒定了2個(gè)OMPH（OMP1和OMP2），經(jīng)驗(yàn)證這兩個(gè)基因的基因組是連續(xù)的并且可以獨(dú)立轉(zhuǎn)錄的。應(yīng)用fur－OMPH1－OMPH2三重突變株提取的外膜蛋白免疫小鼠，可以保護(hù)全部小鼠免受異源強(qiáng)毒Pm感染。將OMP H全基因的N－末端與硫氧還蛋白（Trx）融合表達(dá)，可以誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生70%的保護(hù)力免受同源菌株的攻擊［4］。郭東春等研究證實(shí)鴨Pm重組OMPH蛋白具有良好的免疫學(xué)活性［5］。孫穎將Pm OMPH基因重組質(zhì)粒載入胸膜肺炎放線桿菌（Actinobacillus pleuropneumoniae，App）菌影，免疫試驗(yàn)表明，App菌影裝載pCDNA－OMP H的疫苗對(duì)豬App和Pm感染的保護(hù)率可達(dá)100%［6］。眾多研究結(jié)果表明，Pm OMPH蛋白具有很好的免疫原性，使得開(kāi)發(fā)Pm外膜蛋白疫苗成為可能。

2.2.2 TolC蛋白 Tolc蛋白是一個(gè)可以排出大分子、小分子、重金屬等“異類”分子的孔道蛋白，是Ⅰ型分泌系統(tǒng)和射流泵的重要成分。TolC蛋白是由3個(gè)獨(dú)立多肽亞基形成的三聚體孔蛋白，可以通過(guò)蛋白質(zhì)構(gòu)象的改變，形成一個(gè)連續(xù)管道將細(xì)菌胞漿和外部環(huán)境瞬間連通，同時(shí)將進(jìn)入胞漿干擾蛋白質(zhì)合成的藥物等“異類”分子排出，使菌體內(nèi)藥物濃度下降，從而介導(dǎo)細(xì)菌耐藥。Hatfaludi等鑒定出兩個(gè)Pm TolC蛋白質(zhì)、Pm0527和Pm1980。蛋白質(zhì)分析顯示，Pm0527和Pm1980與其他藥物外排蛋白同屬于一個(gè)TolC家族，任一基因發(fā)生突變都會(huì)導(dǎo)致Pm對(duì)多種化學(xué)藥物的敏感性增加［7］。

2.3 結(jié)合蛋白 結(jié)合蛋白主要指鐵調(diào)節(jié)外膜蛋白的各個(gè)成員，這類蛋白僅在限鐵條件下表達(dá)。由于宿主體內(nèi)轉(zhuǎn)鐵蛋白、乳鐵蛋白、結(jié)合珠蛋白及血紅蛋白等鐵結(jié)合蛋白的存在，體內(nèi)的游離鐵濃度很低，絕大多數(shù)鐵處于螯合狀態(tài)。因此，細(xì)菌要想感染成功，必須進(jìn)化成一系列的高親合性的攝鐵系統(tǒng)，與宿主競(jìng)爭(zhēng)攝取鐵離子復(fù)合物，從而獲取鐵滿足自身代謝需要。目前已經(jīng)確定出三類鐵攝取系統(tǒng)，他們分別利用鐵載體、轉(zhuǎn)鐵蛋白和血紅蛋白受體，他們的吸收機(jī)制也各有不同。

2.3.1 鐵載體受體 鐵載體受體是由細(xì)菌細(xì)胞分泌的，其功能是從宿主鐵結(jié)合糖蛋白上攝取鐵。鐵－鐵載體復(fù)合物首先和細(xì)菌表面的特異性受體結(jié)合，在TonB系統(tǒng)供能的前提下，鐵被運(yùn)輸?shù)郊?xì)菌細(xì)胞內(nèi)供其利用。Choi－Kim等報(bào)道了3個(gè)分子量分別為76kDa，84kDa和96kDa的鐵調(diào)節(jié)外膜蛋白，這3種蛋白只有Pm培養(yǎng)在無(wú)鐵培養(yǎng)基中或在體內(nèi)生長(zhǎng)時(shí)才會(huì)表達(dá)，火雞康復(fù)血清可以和這三種蛋白發(fā)生反應(yīng)。

2.3.2 轉(zhuǎn)鐵蛋白、乳鐵蛋白受體 鐵吸收的第二種機(jī)制，是通過(guò)菌體表面的鐵結(jié)合蛋白受體與宿主的鐵結(jié)合蛋白直接作用來(lái)攝取鐵。轉(zhuǎn)鐵蛋白和乳鐵蛋白上鐵的清除需要借助于其受體TbpB/TbpA的參與，并需要TonB系統(tǒng)提供能量，TbpB/TbpA是最主要的轉(zhuǎn)鐵蛋白、乳鐵蛋白受體。研究顯示，Pm有一個(gè)獨(dú)特的TbpA受體，不需要第二受體蛋白TbpB的參與就能夠有效的從牛轉(zhuǎn)鐵蛋白中獲得鐵。2005年，Shivachandra等從水牛（B：2）Pm菌株中擴(kuò)增出TbpA基因，測(cè)序顯示，該基因與A：1型Pm TbpA基因具有98%的相似性［8］。Ewers統(tǒng)計(jì)顯示289株豬源和禽源Pm中，均未擴(kuò)增出TbpA基因。只在牛源、羊源和水牛源的（57.1%）Pm菌株中分離到 TbpA 基因［9］。

2.3.3 血紅蛋白受體 目前，已知的Pm血紅蛋白受體有HgbA蛋白、HgbB蛋白、多重血紅蛋白綁定蛋白、HasR蛋白、TonB絡(luò)合物等。HasR蛋白是血色素?cái)z取系統(tǒng)特有的外膜蛋白受體，Prado等從A：3株P(guān)m中鑒定出一個(gè)96kD的HasR蛋白，具有很高的免疫原性［10］。TonB絡(luò)合物包含 TonB、ExbB和ExbD三種蛋白，鐵主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)的動(dòng)力需要TonB絡(luò)合物來(lái)提供。其中TonB蛋白是一種能量傳遞器，負(fù)責(zé)受體在轉(zhuǎn)鐵蛋白附近的定位，從而促進(jìn)鐵或含鐵分子與其相應(yīng)受體的結(jié)合，而ExbB和ExbD負(fù)責(zé)鐵轉(zhuǎn)運(yùn)后TonB蛋白的穩(wěn)定和回收。EbB、EbD和TonB基因的表達(dá)水平受鐵調(diào)控，都是Pm感染的必需基因，任何一個(gè)基因突變或失活都會(huì)導(dǎo)致Pm毒力發(fā)生改變［11］。

2.4 黏附素 細(xì)菌對(duì)宿主細(xì)胞或細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的黏附是細(xì)菌進(jìn)一步在動(dòng)物體內(nèi)生長(zhǎng)繁殖、引起病理變化的前提條件，是致病的第一步。通常介導(dǎo)細(xì)菌黏附作用的黏附素也是潛在的致病因子。很多細(xì)菌可以產(chǎn)生黏附素，如流感嗜血桿菌的Hap、Hia/Hsf、HMW1/2、血凝素及菌毛等，致病性大腸桿菌的外膜蛋白OMPX等。

2.4.1 4型菌毛 4型菌毛是Pm的主要黏附素，它能使細(xì)菌牢固地黏附于皮膚、呼吸道、消化道、泌尿生殖道的黏膜上皮細(xì)胞上。2007年，Siju等克隆到B：2型Pm ptfA基因，測(cè)序結(jié)果顯示，B：2型Pm ptfA基因與液相色譜法獲得的A：1型ptfA菌毛亞單位蛋白編碼核苷酸的相似性為78.4%，而且前200個(gè)核酸序列是完全相同的。利用ptfA重組蛋白兔抗血清，在B：2型、A：1型Pm裂解液中均能檢測(cè)到18kD的蛋白質(zhì)，說(shuō)明這幾種細(xì)菌中均存在4型菌毛［12］。

2.4.2 纖維結(jié)合素受體 纖維結(jié)合素是一種大分子糖蛋白，分子上有許多細(xì)菌結(jié)合位點(diǎn)，很多細(xì)菌都存在纖維結(jié)合素受體，通過(guò)其脂質(zhì)末端與纖維結(jié)合素相結(jié)合，但結(jié)合部位不同。Mullen等通過(guò)對(duì)Pm DNA噬菌體庫(kù)的篩選，獲得分子量為12.7kDa的ComE1蛋白。ComE1是一種公認(rèn)的纖維結(jié)合素受體，重組表達(dá)的ComE1主要以GST融合蛋白的形式與可溶的和固態(tài)的纖維結(jié)合素相結(jié)合。透射電鏡技術(shù)顯示，ComE1位于Pm的細(xì)菌表面，ComE1抗血清可以阻斷多殺性巴氏桿菌與纖維結(jié)合素的結(jié)合［13］。

2.4.3 絲狀血凝素 細(xì)菌的血凝素在細(xì)菌的黏附過(guò)程中起重要作用，如鼠傷寒桿菌的甘露糖抗性血凝素、百日咳桿菌的絲狀血凝素（FHA）等。Tatum等通過(guò)對(duì)Pm70基因組序列進(jìn)行分析，找到2個(gè)絲狀血凝素基因，F(xiàn)haB1和FhaB2，兩基因編碼的蛋白質(zhì)具有45%的序列相似性。將禽A：3型Pm的FhaB2基因突變后，對(duì)火雞進(jìn)行攻毒，其毒力明顯減弱。將FhaB2血凝素N－末端的三個(gè)基因片段聯(lián)合表達(dá)可誘發(fā)火雞產(chǎn)生保護(hù)性免疫反應(yīng)［14］。

2.5 膜相關(guān)酶 Boyce等通過(guò)分析體外培養(yǎng)的Pm外膜成分，獲得Pm磷脂酶Pm1426，其功能是水解細(xì)菌外膜表面的磷脂。重組Pm1426不能誘導(dǎo)雞產(chǎn)生針對(duì)同源細(xì)菌的保護(hù)力［15］。Pm另一具代表性的膜相關(guān)酶是唾液酸苷酶，其主要功能是攝取與糖蛋白、糖脂等相結(jié)合的唾液酸，來(lái)形成自身成分，進(jìn)而逃避宿主免疫系統(tǒng)的識(shí)別。已證實(shí)唾液酸苷酶與致病菌的毒力有關(guān)，尤其是那些主要侵害或棲息于黏膜表面的細(xì)菌。唾液酸苷酶可協(xié)助Pm在宿主黏膜細(xì)胞定植，某些基因的缺失可導(dǎo)致Pm毒力的減弱和侵襲力的降低［16］。

2.6 其他蛋白 除了上述常見(jiàn)的功能蛋白質(zhì)外，多殺性巴氏桿菌外膜蛋白還包括蛋白質(zhì)組裝器、交叉性保護(hù)抗原PlpE蛋白等。PlpE重組蛋白是目前發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)可以刺激機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)不同血清型Pm高水平保護(hù)性免疫反應(yīng)的抗原［17］。

近年來(lái)人們對(duì)Pm外膜蛋白的研究雖然取得了一定進(jìn)展，但對(duì)外膜蛋白詳細(xì)認(rèn)知還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，Pm外膜蛋白的組成、結(jié)構(gòu)和功能是相當(dāng)復(fù)雜的。因此，要詳細(xì)了解多殺性巴氏桿菌外膜蛋白的全部組成，以及每一個(gè)蛋白質(zhì)的具體功能，還需要我們不斷地進(jìn)行努力和探索。

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